Aquí presentamos un protocolo para la producción controlada de microcristales de proteína. El proceso utiliza un dispositivo automatizado que permita manipulación controlada de varios parámetros de cristalización. La cristalización de proteínas es realizados por adición controlada y automatizada de soluciones de la cristalización mientras que vigilar e investigar la distribución de radio de las partículas en la gota de cristalización.
El dispositivo automatizado de la cristalización es una técnica patentada1 desarrollada especialmente para el control de experimentos de cristalización de proteínas con el objetivo de maniobrar precisamente la nucleación y crecimiento cristalino hacia tamaños deseados de cristales proteicos. La cristalización controlada se basa en investigación muestra en situ dispersión dinámica de luz (DLS) mientras que todos los cambios visuales en la gota son monitoreados en línea con la ayuda de un microscopio acoplado a una cámara CCD, lo que permite una completa investigación de la gota de proteína durante todas las etapas de cristalización. El uso de mediciones en situ de DLS a lo largo de todo el experimento permite una identificación precisa de la solución de proteína altamente sobresaturada la transición a una nueva etapa – la formación de núcleos de cristal. Mediante la identificación de la etapa de nucleación de la proteína, se puede optimizar la cristalización de cristales de proteína grande a la producción de proteína microcristales. El protocolo experimental muestra una cristalización interactiva enfoque basa en precisos pasos automatizados como precipitante además, la evaporación del agua para inducir alta sobresaturación, y dilución de la muestra de desaceleración inducida por nucleación homogénea o transiciones de la fase de inversión.
En los últimos años, el crecimiento de proteína micro – y nanocristales ha captado la atención de la comunidad de Cristalografía de proteínas, especialmente con el continuo desarrollo de la cristalografía del femtosegundo Serial (SFX). Debido a la brillantez de la novela radiografía radiación fuentes y basado en los resultados exitosos obtenidos hasta el momento, la producción de proteína micro – y se ha convertido en nanocristales de alta relevancia, planteando una alta demanda en la preparación de tales suspensiones cristalinas 2 , 3. debido al pequeño cristal-gama del tamaño requerida para la recolección de datos en láseres de electrones libres (XFELs) y la limitada disponibilidad de beamtime experimental, caracterización de la muestra antes de la recogida de datos es esencial. Las técnicas más comunes para caracterizar suspensiones de micro o nanocristales de proteínas son hasta ahora la microscopia electrónica y difracción de polvo de rayos x.
Hasta ahora, se han adaptado varios enfoques de métodos comunes de cristalización con el fin de producir cantidades a granel de cristales proteicos con dimensiones en la gama del micrómetro pequeño. El método por lotes se utiliza para la mezcla rápida de proteínas concentrado y soluciones precipitante, obligando así a la solución de la muestra a una fase altamente sobresaturada donde nanocrystallization puede ser favorecido4. Otros métodos incluyen trituración cristales grandes de la proteína para formar una mezcla de cristal, que puede servir como suspensiones nanocristalinos para colección de datos5. Sin embargo, los resultados pueden algunas veces ocasionar calidad disminuida de la difracción, como cristales deteriorados tienen orden interna más baja. Nanocrystallization basado en la difusión libre de la interfaz también es una alternativa disponible, donde solución de proteína se agrega en pequeñas cantidades en una solución altamente concentrada, precipitante3. Sin embargo, entre todas las técnicas, los métodos más eficientes parecen ser la cristalización batch y más innovadoras técnicas manipulativas utilizando métodos de difusión de vapor en la sala gotas6.
En general, para la cristalización de una proteína hay que cruzar una barrera de energía para apoyar nucleación – el primer paso termodinámico en la formación de cristales. Pasar la solución de proteína de un estado termodinámicamente estable a sobresaturación y finalmente para inducir una transición de fase, deben modificarse algunas variables relacionadas con la solución de proteína. Dichas variables son generalmente la concentración de la solución de la proteína, cambios ambientales (por ej., temperatura, humedad), características solventes (e.g., pH, fuerza iónica), tampón y la concentración de propiedades, etc.7 ,8 un resumen de los parámetros de la muestra que se puede cambiar se representa generalmente por medio de diagramas de fases, que permiten diferentes modos de presentación, tales como diagramas de solubilidad, diagramas de fase de nucleación o incluso más detallada descripciones de donde diagramas tridimensionales o más complejos pueden entrar en consideración8,9,10. Los tipos más atractivos de diagramas de fases son generalmente de dos dimensiones, donde la variable principal es la concentración de proteína en función de otro parámetro, mientras que los restantes parámetros se mantienen constantes6,11. Una vez que se forman uno o varios núcleos, cristales más grandes pueden crecer tomando adicionales de la proteína de la solución a granel. Cuando con el objetivo de producción micro y de nanocristales, un enfoque convencional de la cristalización no es factible ya debido al pequeño número de cristales que están presentes en la solución. Nanocristalinos suspensiones usualmente tienen que ser rico en entidades cristalinas, por lo tanto que la vía de cristalización tiene que reajustarse, tales que hay una maxima de eventos de nucleación en la muestra. En consecuencia, esto requiere la investigación de algunos nuevos, hasta vías de nucleación ahora inexplorado para las proteínas, que también todavía no son completamente entendidos12,13. Basado en los fundamentos de diagrama de fase anteriormente mencionados, la teoría clásica se ha extendido a una nueva hipótesis, donde la nucleación se describe como un mecanismo de dos etapas: en primer lugar, una transición a una mayor concentración de proteína lleva a cabo (líquido denso fase) y en segundo lugar, una transición de una fase densa ricos a un mayor orden interno (núcleos de cristal con arquitectura de entramado)14,15,16. Cristalización de proteínas es sensible a muchos factores, y por lo tanto cuando sean reajustados recetas de cristalización en cristales de tamaño diferentes, las recetas no siempre dependen de conocimientos previos. Nuevos conocimientos necesitan ser establecidos para cada destino de la proteína individual: ajuste de tampón composición, pureza y estabilidad del muestra, precisa conocimiento de la solubilidad de la proteína, etcetera.
Dispersión ligera dinámica es hoy un método bien establecido para análisis y optimización de procesos de cristalización de proteínas, debido a una amplia gama de tamaño de partículas que pueden investigarse: proteínas monoméricas a nanocristales y pequeños microcristales. El método aprovecha que las partículas en solución se someten a movimiento browniano y que la velocidad media de este movimiento está determinada por el tamaño de partícula, su energía térmica y la viscosidad del medio y la geometría de la partícula. Al principio, el medio líquido está iluminado por una fuente de luz coherente con el uso de un láser. La luz dispersada por las partículas es formando un patrón de interferencia. Porque las partículas están en movimiento permanente del patrón de interferencia también cambia permanentemente. Cuando se mira en una dirección determinada, se pueden observar las fluctuaciones de intensidad. Estas fluctuaciones están mostrando ahora el movimiento de la partícula causado por el movimiento browniano. De las fluctuaciones de intensidad medidos se calcula una función de autocorrelación (ACF). Un análisis del ACF dará una medida para la distribución de la velocidad (más precisamente el coeficiente de difusión) de las partículas y utilizando la ecuación de Stokes-Einstein, se convierte en una partícula radio distribución17. Información adicional relacionada con la funcionalidad DLS y principio de funcionamiento puede encontrarse en diversas publicaciones y libros18,19.
Aquí aplicamos y describir un dispositivo único automatizado cristalización, el XtalController900, una versión mejorada de la XtalController tecnología6, desarrollado precisamente para control de experimentos de cristalización de proteínas interactivas. Esta técnica muestra un alto potencial para la identificación y seguimiento de eventos de nucleación en tiempo real, permitiendo una maniobra precisa mediante el diagrama de fases de cristalización. El objetivo de este procedimiento de cristalización particular es optimizar la cristalización de proteínas para obtener alta calidad proteína micro – y nanocristales que son adecuados para aplicaciones que utilizan fuentes de rayos x de sincrotrón micro-centrada, difracción de electrones, o SFX.
El dispositivo de cristalización está diseñado para controlar y manipular parámetros cruciales durante un experimento de cristalización basado en un método de difusión de vapor modificada. Esta técnica permite monitoreo y anotando un experimento de cristalización de proteínas en todas las etapas, lo que permite al usuario tener un conocimiento preciso y control de la solución de la proteína en el diagrama de fases de cristalización, en el in situ análisis DLS de la suspensión de la muestra.
El dispositivo de cristalización comprende una cámara experimental (figura 1) conectada a una cámara CCD que permite monitorizar en tiempo real de la gota de cristalización. La cámara está adaptada a un microscopio equipado con lentes de diferentes aumentos, proporcionando una resolución espacial máxima de aproximadamente 2.5 μm. El núcleo de la cámara experimental es una Microbalanza ultrasensible para el seguimiento de la evolución del peso de muestra con el tiempo. El procedimiento de cristalización corresponde a un experimento de sentarse y soltar vapor difusión, donde la caída de la proteína se pone en un cubreobjetos siliconado, que se coloca en la microbalanza. Basado en los cambios de peso de la gota, que son causadas por la adición del precipitante, adición de aditivo de agua o evaporación de la muestra, la microbalanza da una entrada precisa de un algoritmo para el cálculo inmediato de la concentración de proteína y precipitado con el tiempo . Además, cristalización importante parámetros tales como temperatura y humedad relativa precisamente son monitoreados y controlados.
Para llevar a cabo un experimento de cristalización, el dispositivo está equipado con dos sistemas de micro dosificación (bombas piezoeléctricas libres de contacto) que funcionan en una escala de picolitros para precipitado y agua. Al trabajar con cantidades tan pequeñas de sustancia, los gradientes de concentración y el fenómeno de la convección dentro de la gota de proteína se reducen al mínimo. El papel principal de las bombas piezoeléctricos es la adición de agua, este último por ejemplo se utiliza como compensación por evaporación natural de la gota de proteína o precipitado. Los sistemas de dosificación de micro tienen un conjunto de características, que puede dictar la adición de una sustancia. Tales características incluyen: la tasa de repetición para la adición de una sustancia, ha añadido el número de gotas por segundo, el ancho y alto de la trayectoria de la corriente de sustancia, etcetera. Además, la posición de las bombas puede ser ajustada manualmente, permitiendo al usuario tener una posición precisa para la adición de sustancias a la gota de la proteína.
La manipulación de la única retroalimentación controlada de la gota de cristalización se logra en situ DLS los datos, que pueden demostrar posibles cambios en el estado oligomeric proteína a lo largo de todo el procedimiento experimental. La técnica permite la evaluación constante de la distribución de tamaño de partícula con el tiempo, revelando así desconoce los mecanismos relacionados con la proteína. El equipo de óptica DLS es coloca estratégicamente por debajo del cubreobjetos, permitiendo que el detector y laser rayo pase a través de cubreobjetos y más a través de la gota de la proteína de una moda en situ ; por lo tanto, se registran sólo cambios dentro de la gota de la trayectoria DLS. Para permitir el fácil manejo, el dispositivo tiene dos aberturas: una puerta para una colocación óptima del cubreobjetos y una tapa que se puede quitar, para que el usuario puede ajustar la posición de tiro de los sistemas de dosificación de micro así como establecer con precisión una nueva dro de proteína Plet en el cubreobjetos.
El método de cristalización interactiva utilizando el dispositivo mencionado es una técnica confiable para la producción controlada por el tamaño de cristales proteicos. Aunque actualmente existen muchos métodos de cristalización, información acerca de la cristalización mecanismo en sí no es fácilmente alcanzable. En general, aplicación de métodos de cristalización convencional permite solamente un control limitado de una solución en el diagrama de fases de cristalización, con sólo algunas posibilidades de cambiar su curso una vez comenzado un experimento. Al realizar una cristalización experimentar y aplicar una tecnología cristalización automatizado juntada con en situ DLS, un gran cantidad de conocimiento se obtiene sobre las transiciones en el diagrama de fases. En general, las regiones, dando por resultado precipitado amorfo y la inducción de la nucleación homogénea están cerca uno del otro en el diagrama de fases. Por lo tanto, al manipular el curso de una gotita de cristalización basada en tiempo real información sobre su distribución de partícula, es posible evitar la precipitación de una proteína ajustando gradualmente las condiciones de cristalización hacia la nucleación y formación de cristales.
Hoy en día, muchas condiciones de cristalización incluyen soluciones precipitante donde están extensamente presentes derivados de glicol polietileno (PEG). Dichos compuestos tienen generalmente una alta viscosidad que puede poseer dificultades para pipeteo o dispensación. En el presente estudio de caso, los sistemas de micro dosis que se utilizan para la erogación del precipitante aplicarán capilares muy finos que permiten la adición de incrementos de picolitros. En consecuencia, existen algunas limitaciones en el trabajo con sustancias altamente viscosas. Dentro de una serie de experimentos anteriores, el sistema ha dado resultados positivos usando los siguientes derivados de PEG: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Aunque hasta ahora sólo las soluciones mencionadas fueron probadas, los sistemas de dosificación de micro contienen un mecanismo de calentamiento especial que puede ser utilizado para disminuir la viscosidad de una solución. Otro factor es soluciones de sal que habrían que considerar cuando se utiliza como precipitante de proteínas. Cuando se trabaja con sales altamente concentradas, una pequeña cantidad puede cristalizar en la boquilla de dosificación de micro, causando bloqueo superficial de la bomba de dosificación de micro durante la adición del precipitante; incluso cuando una humedad relativa muy alta está presente en la cámara experimental. Para resolver este problema, el experimento debe ser puesto en espera para que la sal de la boquilla se puede quitar. Esto podría requerir un tratamiento especial y puede producir errores en la fase de la adición del precipitante.
Basado en la información valiosa que puede obtenerse al realizar tales experimentos de cristalización automatizado, esta técnica puede también extenderse a estudios que investigaron los aspectos de química física de la cristalización de proteínas. Las tasas de reacción de nucleación y cristal crecimiento son fenómenos cinéticos que pueden ser derivados y calculados en base a la información de dependencia de tiempo representada de un experimento como la temperatura, el crecimiento de tamaño de partícula y la proteína y precipitante concentración.
The authors have nothing to disclose.
Los autores reconocen que la financiación de la Unión Europea Horizon 2020 programa de investigación e innovación Marie Sklodowska-Curie Acronym “X-sonda” beca Convenio Nº 637295 y soporte a través de BMBF grant 05K16GUA y el “el Hamburgo centro de ultrarrápida La proyección de imagen, estructura, dinámica y Control de la materia a escala atómica”racimo de la excelencia de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
Soft wipes | KIMTECH Science | ||
XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |