Nous présentons ici un protocole pour la production contrôlée de microcristaux de protéine. Le procédé utilise un dispositif automatisé permettant la manipulation contrôlée de plusieurs paramètres de cristallisation. La cristallisation de protéines s’effectue par addition contrôlée et automatisée des solutions de cristallisation tandis que le suivi et l’enquête sur la distribution de rayon de particules dans la goutte de cristallisation.
Le dispositif de cristallisation automatisé est une technique brevetée1 spécialement conçu pour la surveillance des expériences de cristallisation de protéines dans le but de manoeuvrer avec précision la nucléation et croissance de cristaux vers les tailles souhaitées de cristaux de protéines. La cristallisation contrôlée est basée sur échantillon enquête avec in situ Dynamic Light Scattering (DLS), alors que tous les changements visuels dans les gouttelettes sont surveillés en ligne à l’aide d’un microscope couplé à une caméra CCD, permettant ainsi une pleine enquête de la gouttelette de protéine durant toutes les étapes de cristallisation. L’utilisation de in situ DLS mesures tout au long de l’expérience entière permet une identification précise de la solution de protéines hautement sursaturée en transition vers une nouvelle phase – la formation des noyaux de cristal. En identifiant la phase de nucléation de protéine, la cristallisation peut être optimisée de cristaux de protéines importantes pour la production de protéine microcristaux. Le protocole expérimental montre une cristallisation interactive approche fondée sur des mesures automatisées précis comme ajout precipitant, évaporation de l’eau pour sursaturation induisant en haute, et de dilution de l’échantillon pour le ralentissement induit par nucléation homogène ou transitions de phase d’inversion.
Au cours de ces dernières années, la croissance des protéines micro et nanocristaux a capté l’attention de la communauté de cristallographie des protéines, en particulier avec le développement continu de cristallographie de la femtoseconde Serial (SFX). En raison de l’éclat de la nouvel x-ray radiation sources et basé sur les résultats positifs obtenus jusqu’à présent, la production de protéine micro – et nanocristaux est devenue de grande pertinence, posant une forte demande sur la préparation de ces suspensions cristallines 2 , 3. en raison de la petit cristal taille-gamme requise pour la collecte de données sur les lasers à électrons libres (XFELs) et de la disponibilité limitée de beamtime expérimentale, caractérisation des échantillons avant la collecte des données est essentielle. Les techniques les plus courantes pour caractériser les suspensions micro – ou nanocristaux de protéine sont jusqu’à maintenant la microscopie électronique et par diffraction de poudre.
Jusqu’ici, plusieurs approches ont été adaptés de méthodes communes de cristallisation dans le but de produire des quantités en vrac de cristaux de protéines avec des dimensions de l’ordre du micromètre petit. La méthode de traitement par lots est utilisée pour le mélange rapide des concentrés riches en protéines et solutions precipitant, forçant ainsi la solution de l’échantillon à une phase très sursaturée, où nanocrystallization peut être favorisée4. Autres méthodes incluent écrasant des cristaux de protéines importantes pour former une pâte de cristal, qui peut servir de suspensions nanocristallins à utiliser pour la collecte de données5. Toutefois, les résultats peuvent parfois entraîner qualité diminuée de diffraction, comme cristaux détériorés ont ordre interne inférieur. Nanocrystallization basée sur la diffusion des interface libre est aussi une alternative disponible, où la solution protéique est ajoutée en petites quantités pour une solution precipitant hautement concentrée3. Cependant, parmi toutes les techniques, les méthodes les plus efficaces semblent la cristallisation par lots et plus techniques manipulatoires innovantes utilisant des méthodes de diffusion de la vapeur en séance gouttes6.
En général, pour la cristallisation d’une protéine, une barrière d’énergie doit être franchie pour prendre en charge la nucléation – la première étape thermodynamique de formation de cristaux. Afin de passer la solution protéique d’un État thermodynamiquement stable à sursaturation et enfin pour induire une transition de phase, certaines variables associés à la solution de protéines doivent être modifiées. Ces variables sont généralement la concentration de la solution de protéine, les changements environnementaux (p. ex.., température, humidité), solvants caractéristiques (p. ex., pH, force ionique), les propriétés de concentration et de mémoire tampon, etc.7 ,8 , une vue d’ensemble des paramètres de l’échantillon qui peut être changé est habituellement représenté au moyen de diagrammes de phase, qui permettent à différents modes de présentation, tels que les diagrammes de solubilité, diagrammes de phase de nucléation ou même plus détaillées descriptions où les schémas en trois dimensions ou plus complexes peuvent entrer en compte8,9,10. Les types plus attrayantes des diagrammes de phase sont généralement à deux dimensions, où la principale variable est la concentration de protéine en fonction d’un autre paramètre, alors que les autres paramètres sont gardés constants6,11. Une fois un ou plusieurs noyaux sont formés, cristaux plus grands peut se développer en reprenant d’autres protéines de la solution en vrac. Lorsque le but pour la production de micro et nanocristallins, une telle approche de cristallisation classique n’est pas possible plus en raison du petit nombre de cristaux qui sont présents dans la solution. Nanocristallins suspensions ont généralement être riches en entités cristallines, donc que la voie de cristallisation a être réajustées, tel qu’il existe un maxima des événements de nucléation présents dans l’échantillon. En conséquence, cela exige l’enquête de certains nouveaux, jusqu’à ce que les voies de nucléation maintenant inexploré pour les protéines, qui sont aussi encore pas bien compris12,13. Basé sur les fondamentaux de diagramme de phase a été mentionnés précédemment, la théorie classique a été étendue à une nouvelle hypothèse, où la nucléation est décrit comme un mécanisme en deux étapes : dans un premier temps, une transition vers une concentration plus élevée de la protéine se déroule (liquide dense phase) et d’autre part, une transition d’une phase dense riche à un ordre interne plus élevée (noyaux de cristal avec une architecture réseau)14,15,16. La cristallisation de protéines est sensible à de nombreux facteurs, et donc lorsque les recettes de cristallisation sont réajustées causera des cristaux de tailles différentes, les recettes ne peut pas toujours compter sur les connaissances antérieures. Nouvelles connaissances doivent être établies pour chaque cible de protéines individuelles : ajustement de la composition du tampon, la pureté et la stabilité de la connaissance de l’échantillon, précise de solubilité des protéines, etc..
Diffusion dynamique de la lumière est aujourd’hui une méthode bien établie pour l’analyse et l’optimisation des processus de cristallisation de protéines, en raison d’une large plage de taille de particules qui peuvent être l’objet d’une enquête : des protéines monomériques à nanocristaux et petit microcristaux. La méthode exploite que les particules en solution subissent un mouvement brownien et que la vitesse moyenne de la présente requête est déterminée par la taille des particules, leur énergie thermique et la viscosité du milieu et de la géométrie de la particule. Au début, le milieu liquide est éclairé par une source de lumière cohérente avec l’utilisation d’un laser. La lumière diffusée par les particules est formant une figure d’interférence. Comme les particules sont en mouvement permanent la figure d’interférence affecte également en permanence. Quand on regarde dans une direction donnée, les fluctuations d’intensité peuvent être observées. Ces fluctuations sont maintenant montrer le mouvement de particules provoqué par le mouvement brownien. Les fluctuations d’intensité mesurée correspond à une fonction d’autocorrélation (ACF). Une analyse de l’ACF donnera une mesure pour la distribution de vitesse (plus précisément le coefficient de diffusion), de particules et en utilisant l’équation de Stokes-Einstein, est transformée en une particule rayon distribution17. On trouvera des informations supplémentaires liées à la fonctionnalité de listes de distribution et principe de fonctionnement dans diverses publications et livres18,19.
Ici nous appliquons et décrire un dispositif unique de cristallisation automatisé, le XtalController900, une version améliorée de la XtalController technologie6, précisément développé pour la surveillance des expériences de cristallisation de protéines interactive. Cette technique présente un haut potentiel pour l’identification et de suivi des événements de nucléation en temps réel, permettant ainsi des manoeuvres précises à travers le diagramme de phase de cristallisation. L’objectif de cette procédure particulière de cristallisation est d’optimiser la cristallisation de protéines pour obtenir des protéines de haute qualité micro – et nanocristaux qui conviennent aux applications utilisant des sources de rayons x de synchrotron axés sur le micro, diffraction d’électrons, ou SFX.
Le dispositif de cristallisation est conçu pour contrôler et manipuler des paramètres cruciaux au cours d’une expérience de cristallisation basée sur une méthode de diffusion de la vapeur mis à jour le. Cette technique permet de surveiller et marquant une expérience de la cristallisation de protéines à tous les stades, permettant à l’utilisateur d’avoir une connaissance précise et le contrôle de la solution de protéines dans le diagramme de phase de cristallisation, fondé sur in situ DLS analyse de la suspension de l’échantillon.
Le dispositif de cristallisation comprend une chambre expérimentale (Figure 1) reliée à une caméra CCD qui permet une surveillance en temps réel de la gouttelette de cristallisation. L’appareil est adapté à un microscope équipé de lentilles de grossissement différents, offrant une résolution spatiale maximale d’environ 2,5 µm. Le noyau de la chambre expérimentale est une microbalance ultrasensible pour suivre l’évolution du poids de l’échantillon au fil du temps. La procédure de cristallisation correspond à une expérience de diffusion de la vapeur-séance-goutte, où la baisse de la protéine est placée sur une lamelle de mastic, qui est placée sur la microbalance. Basé sur les changements de poids de la goutte, qui sont causés par addition precipitant, ajout de l’eau/additif ou évaporation d’échantillon, la microbalance donne une entrée précise à un algorithme pour le calcul immédiat de concentration protéique et précipitant au fil du temps . En outre, les paramètres cristallisation importants tels que la température et l’humidité relative sont précisément surveillés et contrôlés.
Afin de réaliser une expérience de cristallisation, l’appareil est équipé de deux systèmes de micro-dosage (contacter gratuites pompes piézo-électriques) qui fonctionnent à l’échelle picolitres pour addition précipitant et l’eau. En travaillant avec ces faibles quantités de substance, les gradients de concentration et le phénomène de convection au sein de la gouttelette de protéine sont réduits au minimum. Le rôle principal des pompes piézoélectriques est l’ajout d’eau, celui-ci par exemple utilisé en compensation de l’évaporation naturelle de la gouttelette de protéine ou précipitant. Les systèmes de micro-dosage ont un ensemble de fonctionnalités qui peut dicter l’ajout d’une substance. Ces caractéristiques comprennent : le taux de répétition pour l’inscription d’une substance, le nombre de gouttes ajoutées par seconde, la largeur et la hauteur de la trajectoire du flux matière, etc.. En outre, la position des pompes peut être réglée manuellement, permettant à l’utilisateur d’avoir une position précise pour l’addition de substances dans les gouttelettes de protéines.
La manipulation de rétroaction unique contrôlée de la goutte de cristallisation est obtenue par in situ données de listes de distribution, qui peuvent montrer des changements possibles dans l’état de protéine oligomérique pendant toute la procédure expérimentale. Cette technique permet une évaluation permanente de la distribution granulométrique au fil du temps, révélant ainsi les mécanismes inconnus axés sur les protéines. L’équipement optique DLS est placé stratégiquement au-dessous de la zone de la lamelle couvre-objet, ce qui permet du faisceau laser et détecteur à passent par le biais de la lamelle couvre-objet et ensuite dans la goutte de protéine dans un mode in situ ; par conséquent, que des changements au sein de la goutte sont enregistrées dans le chemin d’accès DLS. Pour permettre une manipulation facile, l’appareil possède deux ouvertures : une porte d’entrée pour un positionnement optimal de la lamelle couvre-objet et d’un couvercle qui peut être retiré, afin que l’utilisateur peut ajuster la position de tir des systèmes micro-dosage comme définissant avec précision un scrutateur de protéine nouvelle plet sur la lamelle couvre-objet.
La méthode de cristallisation interactive à l’aide de l’appareil susmentionné est une technique fiable pour la production contrôlée par taille des cristaux de protéine. Bien que de nombreuses méthodes de cristallisation sont disponibles, à l’intérieur des informations sur la cristallisation mécanisme lui-même n’est pas facilement réalisable. En général, appliquant les méthodes classiques de cristallisation ne permet qu’un contrôle limité de la solution dans le diagramme de phase de cristallisation, avec seulement quelques possibilités de changer de son cours une fois une expérience commencée. Tout en effectuant une cristallisation expérimenter et appliquant telle une technologie automatisée de cristallisation couplée avec in situ DLS, un grand nombre de connaissances est acquise sur les transitions dans le diagramme de phase. En général, les régions d’où précipité amorphe et l’induction de nucléation homogène sont rapprochées dans le diagramme de phase. Par conséquent, en manipulant le parcours d’une goutte de cristallisation sur base des informations en temps réel sur sa distribution de particules, il est possible d’éviter la précipitation d’une protéine en ajustant progressivement les conditions de cristallisation vers la nucléation et formation de cristaux.
De nos jours, plusieurs conditions de cristallisation incluent des solutions precipitant où dérivés de polyéthylène glycol (PEG) sont largement présents. Ces composés ont généralement une viscosité élevée qui peut posséder des difficultés pour la pipette ou la distribution. Dans la présente étude de cas, les systèmes de micro-dosage qui sont utilisés pour la distribution precipitant s’appliquent très minces capillaires qui permettent l’ajout d’incréments picolitres. En conséquence, il y a quelques limitations dans le travail avec des substances hautement visqueux. Dans une série d’expériences passées, le système a donné des résultats positifs en utilisant les dérivés suivants de PEG : PEG200 50 % PEG3000 20 %, PEG6000 10 %, PEG800010 %. Bien que jusqu’à présent seuls les solutions susmentionnées ont été testées, les systèmes de micro-dosage contiennent un mécanisme de chauffage spécial qui peut être utilisé afin de diminuer la viscosité d’une solution. Un autre facteur est solutions salines qui doivent être considérés lorsqu’il est utilisé comme protéine precipitant. Lorsque vous travaillez avec des sels très concentrés, une petite quantité peut se cristalliser à la buse du système micro-dosage, provoquant le blocage superficiel de la pompe micro-posologie pendant precipitant addition ; même lorsqu’une humidité relative très élevée est présente dans la chambre expérimentale. Pour résoudre ce problème, l’expérience doit être mis en attente afin que le sel de la buse peut être enlevé. Cela peut nécessiter un traitement spécial et peut générer des erreurs lors de la phase d’addition precipitant.
Basé sur les informations précieuses qui peuvent être obtenues lors de l’exécution de telles expériences de cristallisation automatisé, cette technique peut être étendue aux études portant sur les aspects de la chimie physique de la cristallisation de protéines. Les taux de réaction de croissance nucléation et crystal sont des phénomènes de cinétiques qui peuvent être dérivés et calculés basé sur les informations de dépendance temporelle décrits à partir d’une expérience comme la température, la croissance de la taille des particules et des protéines et precipitant concentration.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent le financement provenant de l’Union européenne Horizon 2020 programme de recherche et l’Innovation sous le Marie Sklodowska-Curie acronyme « X-sonde » Grant entente no 637295 et le support par le BMBF grant 05K16GUA et le « The Hambourg Centre pour ultrarapide Imagerie – Structure, dynamique et contrôle de la matière à l’échelle atomique » cluster d’excellence de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
Soft wipes | KIMTECH Science | ||
XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |