यहां हम प्रोटीन microcrystals के नियंत्रित उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रक्रिया एक स्वचालित कई क्रिस्टलीकरण मापदंडों के नियंत्रित हेरफेर की अनुमति डिवाइस का उपयोग करता है । निगरानी और क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद में कणों की त्रिज्या वितरण की जांच करते हुए प्रोटीन क्रिस्टलीकरण, क्रिस्टलीकरण समाधान के नियंत्रण और स्वचालित अलावा द्वारा किया जाता है ।
स्वचालित क्रिस्टलीकरण डिवाइस एक पेटेंट तकनीक1 विशेष रूप से ठीक प्रोटीन क्रिस्टल के वांछित आकार की ओर nucleation और क्रिस्टल विकास पैंतरेबाज़ी करने के उद्देश्य के साथ प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रयोगों की निगरानी के लिए विकसित की है । नियंत्रित क्रिस्टलीकरण में सीटू गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS) के साथ नमूना जांच पर आधारित है, जबकि छोटी बूंद में सभी दृश्य परिवर्तन एक सीसीडी कैमरे के लिए युग्मित एक खुर्दबीन की मदद से ऑनलाइन निगरानी कर रहे हैं, इस प्रकार एक पूर्ण सक्षम करने क्रिस्टलीकरण के सभी चरणों के दौरान प्रोटीन छोटी बूंद की जांच । पूरे प्रयोग में सीटू DLS माप का उपयोग अत्यधिक supersaturated प्रोटीन एक नए चरण में संक्रमण समाधान की एक सटीक पहचान-क्रिस्टल नाभिक के गठन की अनुमति देता है । प्रोटीन nucleation चरण की पहचान करके, क्रिस्टलीकरण प्रोटीन microcrystals के उत्पादन के लिए बड़े प्रोटीन क्रिस्टल से अनुकूलित किया जा सकता है । प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल precipitant अतिरिक्त, उच्च supersaturation उत्प्रेरण के लिए पानी वाष्पीकरण के रूप में सटीक स्वचालित कदम के आधार पर एक इंटरैक्टिव क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण से पता चलता है, और प्रेरित सजातीय nucleation के लिए नमूना कमजोर पड़ने या चरण संक्रमण पलटना ।
पिछले कुछ वर्षों में, प्रोटीन सूक्ष्म और nanocrystals के विकास पर कब्जा कर लिया है प्रोटीन का ध्यान क्रि समुदाय, विशेष रूप से धारावाहिक Femtosecond क्रि (SFX) के सतत विकास के साथ । कारण उपंयास एक्स रे विकिरण स्रोतों की प्रतिभा और सफल अब तक प्राप्त परिणामों के आधार पर, सूक्ष्म प्रोटीन और nanocrystals के उत्पादन उच्च प्रासंगिकता के बन गया है, ऐसी क्रिस्टलीय निलंबन की तैयारी पर एक उच्च मांग खड़ी 2 , 3. छोटे क्रिस्टल आकार-मुक्त इलेक्ट्रॉन पराबैंगनीकिरण (XFELs) पर डेटा संग्रह के लिए आवश्यक सीमा और प्रयोगात्मक beamtime की सीमित उपलब्धता के कारण, नमूना लक्षण वर्णन से पहले डेटा संग्रह के लिए आवश्यक है । सबसे आम तकनीक प्रोटीन सूक्ष्म या nanocrystal निलंबन की विशेषता के लिए अब तक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और एक्स-रे पाउडर विवर्तन हैं ।
अब तक, कई दृष्टिकोण छोटे माइक्रोमीटर रेंज में आयामों के साथ प्रोटीन क्रिस्टल की भारी मात्रा में उत्पादन करने के उद्देश्य के साथ आम क्रिस्टलीकरण तरीकों से अनुकूलित किया गया है । बैच विधि तेजी से उच्च केंद्रित प्रोटीन और precipitant समाधान के मिश्रण के लिए प्रयोग किया जाता है, इस प्रकार एक उच्च supersaturated चरण के लिए नमूना समाधान मजबूर जहां nanocrystallization4इष्ट हो सकता है । अंय तरीकों के लिए एक क्रिस्टल घोल, जो nanocrystalline निलंबन के रूप में सेवा के लिए डेटा संग्रह5के लिए इस्तेमाल किया जा सकता फार्म बड़े प्रोटीन क्रिस्टल कुचल शामिल हैं । हालांकि, परिणाम कभी-कभार घटी विवर्तन गुणवत्ता में परिणाम हो सकता है, के रूप में बिगड़ा क्रिस्टल आंतरिक आदेश कम है । Nanocrystallization मुक्त अंतरफलक प्रसार पर आधारित भी एक उपलब्ध विकल्प है, जहां प्रोटीन समाधान छोटी मात्रा में एक उच्च ध्यान केंद्रित precipitant समाधान3में जोड़ा जाता है । हालांकि, सभी तकनीकों के बीच, सबसे कुशल तरीकों को बैच क्रिस्टलीकरण और अधिक अभिनव जोड़ तोड़ भाप का उपयोग कर-बैठे बूंदों में प्रसार विधियों6।
आम तौर पर, एक प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण के लिए एक ऊर्जा बाधा nucleation समर्थन करने के लिए पार किया जाना चाहिए आदेश में एक ऊष्मा स्थिर राज्य से supersaturation और अंत में एक चरण संक्रमण प्रेरित करने के लिए प्रोटीन समाधान ले जाने के लिए, कुछ प्रोटीन समाधान से संबंधित चर को संशोधित करने की आवश्यकता है । इस तरह के चर आम तौर पर कर रहे है प्रोटीन समाधान की एकाग्रता, पर्यावरण परिवर्तन (जैसे, तापमान, आर्द्रता), विलायक विशेषताओं (जैसे, पीएच, ईओण ताकत), एकाग्रता और बफर गुण, आदि7 ,8 नमूना पैरामीटर जो बदला जा सकता है की एक सिंहावलोकन आमतौर पर चरण आरेख के माध्यम से प्रतिनिधित्व किया है, जो प्रस्तुति के विभिंन तरीकों जैसे घुलनशीलता आरेख, nucleation चरण आरेख, या और भी अधिक विस्तृत की अनुमति वर्णन जहां तीन आयामी या अधिक जटिल आरेख8,9,10ध्यान में आ सकते हैं । चरण आरेख के सबसे अपील प्रकार आमतौर पर दो आयामी हैं, जहां मुख्य चर एक और पैरामीटर के एक समारोह के रूप में प्रोटीन एकाग्रता है, जबकि शेष मापदंडों लगातार6,11रखा जाता है । एक बार एक या कुछ नाभिक का गठन कर रहे हैं, बड़े क्रिस्टल थोक समाधान से अतिरिक्त प्रोटीन लेने के द्वारा विकसित कर सकते हैं । जब सूक्ष्म और nanocrystal उत्पादन के लिए लक्ष्य, इस तरह के एक पारंपरिक क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण संभव नहीं है और क्रिस्टल की छोटी संख्या के कारण है कि समाधान में मौजूद हैं । Nanocrystalline निलंबन आमतौर पर क्रिस्टलीय संस्थाओं में अमीर होना है, इस प्रकार क्रिस्टलीकरण मार्ग को पुनः समायोजन किया जाना है, इस तरह के नमूने में मौजूद nucleation घटनाओं की एक maxima है । परिणाम में, यह कुछ नए की जांच की आवश्यकता है, अब तक बेरोज़गार प्रोटीन के लिए nucleation रास्ते, जो भी अभी तक पूरी तरह से12,13समझ में नहीं आ रहे हैं । चरण आरेख पहले उल्लेख किया बुनियादी बातों के आधार पर, शास्त्रीय सिद्धांत एक नई परिकल्पना है, जहां nucleation एक दो कदम तंत्र के रूप में वर्णित है के लिए विस्तारित किया गया है: पहले, एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता के लिए एक संक्रमण जगह लेता है (घने तरल चरण) और दूसरा, एक घने अमीर चरण से एक उच्च आंतरिक आदेश (जाली वास्तुकला के साथ क्रिस्टल नाभिक)14,15,16के लिए एक संक्रमण । प्रोटीन क्रिस्टलीकरण कई कारकों के प्रति संवेदनशील है, और इसलिए जब क्रिस्टलीकरण व्यंजनों अलग आकार क्रिस्टल में परिणाम के लिए पुनः समायोजन कर रहे हैं, व्यंजनों हमेशा पिछले ज्ञान पर भरोसा नहीं कर सकते । नई अंतर्दृष्टि प्रत्येक व्यक्ति को प्रोटीन लक्ष्य के लिए स्थापित करने की आवश्यकता: बफर संरचना का समायोजन, शुद्धता और नमूने की स्थिरता, प्रोटीन घुलनशीलता का सटीक ज्ञान, आदि
गतिशील प्रकाश कैटरिंग आज विश्लेषण और प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रक्रियाओं के अनुकूलन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है, कणों कि जांच की जा सकती है की एक विस्तृत आकार-सीमा के कारण: monomeric प्रोटीन से nanocrystals और छोटे microcrystals के लिए । विधि का कारनामा है कि समाधान में कणों Brownian गति से गुजरना और इस गति का औसत वेग कण आकार, उनके थर्मल ऊर्जा और माध्यम की चिपचिपाहट और कण ज्यामिति द्वारा निर्धारित किया जाता है । सबसे पहले, तरल माध्यम एक लेजर के उपयोग के साथ एक सुसंगत प्रकाश स्रोत से प्रबुद्ध है । प्रकाश कणों से बिखरे हुए एक हस्तक्षेप पैटर्न बनाने है । क्योंकि कण स्थाई गति में हस्तक्षेप पैटर्न भी स्थाई रूप से बदल रहे हैं । जब एक निश्चित दिशा में देख, तीव्रता उतार चढ़ाव मनाया जा सकता है । ये उतार-चढ़ाव अब Brownian प्रमोशन की वजह से कण आंदोलन दिखा रहे हैं. मापा तीव्रता उतार चढ़ाव से एक सहसंबंध समारोह (ACF) की गणना की है । ACF का एक विश्लेषण वेग वितरण के लिए एक उपाय (अधिक ठीक कणों के प्रसार गुणांक) और स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण का उपयोग करके दे देंगे, एक कण त्रिज्या वितरण में परिवर्तित किया गया है17. DLS कार्यक्षमता और कार्य सिद्धांत से संबंधित अतिरिक्त जानकारी विभिन्न प्रकाशनों और पुस्तकों में पाया जा सकता है18,19.
यहाँ हम लागू करते हैं और एक अद्वितीय स्वचालित क्रिस्टलीकरण डिवाइस का वर्णन, XtalController900, XtalController प्रौद्योगिकी के एक उन्नत संस्करण6, ठीक इंटरैक्टिव प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रयोगों की निगरानी के लिए विकसित. इस तकनीक की पहचान और वास्तविक समय में nucleation घटनाओं की ट्रैकिंग के लिए एक उच्च क्षमता से पता चलता है, क्रिस्टलीकरण चरण आरेख के माध्यम से एक सटीक पैंतरेबाज़ी की अनुमति । इस विशेष क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया के उद्देश्य के लिए प्रोटीन क्रिस्टलीकरण का अनुकूलन करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन सूक्ष्म और nanocrystals कि माइक्रो-केंद्रित सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे स्रोतों, इलेक्ट्रॉन विवर्तन, या उपयोग अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है प्राप्त करने के लिए है Sfx.
क्रिस्टलीकरण डिवाइस पर नजर रखने और एक क्रिस्टलीकरण एक संशोधित वाष्प-प्रसार विधि के आधार पर प्रयोग के दौरान महत्वपूर्ण मापदंडों में हेरफेर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इस तकनीक की निगरानी और सभी चरणों में एक प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रयोग स्कोरिंग की अनुमति देता है, उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए सटीक ज्ञान और क्रिस्टलीकरण चरण आरेख भर में प्रोटीन समाधान के नियंत्रण, सीटू DLS विश्लेषण में पर आधारित का नमूना सस्पेंशन.
क्रिस्टलीकरण डिवाइस एक प्रयोगात्मक चैंबर (चित्रा 1) एक सीसीडी कैमरा है कि क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है से जुड़े शामिल हैं । कैमरा एक अलग इज़ाफ़ा लेंस से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित है, लगभग २.५ µm के एक अधिक से अधिक स्थानिक संकल्प प्रदान । प्रयोगात्मक चैंबर के कोर समय के साथ नमूना वजन के विकास पर नज़र रखने के लिए एक ultrasensitive microbalance है । क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया एक बैठे-ड्रॉप वाष्प-प्रसार प्रयोग से मेल खाती है, जहां प्रोटीन ड्रॉप को एक सिलिकॉन coverslip पर रखा जाता है, जो microbalance पर रखा जाता है । छोटी बूंद, जो precipitant अलावा, पानी की वजह से कर रहे हैं के वजन परिवर्तन के आधार पर, या नमूना वाष्पीकरण, microbalance समय के साथ प्रोटीन और precipitant एकाग्रता की तत्काल गणना के लिए एक एल्गोरिथ्म के लिए एक सटीक इनपुट देता है . इसके अलावा, ऐसे तापमान और सापेक्ष आर्द्रता के रूप में महत्वपूर्ण क्रिस्टलीकरण मापदंडों ठीक नजर रखी है और नियंत्रित कर रहे हैं ।
एक क्रिस्टलीकरण प्रयोग करने के लिए, डिवाइस दो सूक्ष्म खुराक प्रणालियों (संपर्क मुक्त piezoelectric पंपों) है कि precipitant और पानी के अलावा के लिए एक picoliter पैमाने पर काम से सुसज्जित है । पदार्थ की इतनी छोटी मात्रा के साथ काम करके, एकाग्रता ढाल और प्रोटीन छोटी बूंद के भीतर संवहन घटना को कम कर रहे हैं । piezoelectric पंपों की मुख्य भूमिका precipitant या पानी के अलावा, उदाहरण के लिए बाद प्रोटीन छोटी बूंद के प्राकृतिक वाष्पीकरण के लिए मुआवजे के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है । माइक्रो-खुराक सिस्टम सुविधाओं का एक सेट है, जो एक पदार्थ के अलावा हुक्म कर सकते हैं. ऐसी सुविधाओं में शामिल हैं: एक पदार्थ जोड़ने के लिए दोहराव दर, बूंदों की संख्या प्रति सेकंड जोड़ा, चौड़ाई और पदार्थ धारा पथ, आदिकी ऊंचाई इसके अलावा, पंपों की स्थिति को मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है, प्रोटीन छोटी बूंद में पदार्थों के अलावा के लिए एक सटीक स्थिति के लिए उपयोगकर्ता को सक्षम करने.
अद्वितीय प्रतिक्रिया क्रिस्टलीकरण ड्रॉप की हेरफेर नियंत्रित सीटू DLS डेटा है, जो पूरे प्रयोगात्मक प्रक्रिया भर में प्रोटीन oligomeric राज्य में संभव परिवर्तन दिखा सकते है द्वारा हासिल की है । तकनीक समय पर कण आकार वितरण के निरंतर मूल्यांकन की अनुमति देता है, इस प्रकार अज्ञात प्रोटीन से संबंधित तंत्र का खुलासा । DLS प्रकाशिकी उपकरण रणनीतिक coverslip क्षेत्र के नीचे रखा गया है, डिटेक्टर और लेजर बीम coverslip के माध्यम से पारित करने की अनुमति है और आगे एक में प्रोटीन छोटी बूंद के माध्यम से सीटू फैशन; इसलिए, केवल छोटी बूंद के भीतर परिवर्तन DLS पथ से दर्ज की गई हैं । आसान हैंडलिंग की अनुमति देने के लिए, डिवाइस दो उद्घाटन: coverslip और एक शीर्ष ढक्कन जो हटाया जा सकता है की एक इष्टतम स्थिति के लिए एक सामने दरवाजा है, ताकि उपयोगकर्ता सूक्ष्म खुराक प्रणालियों की शूटिंग की स्थिति को समायोजित करने के साथ ही सटीकता के साथ स्थापित कर सकते है एक नया प्रोटीन डीआरओ plet पर coverslip ।
aforementioned डिवाइस का उपयोग कर इंटरैक्टिव क्रिस्टलीकरण विधि प्रोटीन क्रिस्टल के आकार नियंत्रित उत्पादन के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है । हालांकि कई क्रिस्टलीकरण तरीके वर्तमान में उपलब्ध हैं, अंदर सघन तंत्र के बारे में जानकारी ही आसानी से प्राप्त नहीं है । सामांय में, पारंपरिक क्रिस्टलीकरण के तरीकों को लागू करने क्रिस्टलीकरण चरण आरेख में एक समाधान के केवल सीमित नियंत्रण की अनुमति देता है, अपने पाठ्यक्रम को बदलने की केवल कुछ संभावनाओं के साथ एक बार एक प्रयोग शुरू कर दिया है । जबकि एक क्रिस्टलीकरण प्रयोग प्रदर्शन और इस तरह के एक स्वचालित क्रिस्टलीकरण सीटू DLS, ज्ञान का एक बड़ा सौदा के साथ युग्मित प्रौद्योगिकी चरण आरेख में संक्रमण के बारे में प्राप्त की है । सामान्य रूप से, अमली हाला और सजातीय nucleation की प्रेरण के परिणामस्वरूप क्षेत्र चरण आरेख में एक-दूसरे के करीब हैं । इसलिए, इसके कण वितरण के बारे में वास्तविक समय की जानकारी के आधार पर एक क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद के पाठ्यक्रम हेर-फेर करके, यह धीरे से nucleation की ओर क्रिस्टलीकरण शर्तों का समायोजन करके एक प्रोटीन की वर्षा से बचने के लिए संभव है और क्रिस्टल गठन ।
आजकल, कई क्रिस्टलीकरण की स्थिति precipitant समाधान जहां पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) डेरिवेटिव व्यापक रूप से मौजूद हैं शामिल हैं । इस तरह के यौगिकों आमतौर पर एक उच्च चिपचिपाहट जो pipetting या वितरण के लिए कठिनाइयों के अधिकारी कर सकते हैं । वर्तमान मामले के अध्ययन में, सूक्ष्म खुराक सिस्टम है कि precipitant वितरण के लिए उपयोग किया जाता है बहुत पतली केशिकाओं कि picolitre वेतन वृद्धि के अलावा संभव बनाने लागू होते हैं । एक परिणाम के रूप में, वहां अत्यधिक चिपचिपा पदार्थ के साथ काम करने में कुछ सीमाएं हैं । पिछले प्रयोगों की एक श्रृंखला के भीतर, प्रणाली सकारात्मक निंनलिखित खूंटी derivates: PEG200 ५०%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010% का उपयोग कर परिणाम दिया है । हालांकि अभी तक केवल aforementioned समाधान परीक्षण किया गया, सूक्ष्म खुराक सिस्टम एक विशेष हीटिंग तंत्र है जो आदेश में एक समाधान की चिपचिपाहट कमी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता होते हैं । एक अंय कारक नमक समाधान है कि माना जाता है जब प्रोटीन precipitant के रूप में इस्तेमाल किया है । अत्यधिक ध्यान केंद्रित लवण के साथ काम करते समय, एक छोटी राशि सूक्ष्म खुराक प्रणाली के नोजल पर सघन कर सकते हैं, precipitant अलावा के दौरान सूक्ष्म खुराक पंप के सतही अवरुद्ध कारण; यहां तक कि जब एक बहुत ही उच्च सापेक्ष आर्द्रता प्रयोगात्मक कक्ष में मौजूद है । इस समस्या को दूर करने के लिए, प्रयोग को होल्ड पर रखने की आवश्यकता है ताकि नोजल से नमक हटाया जा सके । यह विशेष हैंडलिंग की आवश्यकता हो सकती है और precipitant अतिरिक्त चरण में त्रुटियाँ उत्पन्न हो सकती है ।
इस तरह के स्वचालित क्रिस्टलीकरण प्रयोगों प्रदर्शन जब हासिल किया जा सकता है कि मूल्यवान जानकारी के आधार पर, इस तकनीक को भी प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के भौतिक रसायन पहलुओं की जांच अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । nucleation और क्रिस्टल विकास प्रतिक्रिया दर काइनेटिक घटनाएं जो व्युत्पंन किया जा सकता है और समय निर्भरता एक प्रयोग से चित्रित जानकारी के आधार पर गणना कर रहे है जैसे तापमान, कण आकार के विकास, और प्रोटीन और precipitant एकाग्रता.
The authors have nothing to disclose.
लेखक यूरोपीय संघ के क्षितिज से धन स्वीकार २०२० अनुसंधान और अभिनव मैरी Sklodowska के तहत कार्यक्रम-क्यूरी संक्षिप्त “एक्स जांच” अनुदान समझौते No. ६३७२९५ और समर्थन BMBF अनुदान 05K16GUA के माध्यम से, और “हैंबर्ग Ultrafast के लिए केंद्र इमेजिंग-संरचना, गतिशीलता और मामले की परमाणु पैमाने पर नियंत्रण “ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) के उत्कृष्टता क्लस्टर.
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
Soft wipes | KIMTECH Science | ||
XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |