Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ניתוח מיקרו של איבר אמייל השן החותכת הלסת של חולדות נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים

Published: March 29, 2018 doi: 10.3791/57081
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

Summary

הבנת שינויים ואפשרות האפשר אמייל דורש לימוד פעילות ameloblast. כאן, אנו מתארים שיטה אמינה ועקבית לנתח מיקרו-איברים אמייל המכיל הפרשת ועל התבגרות-שלב ameloblasts העשויות לשמש עוד יותר כמותיים ואיכותיים בצרות.

Abstract

אמייל פגמים הנובעים תנאים סביבתיים ודרכי חייו הם הדאגה לבריאות הציבור בשל השכיחות הגבוהה שלהם. פגמים אלה הם תוצאה של פעילות שונה של תאים אחראי סינתזה אמייל בשם ameloblasts, אשר מציגים באיבר אמייל. במהלך amelogenesis, ameloblasts לעקוב אחר רצף ספציפי ומדויק של אירועים של התפשטות, בידול ומוות. חולדה וגדלות בהתמדה החותכות הוא מודל ניסיוני מתאים ללמוד במות פעילות ובידול ameloblast בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. כאן, אנו מתארים שיטה אמינה ועקבית לנתח מיקרו-אמייל איברים של חולדות נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים. Epithelia שיניים מיקרו-גזור מכילים ameloblasts הפרשה, התבגרות-בשלב זה עשוי לשמש עבור ניסויים איכותי, כגון מבחני אימונוהיסטוכימיה בחיי עיר הכלאה, כמו גם עבור כמותני כגון RT-qPCR RNA-seq, סופג המערבי.

Introduction

ליקויים התפתחותיים אמייל רבות העלולות לנבוע חשיפה חשיפה לרעלים סביבתיים ו/או סגנון חיים לא הולמת1,2,3,4. אפיון של שיבוש אירועי והמולקולות של amelogenesis באמצעות ההליך המתואר כיום יקדם את השימוש של פגמים אמייל וכתוצאה מכך כסמני מוקדם של חשיפה חשיפה לרעלים מספר, עשוי לעזור כדי לשקם את ההיסטוריה של בריאות כל מטופל במהלך תקופת הלידה כאשר האמייל הוא synthetized1,2. אמייל סינתזה ניתן לחלק לארבעה שלבים עיקריים בהתאם ameloblast פעילות5. הצעד הראשון regroups קודמן התפשטות תאים, pre-ameloblast. במהלך השלב השני, ameloblasts הבדיל מפרישים אמייל מטריקס חלבונים (פעימה), בעיקר amelogenin, enamelin, ameloblastin, הקובעות את עובי האמאיל הסופי. לפיכך, כל הפרעה של סינתזה EMP מוביל פגמים כמותית של האמייל. אחרי העדות של עובי אמייל מלא, מתחילה שלב ההבשלה. בשלב זה, מאפשר גידול crystallite אפטיט רוחב ועובי האמאיל להגיע היחס מינרליזציה הגבוהים שנמצאו רקמה ביולוגית, עם עד 96% לפי משקל. Disrupting האירועים המתרחשים במהלך ההבשלה הבמה להוביל איכותי אמייל פגמים. לבסוף, ameloblasts ייכנסו למצב של פוסט-התבגרות, הנקרא גם פיגמנטציה בחולדות, ואני עוברים אפופטוזיס במהלך התפרצות השן שהופך פגמים אמייל (אם בכלל) בלתי הפיך ובלתי הפיכה, ובכך פגמים מספקים פוטנציאל הקלטה רטרוספקטיבה של דגש על ameloblast. בחולדות, amelogenesis עוקב אחר רצף דומה של אירועים עם הייחוד שלהם החותכות הגדלים ללא הרף, מה שהופך אותם מודל מתאים ללמוד את התהליך הכללי של amelogenesis. לפיכך, כל הפרעה של amelogenesis גורמת שינויים אמייל איכותי ו/או כמות, בהתאם חלון הזמן של האירוע disrupting. במובן זה, חשיפה דיוקסין, עופרת, שיבוש אנדוקריניות כימיקלים משבשי כגון ביספנול A (BPA), genistein, vinclozolin, הוכחו ליצירת אמייל hypomineralizations1,2,3 ,-6,-7,-8. אסימטרי כתמים אטום לבנים אותרו על החותכות של חולדות נחשפים מנה BPA במינון נמוך במהלך התקופה העוברית, החודש הראשון לאחר הלידה1. פגמים אלה אמייל, חולדות, ואלה של השן החותכת טוחנת האנושי hypomineralization (MIH), חולקות מאפיינים דומים קליני, מבניים הביוכימי. MIH היא פתולוגיה תיאר לאחרונה אמייל השיניים, על אילו האטיולוגיה עדיין נשאר לא ברור9,10 למרות גורמים סיבתי רבים שהיה המשוערות9,10,11 ,12.

פתולוגיה hypomineralization אמייל חשוב נוסף בשל גורמים סביבתיים היא פלואורוזיס שיניים (DF), אשר הוא התוצאה של עודף פלואוריד הקליטה (> 0.1 מ"ג/ק"ג/יום)13,14. המקור העיקרי של פלואוריד הוא מי שתייה או שיושלם או באופן טבעי מועשר פלואוריד. פלואוריד הוא רשם גם לעתים קרובות כדי למנוע עששת, אבל מינון מניעתי רק 50% נמוך יותר מאשר אחת הרעילות (≤0.05 מ"ג/ק"ג/יום). MIH ו- DF, שתי פתולוגיות בתדירות גבוהה כתוצאה מחשיפה לגורמים סביבתיים, עשויים להציג תכונות משותפות צריך להיות מאופיין בשל potentiation ההשפעות hypomineralizing של פלואוריד בשילוב עם חשיפה לרעלים אחרים כגון והריון2 . או אמוקסיצילין15...

ניתוח מיקרו של עכברוש אמייל איבר המכיל ameloblasts בשלבים שונים בידול יעזור להבין את מנגנון הפעולה של מולקולות מסוגל לשבש את פעילות ameloblast, לגרום למומים אמייל להיות מאובחנים לאחר התפרצות השן. במילים אחרות, אפיון שינויים של האמייל ג'ין אמייל וביטוי מטריקס הרכב עקב חשיפה לרעלים סביבתיים מאפשר את בנייתו מחדש של ההיסטוריה של חשיפה חשיפה לרעלים, ומקלה על איכות הסביבה, בטיחות פיקוח עבור הציבור בריאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל בעלי החיים השתמשו במחקר הנוכחי היו נשמרים על פי הנחיות טיפול ושימוש חיות מעבדה צרפתית משרד החקלאות (A-75-06-12).

1. בעלי חיים חשיפה חשיפה לרעלים

  1. לפני ביצוע פרוטוקול זה, לקבל אישור מוסדי נחוץ ולהיות בטוח לקיים את כל הנחיות טיפול בבעלי חיים.
  2. להחיל את העיצוב של פרוטוקול מחקר המאפשר החוקה של קבוצות ניסוי שונות על מנת לבדוק את השפעת molecule(s) חקר על ameloblast הפרשת והבמה ameloblast ההבשלה. . ארבע קבוצות של חולדות Wistar זכר היו היוו בהתאם את חשיפתם פלואוריד (NaF) בשילוב או לא עם BPA (איור 1 א')2. כל בעלי החיים היו שנצפו, גזור ביום 65 (איור 1B).

2. ניתוח של המי-הלסת של חולדות למבוגרים

  1. המתת חסד חולדות על ידי חנק2 CO, לחלופין ואחריו עריפת ראש בראש נפרד משאר חלקי הגוף. לחשוף חולדות CO2 עבור 5 דקות בתוך תיבת ייעודי16.
  2. הסר את כל העור התחתון השפתיים באמצעות אזמל #11 כדי לקבל גישה נוחה אל החותכות התחתון.
  3. עם האזמל אותו, אעשה חתך בין החותכות התחתון שני עם לחץ קלה, הלסת התחתונה יפוצל לשני חצאים.
  4. לחתוך המפרק הלסתי זמני עם איזמל כדי לנתק את הלסת, להחזיק את המי-לסת תחתונה עם פינצטה משובחים.
  5. לחתוך את הרקמות הרכות שמסביב עם איזמל ולהסיר כל השרירים הגידים, הרצועות באמצעות המגרד של עד העצם נקי לחלוטין.

3. בידוד של השן החותכת17,18

  1. בזהירות לגלח את העצם על-ידי הצבת הלהב המקביל לציר האורך העיקריים של השן החותכת. התחל הרכס הגרמי בקרבת קצות השן החותכת (proximal end) עד לסוף השן החותכת ליד הלולאה צוואר הרחם. התנועה החתך ממשיך מ- proximal לכיוון דיסטלי.
  2. לבצע חתך הראשון יש הלולאה צוואר הרחם עם האזמל כדי להסיר את gonion של המי-הלסת התחתונה, היתר מורידה השן החותכת בקלות מבלי להזיק הלולאה צוואר הרחם או השלב הפרשה של ameloblasts (הקו האדום איור 2).
  3. עושים חתך השנייה מתחת ל טוחנת והוסף את האזמל בין העצם לבין השטח המדיאלי של השן החותכת. כאשר כל עצם הבסיס מורם, לסובב מסובבת כלפי חוץ השן החותכת ולהוריד אותו בקפידה כדי להימנע אמייל רקמות איברים לפגום באמצעות פינצטה משובחים.

4. ניתוח מיקרו של איבר אמייל תחת עדשת המשקפת

  1. ירידה µL 200 פוספט מלוחים מאגר (PBS 1 X) על השן החותכת באמצעות פיפטה. קח השן החותכת עם פינצטה בסדר עם השטח שפתיים פונה כלפי מעלה. להפוך את אזמל לסמן בין השקופה את החלקים כתום של הרקמה. הסימן הזה מקביל במקום לבן הבסיסי שבו הוא נצפות לאחר מכן (איור 2).
  2. לגרד, החופר או כלי מקביל, השטח תא מסימן האזמל כדי סוף הפסגה המתאימה הפרשת ameloblasts הבמה (חסר צבע), וממנו הסימן אזמל עד הקצה של השן החותכת עבור ameloblasts הבמה (כתום) ההבשלה.
  3. להסיר את הרקמה 2-מ מ המקביל לשלב המעבר, כפי שתואר קודם לכן19. אל תפתח השן החותכת במהלך אמייל חיתוך איברים כדי למנוע זיהום על ידי מזנכימה.
  4. חותכים את הלולאה צוואר הרחם ממוקם באופן מיידי בחלק הפסגה של השן החותכת (איור 2) כפי שתואר לעיל20.
  5. לאסוף אותו ב- 10% הפתרון פורמלין או פירוק לחקירות נוספות (ראה טבלה של חומרים).

5. אוסף של רקמות איברים אמייל מופרדים לחקירה נוספת

  1. . הורד שתי מאיות µL מאגר PBS 1 X על השן החותכת.
  2. עם להב סכין #11, בזהירות ניתוק בתאי אפיתל שיניים בהדרגה במאגר, בנפרד עבור כל שלב בעזרת אזמל שנשמעה בעבר.
  3. תא ה-RNA, חלבון עקירות, הכניסו את הרקמה פתרון פירוק המאפשר הפקת גם חלבונים וגם RNAs (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: להכין RNAs באיכות גבוהה על-ידי להפוך הרקמה-החופרת בצינור ולאחר מכן שיוף התאים עד קבלת תערובת אחידה. התערובת הוא מוכן עקירות RNA וחלבון לפי הנוהל של היצרן, אשר היה שתואר לעיל2,8,17. בדרך כלל, על סך µg 5-10 RNAs 150 חלבונים הכולל µg התקבלו עבור כל הכנה.
  4. עבור ניתוחים היסטולוגית, אימונוהיסטוכימיה (IHC), בחיי עיר הכלאה (איש), לשים את שכבת תאים בפורמלין 10% 2 h, אז החנות ב 4 ° C ב- PBS 1 X. הרקמה ואז ניתן להטביע את השעווה/פרפין או רקמות OCT למקטעי קפוא.
  5. EMP עקירות, סעו השן החותכת עם פינצטה משובחים. לאחר חשיפה לאוויר (התייבשות קלה) קצר, כתם לבן יהיה גלוי סביב החלק האמצעי של המשטח שפתיים של השן החותכת, אשר מייצג את אתחול של מינרליזציה האמייל. הנקודה הלבנה הזאת תואמת את המעבר- / בתחילת שלב ההבשלה של ameloblasts, אז בשביל זה כמחוון החילוץ של פעימה21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רבים אמייל פגמים, כגון פלואורוזיס שיניים12,13, עשוי לנבוע תנאים סביבתיים עקב ספיגת יתר פלואוריד או אמייל hypomineralization הדומה MIH עקב חשיפה כמה והריון1, 7,22. פגמים אלה, אמייל התפתחותית לשכפל השפעול על חולדות (איור 1)1,2,7,23,24. חמי חולדה-הלסת התחתונה מכילה חותכת בודדת הופרדו הטוחנות שלושה על ידי פער נקרא דיאסטמה. השן החותכת גדל ללא הרף מכיל שני על בסיס מינרלים מן הרקמות של דנטין המיוצר על ידי odontoblasts, את האמייל מיוצר על ידי ameloblasts נוכח באיבר אמייל עם תאים אפיתל אחרים (איור 2). השן החותכת מכרסמים נראה מודל מתאים ללמוד את amelogenesis שכן, בניגוד הטוחנות, הוא אינו מכיל כל ameloblast התפשטות/בידול השלבים לאורך החיים של החיה.

איבר מיקרו-גזור אמייל השן החותכת עכברוש יכול להיות מופרדים לפי שלב הבידול ameloblast עם העזרה של כתם לבן המופיע לאחר התייבשות קלה, ו זה עשוי לשמש כמחוון של הבמה-המעבר בין הפרשת - ו התבגרות-שלבים19,21,25. האיכות של מיקרו-גזור האמאיל רקמות ניתן לבדוק על ידי מאסון Trichrome של צביעת (איור 3 א). התבוננות מיקרוסקופית הראה האמייל אופייני לתאי האפיתל פאליסייד ameloblast. העדר של זיהום mesenchymal היה כתביהם היעדר קולגן ירוק מכתים (איור 3A) ועל חופש הביטוי (איור 3B). רקמות אלה מיקרו-גזור עשוי לשמש qualitative analyses IHC (איור 3C) ו איש, כמותני כגון RT-qPCR (איור 3B), ה-RNA-seq סופג המערבי. לדוגמה, קולטן האנדרוגן היה מותאם במיוחד ameloblasts בשלב ההבשלה באמצעות של נוגדנים ספציפיים נגד חלבון זה (ראה טבלה של חומרים) (איור 3C)8. השלבים בידול ameloblast הראשי מאופיינים על ידי גנים ספציפיים ביטוי דפוסי26 שיכול להיות מזוהה על מיקרו-גזור אמייל איברים. לדוגמה, הפרשת-שלב ameloblasts אקספרס enamelin2 ולבטא את שלב ההבשלה ameloblasts 4 Kallikrein (KLK4) (איור 3B). הם מכילים רמות גבוהות של קשירת ברזל המקנים את היכולת לאחסן כמויות גבוהות של ברזל, האחראית על הצבע הכתום של האמייל27.

ניתן בקלות בעקבות פלואוריד שיבוש amelogenesis על ידי התבוננות תא lysates עבור ה-RNA עקירות: לשלוט בשלב ההבשלה lysates היו אורנג ', ואילו אלה שטופלו פלואוריד היו אור צהוב. חסר צבע (איור 4A). ניתוח של רמות ה-RNA מופק בשלב ההבשלה מיקרו-גזור אמייל איברים הראה KLK4 למטה-רגולציה על טיפול בפלואוריד (איור 4B), אשר היה גם שמעידים ניתוח transcriptomic בקנה מידה גדול דיווח לאחרונה2. חלבונים ספציפיים הביע גם על ידי הפרשת או התבגרות-שלב ameloblasts עשוי גם להיות מקומי באמצעות איברים מיקרו-גזור אמייל28. לדוגמה, קולטן האנדרוגן במיוחד מקומי באמצעות מיקרו-גזור אמייל איברים8,28.

Figure 1
איור 1: אמייל פגמים שנצפו על חולדות נחשפים פלואוריד (NaF) בשילוב או לא עם ביספנול A (BPA). (א) ייצוג סכמטי אחת מארבע הקבוצות ניסיוני של חולדות Wistar היוו לצורך המחקר הנוכחי, קבוצות אשר תלויים לתנאי הסביבה שונה חלה על החולדות. מיום הריון 1 (fecondation) עד היום ואיחולי 21 (P21), 5 µg/kg BPA ב- 0.5 מ של שמן תירס היה בעל פה מנוהל על-ידי gavage מדי יום לנשים בהריון ואמהות מניקות, ואילו שמן תירס לבד ערכנו את קבוצת הביקורת. לאחר הגמילה, כל דאם היה מזוהה, מופץ באופן אקראי לאחת משתי הקבוצות המתאימות. חולדות זכרים היו שנבחר עבור מחקר זה, נחשפים 5 µg/kg/day BPA לבד, 5 מ מ NaF לבד, אולי שניהם המינון אותו עד 65 ימים לאחר הלידה (P65). קבוצת הביקורת קיבלה הממס לבד. (B) ביום כמחנכת 30 (P30), חולדות כרוני חשופים במינון נמוך BPA הציג כתמים לבנים אטום ו הפנוטיפ שיניים ניכר כבר לא היה מזוהה עם עכברים בוגרים (P65). להקות כתום ולבן לסירוגין של טיפוסי שיניים פלואורוזיס (DF) נצפו אצל חולדות שטופלו NaF. הפנוטיפ חמורות יותר מאופיין על ידי שינוי צבע השן החותכת חשוב מזוהה אצל חולדות נחשפים שני סוכנים. Incisal תפוז הומוגנית אמייל והשאור שליטה חולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ייצוג סכמטי של ההליך. בידוד של ameloblasts מן הפרשה, ההבשלה-בשלבים מאיבר אמייל מיקרו-גזור. חמי חולדה-הלסת התחתונה מכילה שלוש השיניים הטוחנות של השן החותכת גדל ללא הרף עם שני על בסיס מינרלים מן הרקמות, דנטין המיוצר על ידי odontoblasts (בצהוב) את האמייל מיוצר על ידי ameloblasts (בכתום). כאשר השן החותכת בודד ולאחר מעט מיובשת, כתם לבן ליד החלק הפסגה של המשטח שפתיים הוא נצפות. היא מסייעת לזהות את שלב ameloblast של בידול, כפי שהוא מכסה את השלב במעבר בין הפרשת - ועל התבגרות-בשלבים. האיבר אמייל היא בקפידה מיקרו-גזור, מופרדים ב-3 חלקים בהתאם בשלבים בידול ameloblast בשימוש גם עבור ניתוח (היסטולוגית) איכותי או כמותי גישות ניסיוניות (ניתוחים mRNA וחלבון מאת RT-qPCR, המערבי סופג, בהתאמה).

Figure 3
איור 3: בקרת איכות של מיקרו-גזור הפרשת - ועל התבגרות-שלבי אמייל איברים. עכברוש אמייל איברים מופרדים זה מזה בשלושה חלקים המכילים הלולאה צוואר הרחם, הפרשת-שלב ameloblasts ו ameloblasts שלב ההבשלה. (A) מאסון Trichrome מכתים של מיקרו-ביתר חלקי הראה בתאי אפיתל שונים ועל חוסר תאים mesenchymal. סולם בר, 100 מיקרומטר. (B) ניתוח ביטוי גנטי על ידי ניסויים RT-qPCR של RNAs שחולצו מן הפרשה, התבגרות-שלב אמייל איברים. דפוס אופייני של enamelin ו KLK4 ביטוי נצפתה, כמו גם היעדר קולגן 1 צפוי בתאים mesenchymal. פלורסנט (C) צביעת בשימוש נוגדן (ראה טבלה של חומרים) במיוחד מכוונת כנגד קולטן האנדרוגן באה לידי ביטוי רק על ידי בשלב ההבשלה ameloblasts. סולם בר, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תוצאות נציג שהושג עם עכברוש מיקרו-גזור אמייל איברים. (א) כאשר התאים היו resuspended במאגר פירוק לחילוץ RNA (ראה טבלה של חומרים), רקמת ההבשלה-שלב המכילים פיגמנט ameloblasts הופיע כתום בתנאי בקרה ו BPA-שטופלו. החלק הפרשת-שלב הוא צהוב, לא משנה התנאים. בטיפול NaF, כל lysates היו אור צהוב. חסר צבע. (B) דוגמה RT-qPCR נתונים שהושגו עם RNA גלמי אמייל איברים של חולדות נאספו בתנאי סביבה שונים. NaF למטה מוסדר KLK4 בשלב ההבשלה, והגדילה BPA ביטוי enamelin הפרשת-שלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ameloblast שינו פעילות ו/או התפשטות ameloblast שיבשו, בידול, להוביל תהליכי התבגרות לפגמים אמייל בלתי הפיך, בתורו, אפיון אמייל פגמים עשוי לעזור לפתח הבנה של שינו פעילות ameloblast במהלך amelogenesis. כך, המחקרים על זגוגית מבודדת איברים הם דטרמיננטה התירי פתולוגיים האירועים שהובילו אמייל פגמים לא משנה מה מוצאם, סביבתי או גנטית.

טכניקה זו במקור תואר על-ידי הילר. et al. 17 ו רובינסון. et al. 18, והוא משמש כדי להדגים השפעות ספציפיות על כל שלב של בידול איברים אמייל. זה ואז הותאם עבור השדה האלקטרומגנטי עקירות19,24,25. אנחנו כרגע להשתמש בהליך זה כדי להפריד בין החלקים העיקריים של האיבר אמייל ולאסוף דגימות ביולוגיות בתנאים סביבתיים שונים כדי לנתח RNAs וחלבונים (ואולי cellular "אינטרה" תוספת חלבונים) באמצעות כמותיים ואיכותיים טכניקות.

הדיוק של ניתוח המיקרו דורשת הכשרה משמעותית לפני היישום שלה, כדי לאפשר את האוסף של האיבר אמייל משומר, כדי למנוע זיהום mesenchymal לכל הרס רקמות. יתר על כן, זה די קשה להצליח עם עכברים או חולדות קטנות. אכן, החלק המטעה של ההליך הוא לשמר את רקמת מורפולוגיה, היסטולוגיה, וכיוון IHC, איש, לעומת טכניקות קלאסיות מתבצע בדרך כלל על החותכות עבור שתי הגישות האלה.

אחד היתרונות העיקריים של שימוש האיבר אמייל מיקרו-גזור בהשוואה demineralized כל המי-הלסת התחתונה הוא תחזוקה אמייל RNAs חלבונים בזכות העדר בכל אוסף שלאחר הטיפול. האיבר מיקרו-גזור אמייל יכול ישירות לשמש עבור כל הטכניקות של ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה ללא בחירה או culturing תאים. היתרון של הליך זה הוא המדידות ישירה של רמות ה-RNA וחלבון שמשקף את כמויות ספציפי ameloblasts ויוו בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגי. בנוסף, כמה חשיפה לרעלים לפעול על הבמה בידול אחד במיוחד, כפי שקורה עם פלואוריד, אשר פועל על שלב ההבשלה ameloblasts ולא על הפרשת-שלב אלה23,24. ניתוח המיקרו של האזורים השונים של האיבר אמייל מאפשר המחקר של מנגנון הפעולה של כמה חשיפה לרעלים או גנים ספציפיים ההשפעות אשר עשוי להיות בלתי מורגשת על האיבר כולו אמייל או על תאים מבודדים. אכן, ameloblasts, הבדיל במיוחד אלה שקשה לאסוף, תרבות במבחנה, אשר הוא העידו על ידי חוסר של מחקרים דיווחו על הנושא. בתאי אפיתל שיניים רק כי ניתן לבודד pre-ameloblasts הינם תאי גזע צוואר הרחם לופ20. בנוסף, הקווים תא ameloblastic שדווחו, בעיקר ראט הכובע-729, העכבר LS830, ALC31ו- AM-1 האנושי32, לעתים להפסיד את מאפייני בידול ויוו ameloblasts: הם מבטאים מטריצה חוץ-תאית חלבונים (פעימה) כגון ameloblastin באופן דומה כדי הפרשת-שלב ameloblasts, גם KLK4 או SLC26A4/pendrin, כמו בשלב ההבשלה ameloblasts8, אך אינם מצליחים יותר או פחות amelogenin אקספרס, mineralize מטריקס לייצר אמייל. הבידוד בין שיניים אפיתל תאי גזע עובריים ameloblasts עלולה להוות אופציה ללמוד את השלב הראשון של בידול ameloblast, אבל המחקרים על תהליך מינרליזציה אמייל מסוף לא יכול להתבצע בצורה שונה מאשר עם אין ויוו מודלים. זה החלק האחרון של amelogenesis הוא דטרמיננטה לאיכות אמייל. ואילו גורמים מרכזיים המעורבים בהתפתחות השיניים, כגון Bmp, Msx, Fgf, חריץ, ששש, ונ ט מתואר טוב33,34, המעורבים בחוזקה אמייל איכותי עדיין הם הבינו. אפיון גורמי מפתח באיכות אמייל יש צורך לפענח עששת שיניים ולגלות טיפול מרפא או מניעה חדשני עבור עששת שיניים, אשר מהווים בעיה מרכזית בבריאות הציבור כ- 92% 20-64 שנים מבוגרים הישן בעולם יש או היה אחד לפחות עששת35,36,37.

מכרסמים נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים יכולים לשבש amelogenesis ולשנות אמייל איכותי עלולה להוות מודל במחקרים על גורמים סביבתיים. נהלים דומים יכול לשמש גם פונקציונלי במחקרים על הגנים של עניין במישרין או בעקיפין מעורב amelogenesis. האיבר אמייל מיקרו-גזור הינו חומר מתאים לאפיין את מנגנוני הפעולה של חשיפה לרעלים, שלהם היעד גנים ויוו הימנעות כל הטיה ניסיוני. כאשר להיות מאופיין ליקויים התפתחותיים אמייל, גישה כזו יכול לשמש מודל ניבוי של פוטנציאליים השפעות הרומן של מזהמים פתולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי את אוניברסיטת פריז-Diderot, את הצרפתית המכון הלאומי לבריאות מחקר רפואי (INSERM), ואת המכון הצרפתי עבור מחקר Odontological (IFRO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bisphenol A Sigma Aldrich, Saint Louis MO 239658
formalin 10% Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO HT5012
Tri-Reagent Euromedex, France TR118
RLT buffer Qiagen, Les Ulis, France 74126 RNeasy Protect Mini Kit
Androgen receptor antibody Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) sc-816 rabbit polyclonal antibody
PBS 10x EUOMEDEX ET330.A
Sodium fluoride (NaF) Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO S-1504
paraplast regular Leica microsystems, Nanterre cedex, France 39601006 called was/parafin in the text
tissue OCT VWR, Fontenay-sous-Bois, France 411243
Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm PHYMEP , Paris, France 14084-08
Handle for Scalpel Blades - 12.5 cm PHYMEP, Paris, France 10035-12
Curved Scalpel Blade PHYMEP , Paris, France 10035-20
Dissecting Knife - Fine/Straight Tip PHYMEP , Paris, France 10055-12
Circle Knife PHYMEP, Paris, France 10059-15
scalpel blades n°11 Swann-Morton VWR, Fontenay-sous-Bois, France 233-0024
binocular lens Leica biosystems, Nanterre cedex, France MZFLIII

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
  2. Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
  3. Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
  4. Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
  5. Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).
  6. Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
  7. Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
  8. Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
  9. Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
  10. Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
  11. Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
  12. Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).
  13. Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. Dental tissue effects of fluoride. Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).
  14. Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
  15. Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
  16. Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
  17. Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
  18. Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
  19. Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
  20. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
  21. Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species? Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
  22. Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343 (2017).
  23. Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
  24. Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
  25. Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
  26. Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
  27. Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1 (2013).
  28. Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503 (2016).
  29. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  30. Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
  31. Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
  32. Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
  33. Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425 (2012).
  34. Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
  35. Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
  36. Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
  37. National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017).

Tags

הכחשה גיליון 133 החותכת עכברוש אמייל איברים Amelogenesis מינרלים Hypomineralization אמייל משבשים האנדוקרינית פלואוריד
ניתוח מיקרו של איבר אמייל השן החותכת הלסת של חולדות נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Houari, S., Babajko, S., Loiodice,… More

Houari, S., Babajko, S., Loiodice, S., Berdal, A., Jedeon, K. Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants. J. Vis. Exp. (133), e57081, doi:10.3791/57081 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter