Här presenterar vi ett protokoll för kontrollerad produktion av protein microcrystals. Processen använder en automatiserad enhet som tillåter kontrollerad manipulation av flera kristallisering parametrar. Protein kristalliseringen är buret ut av kontrollerade och automatiserade tillägg av kristallisering lösningar samtidigt som övervakning och undersökning av RADIUS-fördelningen av partiklar i kristallisering droplet-programmet.
Automatiserad kristallisering av enheten är en patenterad teknik1 speciellt utvecklad för övervakning protein kristallisering experiment i syfte att just manövrera den kärnbildning och crystal tillväxt mot önskad storlekar av proteinkristaller. Kontrollerad kristalliseringen är baserad på prov utredning med i situ dynamisk ljus spridning (DLS) medan alla visuella ändringar i droplet-programmet övervakas online med hjälp av ett mikroskop som kopplas till en CCD-kamera, vilket möjliggör en fullständig utredning av protein droplet-programmet under alla stadier av kristallisering. Användning av i situ DLS mätningar i hela hela experimentet tillåter en exakt identifiering av mycket övermättad protein lösningen övergår till en ny fas – bildandet av crystal atomkärnor. Genom att identifiera protein kärnbildning scenen, kan kristallisation optimeras från stora proteinkristaller till produktion av protein microcrystals. Experimentell protokollet visar en interaktiv kristallisering strategi baserad på exakt automatiserade steg såsom fällningsmedel dessutom vattenavdunstning för inducerande hög övermättnaden, och provspädning för att bromsa inducerad homogen kärnbildning eller backning fasövergångar.
De senaste åren, har tillväxten av protein mikro- och nanokristaller fångat uppmärksamheten av röntgenkristallografi gemenskapen, särskilt med kontinuerlig utveckling av seriell femtosekund kristallografi (SFX). På grund av briljans av romanen röntgen strålning källor och baserat på framgångsrika resultat hittills, produktion av protein mikro – och nanokristaller blivit av hög relevans, poserar en hög efterfrågan på utarbetandet av sådana kristallina suspensioner 2 , 3. på grund av liten kristall-intervallet storlek krävs för datainsamling vid fri elektron lasrar (XFELs) och den begränsade tillgången på experimentell beamtime, prov karakterisering innan datainsamlingen är viktigt. De vanligaste teknikerna att karakterisera protein mikro- eller fysikalisk suspensioner är tills nu elektronmikroskopi och pulver röntgendiffraktion.
Flera metoder har hittills anpassats från vanliga kristallisering metoder i syfte att producera bulk mängder proteinkristaller med dimensioner i intervallet liten mikrometer. Metoden batch används för snabb blandning av hög koncentrerat protein och fällningsmedel lösningar, vilket tvingade provlösningen till en mycket övermättad fas där nanocrystallization kan vara gynnade4. Andra metoder inkluderar krossning stora proteinkristaller bildar en kristall slurry, som kan tjäna som nanokristallin suspensioner som ska användas för data collection5. Dock kan resultaten ibland resultera i minskad diffraktion kvalitet, som försämrade kristaller har lägre inre ordning. Nanocrystallization baserat på gratis gränssnitt diffusion är också tillgängliga alternativ, där protein lösning tillsätts i små mängder till en högkoncentrerad fällningsmedel lösning3. Men bland alla tekniker verkar de mest effektiva metoderna vara batch kristallisation och mer innovativa manipulativa tekniker med vapor-diffusion metoder i sittande droppar6.
I allmänhet för kristallisation av ett protein måste en energi barriär korsas för att stödja kärnbildning – det första termodynamiska steget i crystal bildandet. I för att flytta den protein-lösningen från en thermodynamically stabil stat till övermättnaden och slutligen för att framkalla en fas-övergång, vissa variabler med anknytning till protein lösningen måste ändras. Sådana variabler är oftast koncentrationen av protein lösningen, miljöförändringar (t.ex., temperatur, fuktighet), lösningsmedel egenskaper (t.ex., pH, jonstyrka), koncentration och buffert egenskaper, etc.7 ,8 en översikt över urval parametrar som kan ändras företräds vanligen genom fasdiagram, som tillåter olika lägen av presentation, såsom löslighet diagram, kärnbildning fasdiagram eller ännu mer detaljerad beskrivningar där tredimensionella eller mer komplexa diagram kan komma in i övervägande8,9,10. De mest tilltalande typerna av fasdiagram är vanligtvis tvådimensionell, där den viktigaste variabeln är protein koncentrationen som en funktion av en annan parameter, medan återstående parametrar hålls konstant6,11. När en eller några få kärnor bildas, kan större kristaller växa genom att ta upp ytterligare protein från bulk lösningen. När syftet för mikro- och fysikalisk produktion, är en sådan konventionella kristallisering strategi inte möjligt längre på grund av ett litet antal kristaller som finns i lösningen. Nanokristallin suspensioner har oftast att vara rik i kristallin enheter, således det kristallisering utbildningsavsnittet har justeras, sådan att det finns en maxima kärnbildning händelser i provet. I följd, kräver detta utredning av vissa nya, tills nu outforskade kärnbildning vägar för proteiner, som också är ännu inte helt förstått12,13. Baserat på fasen diagram grunderna som nämnts tidigare, den klassiska teorin har utökats till en ny hypotes, där kärnbildning beskrivs som en mekanism för två steg: först en övergång till en högre proteinkoncentration sker (tät vätska fas) och andra, en övergång från en tät-rik fas till en högre intern ordning (crystal kärnor med galler arkitektur)14,15,16. Protein kristallisering är känslig för många faktorer, och därför när kristallisering recept är återjusteras resultera i olika stora kristaller, recept kan inte alltid lita på tidigare kunskap. Nya insikter måste fastställas för varje enskilt protein mål: justering av buffert sammansättning, renhet och stabilitet av prov, exakt kunskap om protein löslighet, etc.
Dynamiska ljusspridning är idag en väletablerad metod för analys och optimering av protein kristallisering processer, på grund av en storlek-mängd partiklar som kan undersökas: från monomer protein nanokristaller och små microcrystals. Metoden utnyttjar att partiklar i lösningen genomgår Brownsk rörelse och att den genomsnittliga hastigheten på denna rörelse bestäms av partikelstorlek, sin värmeenergi och viskositet medium och partikel geometri. Först är det flytande mediet upplyst av en koherent ljuskälla med hjälp av en laser. Det ljus som sprids av partiklar bildas en interferensmönstret. Eftersom partiklarna är i ständig rörelse ändras interferensmönstret också permanent. När man tittar i en viss riktning, kan intensitet fluktuationer observeras. Dessa variationer visar nu den partikel rörelse orsakad av Brownsk rörelse. En autokorrelation funktion (ACF) beräknas från de uppmätta intensiteten fluktuationerna. En analys av ACF ger ett mått för velocity distribution (mer exakt den diffusionskoefficienten) av partiklar och med hjälp av Stokes-Einstein ekvation, omvandlas till en partikel radie distribution17. Ytterligare information om DLS funktioner och arbetssätt kan hittas i olika publikationer och böcker18,19.
Här vi tillämpar och beskriva en unik automatiserade kristallisering enhet, XtalController900, en uppgraderad version av XtalController teknik6, just utvecklats för att övervaka interaktiva protein kristallisering experiment. Denna teknik visar en hög potential för identifiering och spårning av kärnbildning händelser i realtid, vilket gör att en exakt manövrering genom kristallisering arrangera gradvisdiagrammet. Syftet med proceduren särskilt kristallisering är att optimera protein kristallisering för att få hög kvalitet protein mikro- och nanokristaller som är lämpliga för applikationer med hjälp av mikro-fokuserad synkrotron röntgenkällor, diffraktion, eller SFX.
Kristallisering enheten är utformad för att övervaka och manipulera avgörande parametrar under en kristallisering experiment baserat på en modifierad vapor-diffusion metod. Denna teknik tillåter övervakning och scoring ett protein kristallisering experiment på alla stadier, så att du har exakt kunskap och kontroll av protein lösningen under kristallisering arrangera gradvisdiagrammet, baserat på i situ DLS analys av provet upphängning.
Kristallisering enheten består av en experimentell kammare (figur 1) ansluten till en CCD-kamera som möjliggör realtidsövervakning av kristallisering droplet-programmet. Kameran är anpassad till Mikroskop utrustat med olika förstoring linser, som ger en maximal rumslig upplösning på cirka 2,5 µm. Kärnan i den experimentella avdelningen är en ultrasensitive microbalance för att spåra utvecklingen av provets vikt över tid. Förfarandet för kristallisering motsvarar ett sammanträde-drop vapor-diffusion experiment, där protein drop är placerad på en silikoniserad täckglas, som placeras på microbalance. Baserat på kroppsvikt och förändringar av droplet-programmet, som orsakas av fällningsmedel tillägg, vatten/additiva tillägg eller provavdunstning, ger microbalance en exakt ingång till en algoritm för omedelbar beräkning av protein och fällningsmedel koncentration över tid . Dessutom viktigt kristallisering parametrar såsom temperatur och relativ fuktighet exakt övervakas och kontrolleras.
För att utföra en kristallisering experiment, är enheten utrustad med två micro-dosering system (kontakta gratis piezoelektriska pumpar) som fungerar på en picoliter skala för fällningsmedel och vatten tillägg. Genom att arbeta med sådana små mängder av ämnet, minimeras de koncentration Övertoningarna och konvektion fenomenet inom protein droplet-programmet. Den huvudsakliga rollen av piezoelektriska pumpar är tillägget av fällningsmedel eller vatten, de senare till exempel används som ersättning för naturlig förångning av protein droplet-programmet. Micro-dosering systemen har en uppsättning funktioner som kan diktera tillägg av ett ämne. Sådana funktioner omfattar: andelen upprepning för att lägga till ett ämne, antalet droppar tillsatts per sekund, bredd och höjd av ämnet stream bana osv. Dessutom kan placera av pumparna justeras manuellt, så att du har en exakt position för tillägg av ämnen till protein droplet-programmet.
Unika feedback kontrollerade manipulering av kristallisering drop uppnås genom i situ DLS data, som kan visa möjliga ändringar i tillståndet protein Oligomera under hela experimentella förfarandet. Tekniken tillåter konstant utvärdering av partikelstorleksfördelning över tid, vilket visar okänt protein-relaterade mekanismer. DLS optik utrustningen placeras strategiskt under täckglas området, vilket gör att detektorn och laser strålen att passera genom täckglaset och vidare genom protein droplet-programmet i en i situ mode; därför registreras endast ändringar inom droplet-programmet från DLS sökvägen. För att möjliggöra enkel hantering, enheten har två öppningar: en dörr för en optimal placering av täckglaset och ett topplock som kan tas bort, så att användaren kan justera skjutställning av mikro-dosering system samt inställning med noggrannhet en ny protein dro plet på täckglaset.
Den interaktiva kristallisering metoden använder ovannämnda enheten är en tillförlitlig teknik för storlek-kontrollerade produktionen av proteinkristaller. Även om det finns för närvarande många kristallisering metoder, insiderinformation om kristallisation är mekanism själv inte enkelt kan uppnås. I allmänhet, tillåter konventionella kristallisering metoder endast begränsad kontroll av en lösning i kristallisering arrangera gradvisdiagrammet, med endast några möjligheter att ändra sin kurs när ett experiment har startat. Medan du utför en kristallisering experimentera och tillämpa sådan en automatiserad kristallisering teknik tillsammans med i situ DLS, en stor del kunskap erhålls om övergångar i arrangera gradvisdiagrammet. I allmänhet är de regionerna som resulterar i amorf fällning och induktion av homogen kärnbildning nära varandra i arrangera gradvisdiagrammet. Därför, genom att manipulera loppet av en kristallisering droplet baserat på realtidsinformation om dess fördelning, är det möjligt att undvika utfällning av ett protein genom att gradvis justera kristallisering villkoren mot kärnbildning och Crystal bildandet.
Numera omfattar många kristallisering villkor fällningsmedel lösningar där polyetylenglykol (PEG) derivat förekommer allmänt. Sådana föreningar har oftast en hög viskositet som kan ha svårigheter för pipettering eller dispensering. I förevarande fall studien gäller de mikro-dosering-system som används för fällningsmedel munstycket mycket tunna kapillärer som gör tillägg av pikoliter steg om möjligt. Följaktligen finns det vissa begränsningar i arbetar med högviskösa ämnen. Inom en rad tidigare experiment, systemet har gett positiva resultat med följande PEG derivat: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Även om hittills endast de ovannämnda lösningarna testades, innehåller mikro-dosering systemen en speciell värme mekanism som kan användas för att minska viskositeten hos en lösning. En annan faktor är saltlösningar som måste beaktas när den används som protein fällningsmedel. När du arbetar med högkoncentrerad salter, kan en liten mängd kristallisera på munstycket på mikro-dos systemet, orsakar ytliga blockering av mikro-dosering pumpen under fällningsmedel tillägg; även när en mycket hög relativ fuktighet är närvarande i experimentell kammaren. För att lösa problemet, måste experimentet parkeras så att saltet från munstycket kan tas bort. Detta kan kräva särskild hantering och kan ge fel i fasen fällningsmedel tillägg.
Baserat på den värdefulla information som kan uppnås när du utför sådana automatiserade kristallisering experiment, kan denna teknik också förlängas till studier som undersöker de fysikaliska aspekterna av protein kristallisering. Den kärnbildning och den crystal tillväxten reaktion är kinetic fenomen som kan härledas och beräknas utifrån den tidsberoende information avbildad från ett experiment som temperatur, tillväxten av partikelstorlek och protein och fällningsmedel koncentrationen.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner finansiering från EU: s Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogrammet under Marie Sklodowska-Curie Acronym ”X-Probe” Grant avtal nr 637295 och support via BMBF grant 05K16GUA, och den ”The Hamburg centrum för ultrasnabb Imaging – struktur, dynamik och kontroll av ärendet på den atomära skalan ”excellence kluster av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG).
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
Soft wipes | KIMTECH Science | ||
XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |