Rilevamento di una variante rara trascrizione CDH1 in tessuti di cancro gastrico fresco congelato mediante PCR digitale basata su Chip
Summary
Il manoscritto descrive un chip digitale test PCR per rilevare una variante rara di trascrizione CDH1 (CDH1a) nel normale fresco-congelato e tessuti del tumore ottenuti da pazienti con cancro gastrico.
Abstract
CDH1a, una non-canonica trascrizione del gene CDH1 , è stato trovato per essere espresso in alcune linee cellulari di cancro gastrico (CG), mentre è assente nel mucosa gastrico normale. Recentemente, abbiamo rilevato la variante di trascrizione di CDH1a nei tessuti di fresco-congelato del tumore ottenuti da pazienti con GC. L’approccio PCR (dPCR) digitale basata su chip qui presentata è stata studiata l’espressione di questa variante nei campioni di tessuto. dPCR offre il potenziale per una misurazione accurata, robusto e altamente sensibile degli acidi nucleici ed è sempre più utilizzata per molte applicazioni in diversi campi. dPCR è in grado di rilevare gli obiettivi rari; Inoltre, dPCR offre la possibilità di assoluta e precisa quantificazione degli acidi nucleici senza la necessità di calibratori e curve standard. Infatti, la reazione di partizionamento arricchisce la destinazione dallo sfondo, che migliora l’efficienza di amplificazione e tolleranza agli inibitori. Tali caratteristiche rendono dPCR uno strumento ottimo per la rilevazione della trascrizione rara CDH1a .
Introduction
Il gene CDH1 codifica per E-caderina, un fattore chiave coinvolti nel mantenimento dell’epitelio gastrico normale attraverso il regolamento di adesione, sopravvivenza, proliferazione e migrazione delle cellule1. Perdita della proteina di E-caderina a seguito di germline deleteri o alterazioni somatiche del CDH1 sono state associate con lo sviluppo di GC2,3. Trascritti non canonici derivanti da introne 2 del gene inoltre sono stati supposti per svolgere un ruolo nella carcinogenesi gastrica4,5. In particolare, una tale trascrizione, CDH1a, ha dimostrato di essere espressi in linee cellulari di GC ma è assente dalla stomaco normale4. Abbiamo recentemente rilevato CDH1a nei campioni di tessuto di GC da pazienti di gascromatografia usando basata su chip dPCR5. dPCR è stato utilizzato per valutare, per la prima volta, la presenza della trascrizione del gene CDH1a in GC intestinale e nel tessuto normale.
Il metodo gold standard per determinare l’espressione genica è Real-Time PCR quantitativa (qPCR). Tuttavia, i dati risultanti possono a volte essere variabile e di scarsa qualità, soprattutto quando il livello di destinazione nel campione è basso. Questa variabilità può essere causata da contaminanti, che inibiscono l’attività della polimerasi e primer di ricottura, che conduce a lato competitivo reazioni6e amplificazione aspecifici.
Anche se i principi di base biochimici di dPCR sono simili a quelli di qPCR, dPCR Mostra alcuni vantaggi, consentendo misurazioni molto precise del DNA genomico (gDNA) / complementari molecole di DNA (cDNA). Infatti, dPCR è una reazione di punto finale che si basa sulla compartimentazione calibrato di un campione in migliaia di pozzi, affinché ciascun pozzetto contiene zero o una molecola bersaglio singolo. Amplificazione, quindi, si verifica solo nei pozzetti contenenti una copia del database di destinazione e viene indicato da un segnale fluorescente. Il numero assoluto di molecole bersaglio nel campione originale può quindi essere calcolato determinando il rapporto di positivo per partizioni totali utilizzando binomiale Poisson statistiche7.
Inoltre, la tecnica di dPCR Elimina la necessità per l’esecuzione di una curva standard e, quindi, il bias associato e variabilità, che consente una quantificazione diretta di obiettivi8,9; produce risultati più precisi e riproducibili indipendentemente da contaminanti ed efficienza grazie alla sua elevata tolleranza a inibitori10; esso è più sensibile e specifico rispetto qPCR e così è un metodo affidabile per la rilevazione di un obiettivo raro. Infine, la suddivisione del campione in reazioni multiple riduce la concorrenza con molecole di fondo e migliora il limite di individuazione del bersaglio, rendendo possibile l’amplificazione e facilitando la rilevazione di singole molecole di gDNA/cDNA6 . La rilevazione e la quantificazione degli acidi nucleici da dPCR basata su chip è stato sempre più applicato per copiare numero variazione, frammenti di quantificazione del DNA e mutazione analizza11,12,13, dato il precisione e basso materiale requisito del metodo di input. Inoltre, dPCR recentemente è stato integrato nell’analisi di entrambi i microRNA14 e gene trascrizioni5,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
dPCR è stato originariamente sviluppato per DNA molecolare misure10,11,12,13 e nel tempo che questa tecnologia è stata adattata per la quantificazione dei microRNA e RNA trascrizioni5, 14,15. In questo protocollo abbiamo esteso l’elenco delle applicazioni per includere il rilevamento delle rare tras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Gráinne Tierney per assistenza editoriale.
Materials
| TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
References
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