Summary
El manuscrito describe un ensayo PCR digital basado en el chip para detectar una variante rara de transcripción CDH1 (CDH1a) en congelado normal y los tejidos del tumor obtenidos de pacientes con cáncer gástrico.
Abstract
CDH1a, una no-canónico transcripción del gen CDH1 , se ha encontrado para ser expresado en algunas líneas celulares de cáncer gástrico (CG), mientras que está ausente en la mucosa gástrica normal. Recientemente, se detectó CDH1a variante de transcripción en los tejidos del tumor congelado obtenidos de pacientes con GC. La expresión de esta variante en muestras de tejido fueron investigada por el chip digital PCR (dPCR) enfoque presentado aquí. dPCR ofrece el potencial para una medición precisa, robusta y altamente sensible de los ácidos nucleicos y cada vez más se utiliza para muchas aplicaciones en diferentes campos. dPCR es capaz de detectar blancos raros; Además, dPCR ofrece la posibilidad de cuantificación absoluta y precisa de los ácidos nucleicos sin necesidad de calibradores y curvas estándar. De hecho, el repartir de reacción enriquece el objetivo del fondo, que mejora la eficiencia de amplificación y tolerancia a los inhibidores. Tales características hacen dPCR una herramienta óptima para la detección de la transcripción rara CDH1a .
Introduction
El gen CDH1 codifica para E-cadherina, un factor clave en el mantenimiento del epitelio gástrico normal a través de la regulación de la adherencia, la supervivencia, proliferación y migración de células1. Pérdida de la proteína cadherina-como resultado del germline deletéreo o alteraciones somáticas de CDH1 se han asociado con el desarrollo del GC2,3. Otras transcripciones resultantes del intrón 2 del gen también han presumido para desempeñar un papel en la carcinogénesis gástrica4,5. En particular, un tal transcripción, CDH1a, se ha demostrado para ser expresados en líneas celulares de GC pero está ausente de los de estómago normal4. Recientemente detectamos CDH1a en muestras de tejido de GC de GC pacientes utilizando dPCR basada en chip5. dPCR fue utilizado para evaluar, por primera vez, la presencia de la transcripción del gene CDH1a GC intestinal y el tejido normal.
El método estándar de oro para determinar la expresión génica es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Sin embargo, los datos resultantes a veces pueden ser variable y de mala calidad, especialmente cuando el nivel de objetivo en la muestra es bajo. Esta variabilidad puede ser causada por contaminantes, los cuales inhiben la actividad de polimerasa y el recocido de la cartilla, conduciendo a la amplificación inespecífica y de reacciones del lado competitivo6.
Aunque los principios bioquímicos básicos de dPCR son similares a los de la qPCR, dPCR muestra algunas ventajas, lo que permite mediciones muy precisas de DNA genómico (gDNA) / complementarios las moléculas de ADN (cDNA). De hecho, dPCR es una reacción de punto final que se basa en repartir calibrado de una muestra en miles de pozos, para que cada uno también contiene cero o molécula de un solo objetivo. Amplificación se produce sólo en los pozos que contienen una copia del blanco y se indica mediante una señal fluorescente. Entonces, el número absoluto de moléculas Diana en la muestra original puede calcularse determinando la proporción de positivos a particiones total con binomial Poisson estadísticas7.
Además, la técnica de dPCR elimina la necesidad para el funcionamiento de una curva estándar y, por tanto, el sesgo asociado y variabilidad, lo que permite una cuantificación directa de objetivos8,9; produce resultados más precisos y reproducibles independientemente de contaminantes y eficiencia debido a su alta tolerancia a los inhibidores de la10; es más sensible y específica que la qPCR y por lo tanto es un método fiable para la detección de un blanco raro. Por último, el repartir de la muestra en reacciones múltiples reduce la competencia con las moléculas de fondo y mejora el límite de detección de blancos, permitiendo la amplificación y facilitar la detección de las moléculas individuales del gDNA/cDNA6 . La detección y cuantificación de ácidos nucleicos por dPCR basada en chip se ha aplicado cada vez más para copiar la variación en el número, fragmentos de cuantificación del ADN y mutación analiza11,12,13, dado el precisión y el material de baja entrada de requisito del método. Además, dPCR recientemente se ha integrado en el análisis de ambos microRNAs14 y gene transcripción5,15.
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Protocol
El protocolo sigue las pautas del Comité de ética de investigación humana de primera.
Nota: Este procedimiento está diseñado específicamente para la detección de un bajo número de moléculas de cDNA en tejidos humanos, congelado. Las secciones de tejido se han reducido en hielo seco, mientras que siguen congeladas, de tumor gástrico paciente derivado previamente validado o muestras de tejido normal.
1. purificación y aislamiento de ARN
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Extracción de RNA
Nota: El aislamiento de RNA se lleva a cabo bajo la campana con un producto específico (véase Tabla de materiales). Sin embargo, una variedad de kits de aislamiento están comercialmente disponibles.- Homogeneizar 50-100 mg finamente cortadas congeladas en fresco de muestra de tejido en un tubo de 1,5 mL con 1 mL del reactivo de aislamiento de RNA y vortex vigorosamente durante 15 s. incubar los tubos a-80 ° C durante la noche.
- Incubar el tubo que contiene la muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos y mezclar con un vórtex durante 15 s.
- Mantenga el tubo en hielo, añada 200 μL de cloroformo y agitar vigorosamente durante 15 s.
- Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 60 s y centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir la fase acuosa en un tubo de 1,5 mL y agregar 20 μg de glucógeno.
Nota: Es importante evitar cuidadosamente transferir cualquier de la interfase o capa orgánica con el fin de reducir la contaminación. - Añadir 500 μl de isopropanol, invertir el tubo para mezclar e incubar en hielo durante 10 minutos.
- Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C para precipitar el RNA.
Nota: RNA estará presente en un pellet de gel-como en el lado y la parte inferior del tubo, a menudo invisible después de la centrifugación. - Quite el sobrenadante sin molestar el precipitado y lave con 1 mL de etanol al 75% mediante pipeteo.
- Centrifugar el tubo a 7.500 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante sin perturbar el pellet.
- Que el sedimento seco hasta que el precipitado se vuelve transparente y disolver en 50 μl de agua libre de ARNasa.
- Congelar las muestras a-80 ° C al menos durante la noche antes de la cuantificación.
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Eliminación de ADN genómico y purificación de RNA
Nota: Un paso de digestión ADNsa, seguido por una purificación de RNA base de columna, se recomienda para el análisis de los objetivos de baja abundancia para digerir DNA contaminante.- Disolver el liofilizado DNasa I (1.500 unidades de Kunitz) en 550 μl de ARNasa-libre del agua utilizando una jeringa, mezclar suavemente por inversión del frasco y dividir la solución reconstituida en alícuotas.
- El volumen calculado de la muestra con 15 μg de RNA de transferencia en un tubo de 1.5 mL, 10 μl de la digestión de la ADNsa buffer del kit (enumeradas en Tabla de materiales), 2.5 μl de DNasa de solución madre y libre de Rnasa de agua a 100 μl. incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Añadir 350 μl de tampón de lisis del tejido (del kit, consulte la Tabla de materiales) y mezclar mediante pipeteo.
- Añadir 250 μl de etanol al 100% y mezclar mediante pipeteo.
- Transferir todo el volumen (700 μL) en una nueva columna de spin y centrifugar a 12.000 x g durante 15 s.
- Transferir el filtro a un tubo nuevo de colección, Añadir 500 μl de etanol al 80% a la columna y centrifugar a 12.000 x g durante 2 minutos.
- Abra la tapa de la columna de spin y centrifugar a 12.000 x g durante 5 min con un tubo de colección nuevo para secar el filtro; luego transferir el filtro a un tubo de 1,5 mL.
- Agregue 14 μl de agua libre de ARNasa directamente en la columna de filtro y centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto.
- Mantener las muestras en hielo y proceder a la cuantificación con 2 μl de la muestra en un espectrofotómetro de mesa o guardar el ARN a-80 ° C hasta su uso.
2. síntesis de cDNA
- Lugar 1.000 ng de RNA, 4 μL de la mezcla principal, 1 μl de transcriptasa reversa y agua libre de ARNasa a un volumen final de 20 μl en un tubo estéril de la polimerización en cadena. Mezclar suavemente y desactivación.
- Incubar la mezcla de reacción en el termociclador, aplicando las siguientes condiciones: 5 min a 25 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 minutos a 85 ° C.
- Centrifugar los tubos brevemente y proceder al análisis de dPCR o almacenar a-20 ° C hasta que se necesite.
3. configurar la reacción de PCR digital
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reacción de dPCR mezcla y preparación de muestras
- Descongelar la mezcla principal y el ensayo a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos.
- Diluir las muestras de cDNA para una concentración de 300 ng de 6 μl de agua.
- Suavemente vortex el amo mezclar y preparar la mezcla en un tubo estéril con 8.7 μl de la mezcla principal, 0.87 μl del primer ensayo de diseño personalizado CDH1a y 1.83 μl de agua libre de nucleasa para un volumen final de 11.4 μL.
Nota: Para CDH1a ensayo diseñado personalizado primer detalles ver la Tabla de materiales. - Transferir 11,4 μL de la mezcla preparada a la muestra de cDNA diluido, mezclar suavemente y centrifugar brevemente.
Nota: Volúmenes incluyen exceso de 20% para compensar la pérdida de volumen de pipeteo. Preparar la mezcla de todas las muestras y no control de la plantilla (NTC).
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Preparación de la viruta
Nota: Para obtener resultados óptimos de carga las fichas tan pronto como sea posible.- Enchufe el cargador chip y esperar hasta que el indicador luminoso se pone verde.
- Retire la tapa de la jeringa de líquido de inmersión tirando suavemente hacia atrás el émbolo 1-2 mm y para facilitar este paso y reemplazarlo con una punta de lanza.
- Un nuevo chip y tomar nota del código escrito en la tapa para asociar a la muestra.
- Coloque la tapa con cuidado por su lado, retire la película protectora y coloque la tapa con la cara pegajosa hacia arriba en la orientación correcta.
- Cuidadosamente levante un chip, teniendo cuidado de no para tocar la parte interna y cargarlo en el nido de chip en la posición correcta, presionando hacia abajo la palanca para abrir la abrazadera.
- Cargar una nueva hoja de carga en el cargador y empújelo suavemente para asegurarse de que esté firmemente en su lugar.
- Transferencia de 14,5 μl de la mezcla de reacción de dPCR sobre la cuchilla de carga sin hacer burbujas de aire o desviar la hoja, después de que prensa el negro carga botón para distribuir el volumen en el chip.
- Utilizar la jeringa de líquido de inmersión para transferir unos 20 gotas sobre la superficie del chip teniendo cuidado de no para tocar la superficie con la punta.
Nota: Es importante cubrir toda la superficie sin derramar líquido sobre los bordes. - Gire el brazo de la cargadora para hacer la tapa entra en contacto con el chip y presione hacia abajo para 15 s.
- Presione el botón para liberar el chip y volver el brazo a su posición.
- Sostenga el chip montado en un ángulo de 45° con cuidado prescindir la jeringa a través del puerto de llenado de líquido de inmersión, gire el chip un poco para asegurarse de que no hay burbujas de aire y retire cualquier exceso de líquido con un paño estéril.
- Sellar la caja de la viruta de peeling suavemente lejos la etiqueta encima de la tapa de la viruta y la prensa sobre el puerto de llenado para por lo menos 5 s.
- Guardar el chip en la oscuridad hasta que esté listo para cargar en el termociclador.
Nota: Puede usarse chips preparados dentro de 2 h.
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reacción de dPCR
- Abra la tapa e instale a los adaptadores para ambos bloques, incluso cuando se utiliza un solo bloque.
- Coloque las fichas en el bloque de muestra en la posición correcta.
Nota: El orificio de llenado debe estar orientado hacia la parte delantera del termociclador en una posición elevada para permitir que cualquier burbuja de aire para flotar en la parte superior sin molestar a la ventana de la viruta. Utilizar fichas vacías para equilibrar los dos bloques. - Coloque la almohadilla térmica sobre el bloque de muestras para cubrir completamente las virutas.
- Cierre la tapa y comenzar la PCR ejecutar, aplicando las siguientes condiciones: mantener a 96 ° C por 10 min; 45 ciclos de 60 ° C por 2 min y a 98 ° C por 30 s; mantener a 60 ° C por 2 min; mantener a 4 ° C. Apague el termociclador y descongelar los chips a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos.
Nota: Análisis de la viruta deben realizarse dentro de una hora.
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Análisis de la viruta
- Abra la tapa del instrumento y quite las almohadillas térmicas, luego retire las virutas de los adaptadores.
Nota: Almacenar las virutas en un lugar oscuro y limpio hasta su análisis. - Limpie la superficie del chip con isopropanol y un paño estéril.
Nota: Inspeccione cada chip para fugas o posibles problemas. - Inserte el USB en el sistema detector para guardar los datos.
- Abrir la bandeja del chip del sistema detector, cargar el chip boca arriba en la posición correcta y cierre la bandeja.
- Esperar 30 s para el procesamiento, quite el chip e Inserte el siguiente.
- Espere a que el análisis ser completado para todos los chips de procesado y luego inserte el USB en un ordenador para transferir los archivos.
Nota: El tiempo total de análisis es alrededor de 2 a 3 min y virutas.
- Abra la tapa del instrumento y quite las almohadillas térmicas, luego retire las virutas de los adaptadores.
4. interpretación y análisis de datos
- Conecte a la plataforma de software en la nube necesaria para llevar a cabo todos los análisis posteriores.
- Crear un proyecto e importar todos los archivos de datos de las fichas de interés.
- Introduzca el nombre de la muestra; seleccionar el tinte y análisis utilizados en la pestaña de "Chips de definir".
- Determinar si el chip es aceptable, visualizar en la pestaña de "Datos del informe", revisando minuciosamente cómo la muestra fue cargada en el chip y cuántos puntos son evaluables.
Nota: Rechazan chips con menos de 13.000 puntos de datos evaluables. - Pasemos a la trama de la dispersión de la viruta seleccionada a la derecha de la pantalla; un umbral de 6.000 para las señales de tinte fluoresceína amidite (FAM) reportero (eje y) se aplica a todas las fichas.
Nota: El umbral puede variar sobre la base de los ensayos utilizados. - Quite cualquier dudosas señales positivas para evitar resultados falsos positivos, seleccionando el lugar relativo de la dispersión solar usando la herramienta lazo y pulsando en "indeterminado". Todos los restantes puntos positivos indican la presencia de copias cDNA del raro objetivo analizado.
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Representative Results
Utilizando el procedimiento presentado aquí, se revisaron para la expresión de la variante rara transcripción CDH1a en tejidos gástricos congelado. El análisis de dPCR fue realizado en muestras de tejido de normal y cáncer 21-emparejados y en 11 muestras de tumor adicionales. CDH1a era perceptible en los tumores de 15 clientes de los 32 (47%), mientras que no hay muestras de tejido normal demostraron la presencia de esta rara transcripción5. En nuestro análisis, fichas con menos de 13.000 puntos de datos fueron rechazados, como chips con carga no homogéneas. Figura 1 muestra un chip para ve los valorables (figura 1A) y no valorables (figura 1B, C) muestras. En el caso de este último, el chip debe ser desechado debido a la presencia de múltiples burbujas (figura 1B), una sola gran burbuja (figura 1), o como resultado de un número suficiente de puntos de datos por encima del umbral (figura 1B). Estas muestras se deben ejecutar otra vez para obtener resultados interpretables. Con respecto a la trama de la dispersión proporcionada por el software (figura 2), normalmente representa las señales de la tintura de reportero de FAM (eje y) contra las señales de la tintura de reportero de VIC (propietario del fabricante) (eje x). Los puntos de datos presentados en el diagrama de dispersión están codificados por colores, y aquí, sólo visualizamos las FAM reportero tinte señales en azul (figura 2A), indicando que los pozos en que se amplió el objetivo. Estas señales se encuentran más cerca al eje y y más lejos el origen de la trama. El segundo color en la parcela es de color amarillo y es indicativo de los pozos en que se produjo sin amplificación. Un umbral fiable de las señales positivas fue establecido y aplicado a todas las fichas para evitar el sesgo de la llamada. Aquí, el umbral seleccionado era 6.000 basado en la gama de señales observadas para los diferentes chips en estos experimentos. CDH1a copias de cDNA (señal azul) fueron encontrados en un número de muestras tumorales, mostrando una clara diferencia en la amplitud de señales negativas (figura 2A). Por el contrario, ninguna señal por encima del umbral seleccionado fueron encontrada en las muestras negativa para CDH1a transcripción, es decir, todas las muestras de tejido normal y algunas muestras de tumor (figura 2B). Del mismo modo, no hay señales positivas fueron detectadas en el Consejo Nacional de transición en la que se añade agua en lugar de cDNA, por lo tanto servir como un control negativo de la reacción de dPCR (figura 2).
Un análisis fino de la viruta se debe aplicar al filtro de la baja calidad los puntos de datos y eliminar el riesgo de resultados ambiguos. Esto se hizo mediante la visualización de la viruta para determinar la ubicación exacta de la señal positiva: Si la señal azul se encuentra en las fronteras muy de viruta (Figura 3A) o alrededor de las burbujas (figura 1B), la señal es desestimada a partir del análisis . Para evitar aún más el riesgo de falsos positivos, las señales por encima de 6.000 para el canal de FAM y de la extrema derecha de la parcela se consideraron como probablemente específico y así se filtraron hacia fuera, a pesar de fueron localizados dentro de la viruta (figura 3B). De esta manera, una muestra se considera positiva para la expresión de la transcripción rara, CDH1a, aunque demuestra una señal de amplificación individuales, como señal de cumple con las condiciones mencionadas.
Figura 1 . Fichas evaluables y no evaluables representante. Los puntos azules son los pozos en los que se amplificó la transcripción de CDH1a ; los puntos amarillos son los pozos en los que no hay amplificación producido; los puntos blancos son los pozos vacíos. Puntos de datos por encima del umbral se indican debajo de cada chip. (A) un chip evaluable con azul las señales localizadas dentro de las fronteras de la viruta. (B) un chip no evaluable con menos de 13.000 puntos de datos por encima del umbral. (C) A chip no evaluable con una burbuja de grande dimensiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Parcelas representativas digital dispersión PCR CDH1a expresión. Parcelas representan señales del tinte de reportero de FAM (eje y) contra las señales de la tintura de reportero de VIC (eje x). Los puntos azules son señales de expresión positiva de CDH1a , mientras que los puntos amarillos son las señales de "No hay amplificación". (A) CDH1a-muestra positiva. (B) CDH1a-muestras negativas. (C) no hay control de plantilla (NTC) mostrando cero expresión CDH1a . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Parcelas representativas análisis de viruta fina de dispersión PCR digital. La izquierda es la vista de la viruta con las señales de interés ampliada en un negro cuadrado, mientras que a la derecha es el correspondiente diagrama de dispersión. (A) una señal azul localizada en la fracción correcta de la parcela pero en la frontera de la viruta. (B) tres señales azul resaltadas en gris localizado en el extremo derecho de la parcela pero en el chip. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
dPCR fue desarrollado originalmente para el ADN molecular medidas10,11,12,13 y en el tiempo que esta tecnología fue adaptada para la cuantificación de microRNAs y RNA transcripciones5, 14,15. En este protocolo hemos ampliado la lista de aplicaciones que incluyen la detección de las transcripciones raras derivada de las muestras de tejido fresco congelado. Para ello se utilizó una cantidad bastante alta de cDNA (300 ng). Aunque esta cantidad no es lo máximo que se puede utilizar en dPCR, era suficiente para establecer condiciones estandarizadas comparar nuestras muestras. Ajuste del umbral de la señal de floración en 6.000 y ocupándose de la ubicación de señales de amplificación positiva en el chip y la dispersión de la trama, se detectaron con éxito este objetivo rara en muestras de tejido del tumor gástrico.
Por dPCR, nosotros no podríamos cuantificar absolutamente CDH1a, debido a una muy baja cantidad de la meta, pero confiablemente podríamos evaluar la presencia/ausencia de esta transcripción rara. De hecho, la naturaleza cuantitativa de esta técnica está limitada por el número inicial de objetivos presentes en las muestras analizadas7. De relevancia, la técnica sí mismo queda bastante costoso y tiempo intensivo. Así, cuando el análisis de numerosas muestras o de varios objetivos es necesario, técnicas alternativas deben considerarse7,8.
Dicho esto, dPCR sin duda proporciona la última plataforma para sensible medición y cuantificación de ácidos nucleicos, ya que mejora la precisión y reproducibilidad respecto de qPCR7,8. Por otra parte, podría considerarse como el único método disponible para el análisis de expresión génica de los ácidos nucleicos bajo abundante que cerca del límite de sensibilidad de qPCR6.
El protocolo aquí descrito se puede adaptar a RNAs de cualquier tejido, lo que permite la detección de objetivos raros, como en nuestro estudio. Además, el ensayo podría extenderse a la cuantificación absoluta de las transcripciones. En tales casos, el número de copias/μl registrados por el instrumento en una muestra dada debe multiplicado por el volumen de reacción cargados simplemente y dividido por la cantidad inicial de cDNA. Para superar la variabilidad producida por la reverso-transcripción, calibradores de gene específico debe incluidas, cuando sea posible6. Mirando al futuro, dPCR tiene considerable potencial en convertirse en la plataforma estándar de oro, no sólo para la detección de la secuencia rara, pero también detección de mutación rara y copia exacta de cuantificación número7. Esto es especialmente relevante en mosaicismo genético, así como en la investigación del cáncer donde heterogeneidad del tumor puede afectar el resultado clínico del paciente y respuesta al tratamiento.
Desde el punto de vista práctico, al configurar el protocolo de dPCR hay varios pasos fundamentales que deben ser resaltados. En primer lugar, la mezcla de reacción que contiene la cantidad apropiada de cDNA basado en el nivel de expresión de lo esperado, debe ser transferida con gran cuidado en la hoja de carga para no crear burbujas de aire, que podrían interferir con la homogeneidad de la muestra. Además, la hoja se debe primero colocarse apropiadamente; de lo contrario podría resultar en una distribución desigual de la muestra. Además, siempre se debe realizar suficiente capa con inmersión fluido y preciso cierre de la tapa. En cuanto a chip de procesamiento y análisis, es importante ser consciente de la posibilidad de acumulación de condensación en el chip; en tal escenario, la viruta debe volver a limpiar con isopropanol y volver a analizar. Por otra parte, como dPCR se basa en las estadísticas de Poisson, un número mínimo de datos evaluables puntos (> 10.000) debe estar presente en el chip, de lo contrario la muestra debería ejecutarse otra vez. Finalmente, para los experimentos de detección de copia baja objetivo, un factor de confusión importante podría ser la relación señal a ruido, pero un posicionamiento confiable umbral puede ayudar en la identificación de señales reales positivas.
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Disclosures
Los autores no divulgan conflictos de interés para este trabajo.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Gráinne Tierney por asistencia editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
References
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