El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.
CDH1a, CDH1 gene, kanonik olmayan bir transkript bulundu bazı mide kanseri (GC) hücre hatlarında ifade edilecek yok ise normal mide mukozasında. Son zamanlarda, GC ile hastalardan elde edilen taze donmuş tümör dokularda CDH1a transkript varyantı tespit ettik. Bu varyant doku örneklerinde ifade burada sunulan çip tabanlı dijital PCR (dPCR) yaklaşım tarafından araştırılmıştır. dPCR Nükleik asitlerin doğru güçlü ve son derece hassas bir ölçüm için potansiyel sunmaktadır ve giderek farklı alanlardan birçok uygulama için kullanılmaktadır. dPCR nadir hedefleri tespit yeteneğine sahiptir; Buna ek olarak, dPCR Nükleik asitlerin KALİBRATÖRLER ve standart Eğriler için gerek kalmadan mutlak ve kesin miktar için imkanı sunuyor. Aslında, reaksiyon bölümleme amplifikasyon ve toleransı inhibitörleri ile artırır arka plan hedef zenginleştiriyor. Bu tür özellikleri dPCR CDH1a nadir transkript tespiti için optimum bir takım olun.
CDH1 gen E-cadherin, önemli bir faktör normal Gastrik epitel hücre adezyon, hayatta kalma, yayılmasını önleme ve geçiş1düzenlenmesi aracılığıyla bakım dahil için kodlar. Zararlı germline sonucunda E-cadherin protein kaybı veya somatik değişikliklere CDH1 GC2,3gelişimi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Sigara-kurallı transkript intron 2 gen / doğan da mide karsinojenezis4,5‘ te bir rol olan. Özellikle, bir tür transkript, CDH1a, GC hücre hatlarında ifade edilecek göstermiştir ama yok normal mide4. Son zamanlarda CDH1a GC doku örneklerinde dPCR çip tabanlı5kullanarak GC hastalardan tespit ettik. dPCR değerlendirmek, ilk kez, CDH1a gen transkript bağırsak GC ve normal doku varlığı için kullanıldı.
Gen ifadesinin belirlemek için altın standart yöntem gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) dir. Ancak, sonuçta elde edilen veriler bazen değişken olabilir ve kalitesiz, özellikle ne zaman hedef örnek düzeyi düşüktür. Bu değişkenlik polimeraz etkinlik ve astar tavlama, non-spesifik amplifikasyon ve rekabetçi yan reaksiyonlar6yol inhibe kirletici neden olabilir.
DPCR Temel biyokimyasal prensipleri qPCR benzer olmakla birlikte, dPCR genomik DNA (gDNA) çok hassas ölçümler için izin bazı avantajları gösterir / Tamamlayıcı DNA (cDNA) molekülleri. Gerçekten de, dPCR böylece her de sıfır veya bir tek hedef molekül içerir, kalibre edilmiş bir örnek wells, binlerce içine bölümleme üzerinde dayanan bir son nokta reaksiyondur. Amplifikasyon sonra yalnızca bir kopyasını hedef içeren kuyu içinde oluşur ve floresan bir sinyal ile belirtilir. Orijinal örnek hedef molekülleri kesin sayısı sonra binom Poisson istatistikleri7kullanarak toplam bölümler için olumlu oranını belirleyerek hesaplanabilir.
Buna ek olarak, dPCR teknik standart bir eğri çalıştırmak için gereksinimini ortadan kaldırır ve bu nedenle, ilişkili önyargı ve değişkenliği, hedefleri8,9; doğrudan bir miktar için izin kirletici ve verimliliği inhibitörleri10onun yüksek tolerans nedeniyle bağımsız olarak daha hassas ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir; daha hassas ve qPCR daha belirli ve böylece nadir bir hedef tespiti için güvenilir bir yöntemdir. Son olarak, arka plan molekülleri ile rekabet azaltır örnek birden çok tepkiler bölümleme ve hedef tespit, amplifikasyon mümkün verme ve gDNA/cDNA6 tek molekülleri algılama kolaylaştırmak sınırı artırır . Algılama ve miktar Nükleik asitlerin çip tabanlı dPCR tarafından giderek uygulanmış sayı varyasyon kopyalamak için miktar DNA parçaları ve mutasyon analizleri verilen11,12,13, hassas ve düşük malzeme gereksinimi yönteminin girdi. Buna ek olarak, dPCR son zamanlarda her iki mikroRNA’lar14 ve gen transkript5,15analiz entegre edilmiştir.
dPCR Aslında DNA moleküler ölçümleri10,11,12,13 ve miktar mikroRNA ve RNA transkript5için bu teknoloji uyarlanmıştır zamanında geliştirildi, 14,15. Bu protokol için taze donmuş Doku örneklerinden elde edilen nadir transkript tespiti dahil etmek için uygulamaların listesini genişletmi?…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Gráinne Tierney Editör Yardım için teşekkür etmek istiyorum.
TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |