Her præsenterer vi en protokol for kontrollerede produktion af protein microcrystals. Processen bruger en automatisk anordning, der sikrer kontrolleret manipulation af flere krystallisering parametre. Protein krystallisering er båret ud af kontrollerede og automatiseret tilsætning af krystallisering løsninger mens overvågning og undersøge radius fordelingen af partikler i krystallisering slipværktøj.
Den automatiserede krystallisering enhed er en patenteret teknik1 specielt udviklet til overvågning protein krystallisering eksperimenter med formålet at netop manøvrere Nukleering og crystal vækst retning ønskede størrelser af protein krystaller. Den kontrollerede krystallisering er baseret på prøven undersøgelsen med i situ dynamiske lys spredning (DLS), mens alle visuelle ændringer i dråben overvåges online ved hjælp af et mikroskop, koblet til en CCD kamera, således at en fuld undersøgelse af protein droplet under alle faser af krystallisering. Brugen af i situ DLS målinger i hele den hele eksperiment giver en præcis identifikation af stærkt overmættet protein løsning overgang til en ny fase-dannelsen af krystal kerner. Ved at identificere protein Nukleering stadiet, kan krystalliseringen optimeres fra store protein krystaller til produktion af protein microcrystals. Den forsøgsplan viser en interaktiv krystallisering tilgang baseret på præcise automatiserede trin såsom fældningsmiddel tilføjelse, vand fordampning for overtalelse høj supersaturation, og prøveopløsning for aftagende induceret homogene Nukleering eller vende faseovergange.
I de sidste par år, har væksten i protein mikro- og nanokrystaller fanget opmærksomhed fra Fællesskabets Proteinkrystallografi især med den fortsatte udvikling af serielle femtosekund krystallografi (SFX). På grund af glans af roman X-ray stråling kilder og baseret på de vellykkede resultater hidtil, produktion af protein mikro – og nanokrystaller er blevet for høj relevans, udgør en stor efterspørgsel på udarbejdelsen af sådanne krystallinsk suspensioner 2 , 3. på grund af den lille krystal størrelse-range kræves for dataindsamling på fri-elektron lasere (XFELs) og de begrænsede mængder af eksperimenterende beamtime, prøve karakterisering før dataindsamling er afgørende. De mest almindelige teknikker til at karakterisere protein mikro- eller nanocrystal suspensioner er indtil nu elektronmikroskopi og X-ray pulver diffraktion.
Hidtil har er flere tilgange blevet tilpasset fra fælles krystallisering metoder med henblik på at producere bulk mængder af protein krystaller med dimensioner i området små mikrometer. Af batch-metoden bruges til hurtig sammenblanding af højt koncentrerede protein og fældningsmiddel løsninger, dermed tvinge prøveopløsningen til en yderst overmættet fase, hvor nanocrystallization kunne være begunstiget4. Andre metoder omfatter knusning store protein krystaller til at danne en krystal gylle, som kan tjene som nanocrystalline suspensioner skal bruges til data indsamling5. Dog, resultaterne kan undertiden resultere i nedsat diffraktion kvalitet, som forringet krystaller har lavere intern ordre. Nanocrystallization baseret på gratis interface diffusion er også tilgængelige alternativ, hvor protein løsningen føjes i små mængder til en meget koncentreret fældningsmiddel løsning3. Men blandt alle teknikker, de mest effektive metoder synes at være batch krystalliseringen og mere innovative manipulerende teknikker, der anvender damp-diffusion metoder siddende dråber6.
Generelt for krystallisering af en protein skal en energi barriere krydses for at støtte Nukleering – den første termodynamiske skridt i krystal formation. I for at flytte protein løsningen fra en termodynamisk stabil stat til supersaturation og endelig nogle variabler i relation til protein løsning for at fremkalde en fase-overgang, bør ændres. Sådanne variabler er normalt koncentrationen af protein løsning, miljømæssige ændringer (fx., temperatur, fugtighed), opløsningsmiddel karakteristika (f.eks., pH, ionisk styrke), koncentration og buffer egenskaber, etc.7 ,8 en oversigt over prøve parametre, som kan ændres repræsenteres normalt ved hjælp af fasediagrammer, som giver mulighed for forskellige former for præsentation, såsom opløselighed diagrammer, Nukleering fasediagrammer, eller endnu mere detaljerede beskrivelser, hvor tre-dimensionelle eller mere komplekse diagrammer kan komme i betragtning8,9,10. De mest tiltalende typer af fasediagrammer er normalt to-dimensionelle, hvor de vigtigste variable er protein koncentrationen som funktion af en anden parameter, mens de resterende parametre holdes konstante6,11. Når en eller et par kerner er dannet, kan større krystaller vokse ved at optage ekstra protein fra bulk løsning. Når der sigtes for mikro- og nanocrystal produktion, er sådan en konventionel krystallisering tilgang ikke muligt længere på grund af det lille antal af krystaller, der er til stede i løsning. Nanocrystalline suspensioner nødt normalt til at være rig i krystallinsk enheder, således krystallisering pathway må justeres, således at der er en maxima af Nukleering arrangementer til stede i prøven. I følge kræver dette undersøgelse af nogle nye, indtil nu uudforsket Nukleering veje for proteiner, som også er endnu ikke fuldt forstået12,13. Baseret på de fase diagram fundamentals nævnte tidligere, den klassiske teori er blevet udvidet til en ny hypotese, hvor Nukleering er beskrevet som en to-trins-mekanisme: først en overgang til en højere proteinkoncentration finder sted (tætte væske fase) og for det andet, en overgang fra en tæt-rige fase til en højere interne orden (krystal kerner med gitter arkitektur)14,15,16. Protein krystallisering er følsomme over for mange faktorer, og derfor når krystallisering opskrifter er efterjusteres resultere i forskellige størrelse krystaller, opskrifterne kan ikke altid stole på forkundskaber. Ny indsigt skal fastsættes for hvert enkelt protein mål: justering af buffer sammensætning, renhed og stabilitet af den prøve, præcise viden om protein opløselighed, osv.
Dynamisk lysspredning er i dag en veletableret metode til analyse og optimering af protein krystallisering processer, på grund af en række størrelsen af partikler, der kan undersøges: fra monomere proteiner til nanokrystaller og små microcrystals. Metoden udnytter at partikler i løsning underkastes Brownske bevægelser og at den gennemsnitlige hastighed for denne bevægelse bestemmes af partikelstørrelse, deres termisk energi og af viskositet medium og partikel geometri. Ved første, er den flydende medium belyst af en sammenhængende lyskilde med brug af en laser. Lysspredningen af partikler er danner et interferensmønster. Da partiklerne er i permanent bevægelse ændres interferensmønster også permanent. Når man ser i en bestemt retning, kan intensitet udsving observeres. Disse udsving viser nu partikel bevægelse forårsaget af Brownske bevægelser. En autokorrelation funktion (ACF) er beregnet ud fra de målte intensitet udsving. En analyse af rådgivende vil give en foranstaltning for hastighed distribution (mere præcist diffusion koefficient) af partikler og ved hjælp af Stokes-Einstein ligning, omdannes til en partikel radius distribution17. Yderligere oplysninger om DLS funktionalitet og Funktionsprincip kan findes i forskellige publikationer og bøger18,19.
Her vi anvende og beskrive en unik automatiseret krystallisering enhed, XtalController900, en opgraderet version af den XtalController teknologi6, netop udviklet til overvågning af interaktive protein krystallisering eksperimenter. Denne teknik viser et højt potentiale for identifikation og sporing af Nukleering begivenheder i realtid, giver mulighed for en præcis manøvrering gennem krystallisering fase diagram. Formålet med denne særlige krystallisering procedure er at optimere protein krystallisering for at opnå høj kvalitet protein mikro- og nanokrystaller, der er egnet til anvendelser udnytter mikro-fokuserede synkrotron X-ray kilder, elektron diffraktion, eller SFX.
Krystallisering enhed er designet til at overvåge og manipulere afgørende parametre under en krystallisering eksperiment baseret på en modificeret damp-diffusion metode. Denne teknik giver mulighed for overvågning og scoring en protein krystallisering eksperiment på alle stadier, gør det muligt for brugeren at har præcis viden og kontrol af protein løsning i hele krystallisering fase diagram, baseret på in situ DLS analyse for eksempel suspension.
Krystallisering enhed består af en eksperimentel kammer (figur 1) tilsluttet en CCD-kamera, der giver mulighed for tidstro overvågning af krystallisering slipværktøjet. Kameraet er tilpasset et mikroskop udstyret med forskellige forstørrelse objektiver, giver en maksimal rumlige opløsning af ca 2,5 µm. Kernen i den eksperimentelle kammer er en ultrasensitive microbalance til at spore udviklingen af prøven vægt over tid. Krystallisering proceduren svarer til en møde-slip damp-diffusion eksperiment, hvor protein dråbe er placeret på en Silikoniseret coverslip, som er placeret på microbalance. Baseret på vægtændringer af droplet, som er forårsaget af fældningsmiddel tilsætning, vand/additiv tilsætning eller prøve fordampning, giver microbalance et præcist input til en algoritme for øjeblikkelig beregning af protein og fældningsmiddel koncentration over tid . Derudover vigtigt krystallisering parametre såsom temperatur og relativ luftfugtighed netop overvåges og kontrolleres.
For at udføre en krystallisering eksperiment, er enheden udstyret med to mikro-dosering systemer (kontakt gratis piezoelektriske pumper) at arbejde på en picoliter skala for fældningsmiddel og vand ud. Ved at arbejde med sådanne små mængder af stoffet, er koncentration stigninger og konvektion fænomen inden for protein droplet minimeret. Den vigtigste rolle i de piezoelektriske pumper er tilføjelsen af fældningsmiddel eller vand, sidstnævnte for eksempel bliver brugt som erstatning for naturlige fordampning af protein slipværktøjet. Mikro-dosering systemer har en række funktioner, som kan diktere tilføjelsen af et stof. Sådanne funktioner omfatter: gentagelseshyppighed for at tilføje et stof, antallet af dråber tilsat pr sekund, bredde og højde af stof stream bane osv. Derudover kan placeringen af pumperne manuelt justeres, gør det muligt for brugeren at have en præcis position for tilsætning af stoffer til protein slipværktøjet.
Unikke feedback styres manipulation af krystallisering drop opnås ved i situ DLS data, som kan vise eventuelle ændringer i tilstanden protein oligomere under hele eksperimentelle proceduren. Teknikken tillader konstant evaluering af partikelstørrelsesfordeling over tid, således afslører ukendt protein-relaterede mekanismer. DLS optik udstyr er beliggende strategisk under coverslip-området, som gør detektor og laser stråle til at passere gennem coverslip og videre gennem protein dråbe i en i situ mode; Derfor registreres kun ændringer inden for slipværktøjet fra DLS sti. For at give mulighed for nem håndtering, enheden har to åbninger: en dør til en optimal placering af coverslip og en top låg, som kan fjernes, således at brugeren kan tilpasse de skydning stilling af mikro-dosering systemer samt indstilling med nøjagtighed en ny protein dro plet på coverslip.
Den interaktive krystallisering metode ved hjælp af førnævnte enhed er en pålidelig teknik til størrelse-kontrollerede produktion af protein krystaller. Selvom mange krystallisering metoder er i øjeblikket tilgængelige, intern viden om krystalliseringen er mekanisme sig selv ikke let opnåelige. Generelt giver anvender konventionelle krystallisering metoder kun begrænset kontrol over en løsning i krystallisering fase diagram, med kun et par muligheder for at ændre sin kurs, når et eksperiment er begyndt. Mens de udfører en krystallisering eksperimentere og anvende sådanne en automatiseret krystallisering teknologi kombineret med i situ DLS, en stor portion viden er opnået om overgange i fase diagram. I almindelighed, er regionerne resulterer i amorfe bundfald og induktion af homogene Nukleering tæt på hinanden i fase diagram. Ved at manipulere kursus af en krystallisering droplet baseret på real-time oplysninger om dens partikel distribution, er det derfor muligt at undgå udfældning af et protein ved gradvist at krystallisering betingelser mod Nukleering og krystal formation.
I dag, omfatter mange krystallisering betingelser fældningsmiddel løsninger hvor polyethylenglycol (PEG) derivater er almindeligt stede. Sådanne forbindelser har som regel en høj viskositet, som kan have vanskeligheder for pipettering eller udlevering. I den aktuelle case study anvende de mikro-dosering systemer, der anvendes til fældningsmiddel udlevering meget tynd kapillærer, der muliggør tilføjelse af picolitre intervaller. Som følge heraf er der nogle begrænsninger i arbejdet med meget tyktflydende stoffer. Inden for en række tidligere eksperimenter, systemet har givet positive resultater ved hjælp af følgende PIND derivater: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Men indtil videre kun de ovennævnte løsninger blev testet, indeholder mikro-dosering systemer en særlig varme mekanisme, som kan anvendes til at reducere viskositeten af en løsning. En anden faktor er saltopløsninger, der skal overvejes, når det anvendes som protein fældningsmiddel. Når du arbejder med stærkt koncentrerede salte, kan en lille mængde krystallisere på dysen af mikro-dosering system, forårsager overfladiske blokering af mikro-dosering pumpe under fældningsmiddel tilføjelse; selv når en meget høj relativ luftfugtighed er til stede i den eksperimentelle kammer. For at afhjælpe dette problem, skal eksperimentet sættes på hold, således at salt fra dysen kan fjernes. Dette kræver muligvis særlig håndtering og kan producere fejl i fældningsmiddel tilføjelse fase.
Baseret på de værdifulde oplysninger, der kan opnås, når du udfører disse automatiserede krystallisering eksperimenter, kan denne teknik også udvides til studier undersøger fysisk kemi aspekter af protein krystallisering. Nukleering og crystal reaktion vækstraterne er kinetiske fænomener, som kan være afledt og beregnes baseret på den tid-afhængighed oplysninger afbildet fra et eksperiment som temperatur, vækst af partikelstørrelsen og protein og fældningsmiddel koncentration.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender finansiering fra EUs Horisont 2020 forskning og Innovation program under Marie Sklodowska-Curie Acronym “X-sonde” Grant aftale No. 637295 og støtte via BMBF grant 05K16GUA, og den “The Hamburg centrum for ultrahurtig Imaging-struktur, dynamik og kontrol af sagen på atomare skalaen”excellence klynge af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
Soft wipes | KIMTECH Science | ||
XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |