在这里, 我们提出了一个控制生产蛋白质纳米微晶的协议。该过程使用一个自动化设备, 允许控制操作的几个结晶参数。蛋白质结晶是通过控制和自动添加结晶溶液进行的, 同时监测和研究结晶液中颗粒的半径分布。
该自动结晶装置是一项专利技术1特别开发的监测蛋白质结晶实验, 目的是精确地调整成核和晶体生长达到预期大小的蛋白质晶体。控制结晶是基于原位动态光散射样本调查, 而水滴的所有视觉变化都是通过与 CCD 相机耦合的显微镜进行在线监测的, 从而使整个结晶过程中蛋白质滴的研究。在整个实验中使用原位dl 测量, 可以精确地确定过渡到新阶段的高饱和蛋白质溶液–晶体细胞核的形成。通过确定蛋白质的成核阶段, 可以从大蛋白晶体中优化结晶到蛋白质纳米微晶的生产。实验协议显示了一种基于精确自动化步骤的交互式结晶方法, 如沉淀加、诱导高过饱和的水蒸发和减缓诱导的均质成核的样品稀释和反转相位转换。
近年来, 蛋白质微晶和纳米晶体的生长引起了蛋白质结晶学群落的关注, 特别是连续飞秒晶体学 (SFX) 的不断发展。由于新的 X 射线辐射源的辉煌, 并根据迄今取得的成功成果, 蛋白质微晶和纳米晶体的生产已成为高度相关性, 对制备这种晶体悬浮液提出了很高的要求。2,3. 由于在自由电子激光器 (XFELs) 上收集数据所需的晶体尺寸小, 而且实验 beamtime 的可用性有限, 因此在数据收集之前进行样本描述是必不可少的。最常见的技术, 以表征蛋白质微或纳米晶悬浮直到现在的电子显微镜和 X 射线粉末衍射。
到目前为止, 一些方法已经适应了从普通的结晶方法, 目的是生产大量的蛋白质晶体与尺寸的小千分尺范围。该批处理方法用于快速混合高浓缩蛋白和沉淀溶液, 从而迫使样品溶液到高度过饱和的阶段, 其中纳米可能偏爱4。其他方法包括粉碎大的蛋白质晶体形成一个水晶浆, 这可以作为纳米晶悬浮用于数据收集5。然而, 结果有时可能导致衍射质量下降, 因为退化的晶体有较低的内部秩序。基于自由界面扩散的纳米也是一个可用的替代品, 蛋白质溶液被添加到一个高度集中的沉淀溶液3中。然而, 在所有的技术中, 最有效的方法似乎是间歇结晶和更创新的操纵技术, 采用气-扩散方法在静坐下降6。
一般而言, 对于蛋白质的结晶, 必须越过能量屏障来支撑成核–晶体形成的第一个热力学步骤。为了将蛋白质溶液从热力学上稳定态转移到过饱和, 最后诱导相变, 需要对与蛋白质溶液相关的一些变量进行修正。这些变量通常是蛋白质溶液的浓度, 环境变化 (例如,温度, 湿度), 溶剂特性 (如pH 值, 离子强度), 浓度和缓冲性能等.7 ,8可更改的样本参数的概览通常用相图表示, 允许不同的呈现方式, 如溶解度图、成核相图, 甚至更详细描述三维或更复杂的图表可以考虑8,9,10。最吸引人的相图类型通常是二维的, 其中主变量是蛋白质浓度作为另一个参数的函数, 而其余参数保持恒定6,11。一旦形成一个或几个原子核, 较大的晶体就可以通过从大体积溶液中摄入额外的蛋白质来生长。当针对微晶和纳米晶体的生产, 这种传统的结晶方法是不可行的, 由于少数的晶体存在于溶液中。纳米晶悬浮物通常必须丰富的晶体实体, 因此结晶途径必须重新调整, 这样, 有一个最大的核事件在样品中存在。因此, 这需要调查一些新的, 直到现在尚未开发的蛋白质的核途径, 这还没有完全理解12,13。根据前面提到的相图基本原理, 经典理论已经扩展到一个新的假设, 即成核被描述为两步机制: 首先, 向更高蛋白质浓度的过渡发生 (致密液体阶段) 和第二, 从稠密的阶段过渡到一个更高的内部顺序 (水晶原子核与格子建筑学)14,15,16。蛋白质结晶对许多因素都很敏感, 因此当结晶配方被重新调整以产生不同大小的晶体时, 食谱就不能总是依赖以前的知识。需要为每个单独的蛋白质目标建立新的洞察力: 缓冲成分的调节, 样品的纯度和稳定性, 蛋白质溶解度的精确知识等。
动态光散射今天是一个成熟的方法来分析和优化蛋白质结晶过程, 由于广泛的颗粒范围, 可以调查: 从单体蛋白纳米晶和小纳米微晶。该方法利用溶液中的粒子进行布朗运动, 并且该运动的平均速度由粒子大小、热能和介质的粘度和粒子的几何形状决定。首先, 液体介质由相干光源照明, 使用激光。粒子散射的光形成了干涉模式。由于粒子处于永久性运动中, 干扰模式也会永久改变。当在某一方向寻找时, 强度波动可以被观察到。这些波动现在显示了由布朗运动引起的粒子运动。从实测的强度波动计算出自相关函数 (ACF)。对 ACF 的分析将给出粒子的速度分布 (更精确的扩散系数), 并利用斯托克斯-爱因斯坦方程, 转化为粒子半径分布17。与 dl 功能和工作原理相关的其他信息可在各种出版物和书籍18,19中找到。
在这里, 我们应用和描述一个独特的自动结晶装置, XtalController900, 升级版本的 XtalController 技术6, 精确地开发用于监测交互式蛋白质结晶实验。该技术为核事件的实时识别和跟踪提供了很高的潜力, 允许通过结晶相图进行精确的机动。这种特殊的结晶过程的目的是优化蛋白质结晶, 以获得高质量的蛋白质微晶和纳米晶, 适用于使用微聚焦同步辐射 x 射线源, 电子衍射, 或SFX.
该结晶装置设计用于监测和操作的关键参数在结晶实验的基础上, 改进的气-扩散方法。这项技术允许监测和评分在所有阶段的蛋白质结晶实验, 使用户有精确的知识和控制的蛋白质溶液在整个结晶相图, 基于原位dl 分析样品悬浮。
该结晶器包括与 CCD 摄像机连接的实验室 (图 1), 它允许对结晶液滴进行实时监测。该相机适用于配备不同放大透镜的显微镜, 提供了大约2.5 µm 的最大空间分辨率。实验室的核心是一个超灵敏天平, 用于跟踪样本重量随时间推移的演化。结晶过程对应于一个静坐滴蒸气扩散实验, 蛋白质下落放置在渗盖玻片上, 放置在天平上。根据液滴的重量变化, 这是由沉淀添加, 水/添加剂添加, 或样品蒸发, 天平给出了一个精确的输入算法立即计算蛋白质和沉淀浓度随着时间的推移.此外, 还对温度和相对湿度等重要结晶参数进行了精确的监测和控制。
为了进行结晶实验, 该装置配备两个微剂量系统 (无接触压电泵), 工作在一个 picoliter 的规模沉淀和水添加。通过使用这种少量的物质, 在蛋白质滴内的浓度梯度和对流现象被最小化。压电泵的主要作用是增加沉淀或水, 后者例如被作为补偿为蛋白质滴的自然蒸发。微剂量系统有一组特征, 可以决定添加某种物质。这些特性包括: 添加物质的重复率、每秒添加的水滴数、物质流轨迹的宽度和高度等。此外, 泵的位置可以手动调整, 使用户有一个精确的位置添加物质到蛋白质滴。
通过原位dl 数据实现了结晶降的独特反馈控制操作, 可以在整个实验过程中显示蛋白质寡聚状态的可能变化。该技术允许不断地评估粒度分布随着时间的推移, 从而揭示未知的蛋白质相关机制。dl 光学设备在战略上被放置在盖玻片区域之下, 允许探测器和激光束通过盖玻片和进一步通过蛋白质滴在原位方式;因此, 只有雾滴中的变化才会从 dl 路径中记录下来。为了便于处理, 该设备有两个开口: 一个前门为最佳定位的盖玻片和一个顶盖, 可以删除, 使用户可以调整的射击位置的微剂量系统, 以及设置与准确性一个新的蛋白质 droplet 在盖玻片上。
采用上述装置的交互式结晶方法是一种可靠的蛋白质晶体生产技术。虽然目前有许多结晶方法可供选择, 但内部关于结晶机理的信息并不容易实现。一般而言, 应用传统的结晶方法只允许在结晶相图中对溶液进行有限的控制, 只有在实验开始后才可能改变其航向。在进行结晶实验的同时, 应用这种自动结晶技术与原位dl 结合, 在相图中获得了大量关于过渡的知识。一般情况下, 在相图中, 产生无定形沉淀的区域和均匀成核的诱导是相互接近的。因此, 通过根据粒子分布的实时信息来操作结晶液滴过程, 可以通过逐步调整结晶条件向成核, 避免蛋白质沉淀, 并晶体形成。
目前, 许多结晶条件包括聚乙二醇 (PEG) 衍生物广泛存在的沉淀溶液。这种化合物通常具有高粘度, 可以吹打或配药困难。在本例研究中, 用于沉淀配药的微剂量系统应用非常薄的毛细血管, 使增加的 picolitre 增量成为可能。因此, 在使用高粘性物质方面存在一些局限性。在一系列过去的实验中, 该系统使用以下 PEG 衍生物得到了积极的结果: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%。虽然到目前为止只有上述的解决方案被测试, 微剂量系统包含一个特殊的加热机制, 可以使用, 以减少溶液的粘度。另一个因素是盐溶液, 必须考虑时, 作为蛋白质沉淀。在使用高浓度盐的情况下, 少量能在微剂量系统的喷嘴上结晶, 导致微泵在沉淀添加时的表面堵塞;即使在实验室中存在非常高的相对湿度。为了克服这个问题, 实验需要被搁置, 这样喷嘴中的盐才能被除去。这可能需要特殊处理, 并且可能在沉淀添加阶段产生错误。
根据在进行这种自动结晶实验时可以获得的宝贵信息, 这项技术也可以推广到研究蛋白质结晶物理化学方面。其成核和晶体生长反应速率是基于温度、粒径生长、蛋白质和沉淀等实验所描述的时间依赖性信息, 可以推导和计算的动力学现象。浓度。
The authors have nothing to disclose.
作者从欧洲联盟的地平线2020研究和创新计划的资助, 在玛丽玛丽·斯卡洛多斯卡·居里-居里缩写 “X 探针” 赠款协议637295号和支持通过 BMBF 赠款05K16GUA 和 “汉堡中心为超快成像-原子尺度上的物质结构、动力学和控制 “德意志 Forschungsgemeinschaft (DFG) 卓越的集群”。
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
Soft wipes | KIMTECH Science | ||
XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |