Summary
エナメル質の形成と変化を理解すると、エナメル芽細胞活性の検討が必要です。ここでは、さらに定量的および定性的な実験プロシージャで使用可能性があります分泌と成熟期エナメル芽細胞を含むエナメル器官のマイクロ分析する信頼性と一貫性のある手法について述べる。
Abstract
環境条件や生活の方法から生じるエナメル質欠損、彼らの高い有病率のため公衆衛生の懸念されます。これらの欠陥はエナメル合成エナメル エナメル器官であるという責任がある細胞の活性変化に起因します。、エナメル質形成におけるエナメル芽細胞増殖、分化、死のイベントの具体的かつ正確なシーケンスに従ってください。ラットの切歯を継続的に成長、生理学的および病理学的条件でエナメル芽細胞活動と分化段階を研究する適切な実験的モデルです。ここでは、我々 はマイクロ分析環境有害物質に暴露したラットのエナメル器に信頼性の高い一貫した方法をについて説明します。ミクロ解剖歯科上皮には分泌と成熟期エナメル芽細胞in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学的アッセイなどの定性的な実験のためだけでなくなどの定量に使用できるにはが含まれてRT qPCR、RNA シーケンスおよび西部にしみが付くこと。
Introduction
環境毒性や不適切な生活習慣1,2,3,4への暴露から多く発達エナメル質の欠損があります。中断イベント、現在記載されている手順を使用してエナメル質形成の分子の特性、いくつかの有害物質への暴露の早いマーカーとして結果エナメル質欠損の使用を推進しの健康の歴史の再構成のために役立つことがあります。エナメル質が synthetized1,2周産期の期間それぞれの患者。エナメル合成は、エナメル芽細胞活動5によって 4 つの段階に分けることができます。最初のステップでは、前駆体細胞および pre-エナメル芽細胞増殖を再びグループ化します。2 番目の段階では、差別化されたエナメル芽細胞はエナメル基質タンパク質 (体)、主にアメロゲニン、エナメリン、アメロブラスチン、最終的なエナメル質の厚さを決定するを分泌します。したがって、EMP 合成の中断は、エナメル質の定量的欠陥につながります。におけるエナメル質の厚さの堆積後成熟段階を開始します。この段階で、幅と厚さにおけるアパタイト結晶の成長により重量最大 96% の生体組織は、最高の鉱化作用の割合に到達するエナメル質ができます。質的に成熟段階鉛中に発生する中断イベントはエナメルの欠陥です。最後に、エナメル、齧歯動物の色素沈着とも呼ばれる後の成熟の段階に入るし、歯噴火しエナメル質欠損 (もしあれば) 取り返しのつかない不可逆的なアポトーシスを受ける、欠陥の潜在的な回顧記録を提供エナメル芽細胞と強調しました。齧歯動物、エナメル、同様の一連のイベントがそれらをエナメルの一般的なプロセスを検討する適切なモデルの歯が成長し続ける特殊性で移動できます。したがって、エナメルの中断のエナメル質および/または中断イベントの時間ウィンドウの種類に応じて、数量の変更の結果します。その意味で、ダイオキシン類、鉛、および内分泌撹乱化学物質ビスフェノール A (BPA)、ゲニステイン、ビンクロゾリンなどへの暴露は、エナメル hypomineralizations1,2,3 を生成する示されています。 ,6,7,8。非対称白い不透明な斑点は、胎児期、出生1後最初の月の間に低用量 BPA 用量に暴露したラットの切歯に同定されました。これらのエナメル質欠損ラットと人間の臼歯切歯 hypomineralization (MIH) の類似した臨床的、構造的、生化学的特性を共有します。MIH は最近は、歯のエナメル質の病理病因まだ残る多くの因果関係の要因にもかかわらず不明9,10の9,10,11 に仮定されたこと ,12。
環境要因のための別の重要なエナメル hypomineralization 病理は歯の弗素症 (DF)、フッ化物の過剰吸収の結果である (> 0.1 mg/kg/日)13,14。フッ化物の主な情報源は、飲料水は、補足またはフッ化物で自然豊かです。フッ化物は、齲蝕予防にもしばしば処方が、予防的投与量はわずか 50% 毒性の 1 つよりも低い (0.05 mg/kg/日)。MIH と DF、環境要因への暴露から生じる 2 つの頻繁に病態が生じる内分泌かく乱化学物質2など他の有害物質とフッ化物の hypomineralizing 効果の増強により特徴付けられる必要がある共通の機能またはアモキシシリン15。
異なる分化段階でエナメルを含むラット エナメル器官の郭清のマイクロは、エナメル芽細胞の活動を妨害し、歯の噴火後診断されるエナメル質欠損を引き起こすことができる分子の作用のメカニズムを理解するのに役立ちます。つまり、環境毒性のためエナメル質遺伝子発現とエナメル マトリックス組成の変化の特性評価、有害物質への暴露の歴史の再構成ができ、環境安全の公共の監視が容易になります健康。
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Protocol
本研究で使用されるすべての動物は、ケアと農業 (A-75-06-12) フランスの省から実験動物の使用のためのガイドラインに従って維持されました。
1. 動物に対する毒性
- このプロトコルを実行する前に必要な制度上の承認を取得、すべての動物のケアのガイドラインを遵守することを確認します。
- エナメル芽細胞分泌期および成熟期エナメル芽細胞に調査せずの影響をテストするためにさまざまな実験的グループの憲法を許可する研究プロトコルの設計を適用します。ここでは、フッ素 (NaF) の組み合わせでまたはない BPA (図 1 a)2への露出によって雄 Wistar ラットの 4 つのグループが構成されました。すべての動物の観察・解剖日 65 (図 1 b)。
2. ラットから Hemi 下顎骨の解剖
- 必要に応じて別々 の頭に体の残りの部分から、斬首に続く、CO2窒息によるラットを安楽死させます。ラットは専用ボックス16で 5 分の CO2を公開します。
- #11 メスを使用して、下顎の前歯部に簡単にアクセスを得るために下の唇からすべてのスキンを削除します。
- 同じメスでわずかな圧力で 2 つの前歯の間を切開を行い、下顎は 2 つの半分に分割されます。
- 顎をデタッチするメスと一時的な下顎関節し、高級ピンセットでヘミ下顎骨を保持します。
- メスと周囲の軟部組織をカットし、筋肉、腱、靭帯、骨が完全にきれいになるまでスクレーパーを使用してを削除します。
3. 切歯17,18の分離
- 慎重に刃を切歯の主要な長手方向軸と平行に配置することによって、骨を剃り落とします。頚部ループ近く切歯の終わりまで切歯 (近位端) の先端近傍の骨稜で開始します。切開モーションから近位遠位方向に進みます。
- 遠位片側下顎骨の下顎を取り外して簡単に子宮頸のループまたはエナメル芽細胞 (図 2の赤い線) の分泌期を損なうことがなく、切歯が離陸を許可するメスと子宮頸のループに最初のカットを作る。
- モル、2 番目の下の 2 番目のカットを確認し、骨と切歯の内側表面の間メスを挿入します。すべての基底骨を持ち上げ、回転外側切歯とエナメル質を避けるために慎重にそれを取る器官のティッシュを損なう高級ピンセットを使用して。
4. 両眼のレンズの下にエナメル器官のマイクロ郭清
- 生理食塩水リン酸緩衝 (PBS 1 X) 200 μ L ピペットを使用して切歯上にドロップします。高級ピンセットで切歯を上向き唇の表面に取る。メス、無色と組織のオレンジ色の部分の間をマークを確認します。このマークは、注目すべきその後 (図 2) は、基になる白斑に対応します。
- 掘削機または同等のツールを分泌期 (無色) エナメル芽細胞と成熟期 (オレンジ) エナメル芽細胞の切歯の先端にメスのマークに対応する頂端にメスのマークから細胞の表面をこすり。
- 以前説明した19としての転換期に対応する 2 mm の組織を削除します。間充織による汚染を避けるためにエナメル器官解剖時に、中切歯を開かないでください。
- 前述の20としてすぐに切歯 (図 2) の頂端部に位置し頚部ループをカットします。
- 10% ホルマリンまたは溶解溶液 (材料の表を参照) さらに捜査のためにそれを収集します。
5. さらなる調査のための区切られたエナメル器官組織のコレクション
- 200 μ L の PBS 1 X バッファーを切歯にドロップします。
- #11 メス刃で慎重にデタッチ バッファーで徐々 に歯科の上皮細胞別に以前行ったメス マークの助けを借りて、ステージごとに。
- 細胞 RNA とタンパク質の抽出は、蛋白質と Rna (材料の表を参照) を抽出できる換散溶液中の組織を置きます。
注: 組織ショベル管で均質な混合物を得るまでセルを研削、高品質 Rna を準備します。混合物は、前述した2,8,17製造元の手順に従って RNA および蛋白質の抽出の準備ができて。通常、約 5-10 μ g 合計各準備を Rna と 150 μ g タンパク質を入手します。 - 組織学的解析、免疫組織染色 (IHC) との in situハイブリダイゼーション (っぽい)、2 h、4 ° c 1 × PBS でストアの 10% ホルマリンで細胞層を置きます。組織することができます埋め込むワックス ・ パラフィンの組織 10 月凍結切片の。
- EMP 抽出の高級ピンセットで切歯を取る。空気 (若干の脱水) に短い暴露後白い斑点はエナメル質の石灰化の開始を表す切歯の唇面の中央部の周り表示されます。このホワイト スポット対応に移行-/初期のエナメル芽細胞、成熟期だから指標として EMPs21の抽出のためそれを使用します。
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Representative Results
多くは欠陥をエナメル質など歯の弗素症12,13、フッ化物の過剰吸収による環境条件に起因またはエナメルの hypomineralization いくつかの内分泌かく乱化学物質の1、への露出により MIH のよう7,22。これらの発達のエナメル質の欠損は実験的ラット (図 1)1,2,7,23,24に複製すること。ラット片側下顎骨には、幅と呼ばれるギャップによって 3 つの臼歯から区切られた単一の切歯が含まれています。増え続ける切歯には、2 つの硬組織、象牙芽細胞、によって生成される象牙質とエナメル芽細胞と他の上皮細胞 (図 2) エナメル器官の存在によって生成されたエナメル質が含まれています。齧歯動物の門歯は、臼歯に反して動物の人生を通してすべてのエナメル芽細胞増殖・分化段階が含まれるので、エナメル質の形成を研究に適したモデルであることが表示されます。
ラット切歯歯髄からエナメル質のミクロ解剖臓器は若干の脱水後に表示される白いスポットの助けを借りて、エナメル芽細胞分化段階に応じて分けることができます、これは分泌の間の移行段階のインジケーターとして使用する可能性があり、成熟段階19,21,25。ヒアリン マッソンによって組織をチェックできるミクロ解剖エナメル質 (図 3 a) 染色します。顕微鏡観察は、典型的なエナメル上皮細胞とエナメル芽細胞の柵を示した。間葉系の汚染の不在は、コラーゲン グリーン染色 (図 3 a) と式 (図 3 b) の有無によって証明され。これらの微小解剖組織は、(図 3) IHC や ISH など qualitative analyses と Rt-qpcr (図 3 b)、RNA シーケンス、ウェスタンブロッティングなど定量分析に使用できます。たとえば、アンドロゲン受容体がこの蛋白質に対して指示される抗体を用いた成熟期エナメル芽細胞に限局具体的 (材料の表を参照してください) (図 3)8。主なエナメル芽細胞分化段階はエナメル質のミクロ解剖臓器上識別できる特定の遺伝子表現パターン26によって特徴付けられます。たとえば、分泌期エナメル芽細胞エクスプレス エナメリン2成熟期エナメル芽細胞・ エクスプレス カリクレイン 4 (KLK4) (図 3 b)。27エナメルのオレンジ色に責任がある、鉄の高い金額を格納する能力を付与するフェリチンの高レベルが含まれます。
簡単にエナメルのフッ化物の中断の後に、RNA の抽出のためのセル lysates の観察: 成熟期の lysates を制御するオレンジ色をしたフッ化物処理のものは光であったに対し無色 (図 4 a) に黄色。最近、大規模なトランスクリプトーム解析によって示されたフッ化物処理 (図 4 b)、KLK4 ダウン規制を示した微小解剖成熟期エナメル器官から抽出した RNA レベルの解析報告2です。特定の蛋白質はいずれかによって分泌- または成熟-期エナメル芽細胞はエナメル質のミクロ解剖臓器28を使用してまたローカライズ可能性があります表されます。たとえば、アンドロゲン受容体はエナメル質のミクロ解剖臓器8,28を使用して具体的にローカライズされました。
図 1: エナメルの組み合わせまたはビスフェノール A (BPA) ではなく、フッ素 (NaF) に暴露したラットに観測される欠陥。Wistar 系ラットを本研究の構成したラットに適用されるさまざまな環境条件に依存しているグループの 4 つの実験グループの模式図 (A)。離乳日 21 (P21) まで妊娠日 1 (fecondation) からコーン油 0.5 mL に 5 μ g/kg BPA 経口投与強制経口投与によって毎日妊娠中や授乳中の女性にコーン油だけでは、コントロール グループに投与したに対し。離乳後各ダムが特定され、対応する 2 つのグループのいずれかにランダムに配置。雄ラットは本研究のために選択され 5 μ g/kg/日 bpa 投与のみで、5 mM だけで、NaF にさらされている、またはその両方 (P65) 生後後 65 日まで同じ用量で。コントロール グループは、溶媒だけを与えられました。(B) 生後 30 (P30)、慢性低用量 BPA に暴露させたラット展示不透明の白い斑点とラット (P65) もはや明らか歯科表現で確認されました。典型的な歯の弗素症 (DF) 白とオレンジ色の縞模様は、NaF を投与ラットで観察されました。両方のエージェントに暴露したラットにおける重要な切歯変色によって特徴付けられるより重篤な表現型が確認されました。均一のオレンジ切歯エナメル質制御ラットに代表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 手順の概略図。エナメル芽細胞から分泌と成熟-段エナメル質のミクロ解剖臓器からの分離します。ラット片側下顎骨には、2 つの硬組織、(黄色) で象牙芽細胞によって生成される象牙質とエナメル質 (オレンジ) にエナメル芽細胞によって生成されると継続的に成長している切歯と臼歯 3 が含まれています。切歯が分離され、少し脱水症状、唇表面の頂端部に近い白いスポット、観測可能なオブジェクトです。それはそれは過渡期の間分泌- と成熟段階をカバーするようエナメル芽細胞分化の段階を識別するのに役立ちます。エナメル器は慎重にマイクロ解剖エナメル芽細胞分化段階に応じて 3 つの部分に区切られた、質的 (組織学的) 分析や定量的な実験的方法のいずれか使用される (RT qPCR による mRNA および蛋白質の解析と西部のしみが付く、それぞれ)。
図 3: 品質管理の微小解剖分泌- と - の成熟ステージ エナメル器官。ラット エナメル器官は、頸のループ、分泌期エナメル芽細胞、および成熟期エナメル芽細胞を含む 3 つの部分に分割されます。(A) ヒアリン マッソン染色ミクロ解剖部品の異なる上皮細胞と間葉系細胞の欠如を示した。スケール バー、100 μ m。 (B) 分泌と成熟期エナメル器官から抽出した Rna Rt-qpcr 実験による遺伝子発現解析。エナメリンと KLK4 式の典型的なパターンは、コラーゲン間葉系細胞の予想 1 の不在だけでなく、観察されました。(C) 蛍光染色に使用される抗体は、成熟期エナメル芽細胞によってのみ表されるアンドロゲン受容体に対して具体的指示 (材料の表を参照してください)。スケール バー、20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的な結果得られたミクロ解剖ラット エナメル器官。(A) セルされた RNA の抽出の換散バッファーで再停止されるとき (材料の表を参照)、色素エナメル芽細胞を含む成熟期の組織登場コントロールと BPA 処理条件のオレンジ。分泌期部分は条件に関係なく黄色です。NaF 処理ですべての lysates いた光黄色から無色。(B) 様々 な環境条件に提出されたラットのエナメル器官から RNA の準備で得られる RT qPCR データの例です。NaF ダウン調整される KLK4 の成熟段階と BPA の増加分泌期エナメリン式。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
エナメル質欠損の特性が、変化の理解を開発を助けるかもしれない変えられたエナメル芽細胞活性および/または混乱したエナメル芽細胞増殖・分化・成熟プロセス鉛不可逆的なエナメル質欠損し、順番、エナメル質形成におけるエナメル芽細胞の活動。したがって、孤立したエナメル器官の研究は、エナメルの欠陥がどのような環境や遺伝、その起源につながる病理のイベントを明らかにする決定要因です。
この手法は、もともとヒラーらが記載されています。17 ・ ロビンソンら18日、エナメル器官分化の各段階に特定の効果を発揮する使用されます。それは、EMP 抽出19,24,25適応されています。我々 は現在エナメル器官の主要な部分を分離し、Rna とタンパク質 (おそらく内極細胞蛋白質) 量的・質的分析をさまざまな環境条件で試料を収集この手順を使用してください。テクニック。
マイクロ郭清の精度には、保存されたエナメル器のコレクションを許可し、間葉系の汚染や任意組織破壊を避けるための応用の前に相当なトレーニングが必要です。また、マウスやラットで成功するために非常に困難です。確かに、プロシージャの難関は、組織形態、組織、およびこれらの 2 つのアプローチの前歯でよく実行される古典的な手法とは対照的 IHC や ISH の向きを保つことです。
脱全体のヘミ下顎骨と比較してエナメル質のミクロ解剖臓器を使用しての主な利点の 1 つは、エナメル質 Rna のメンテナンスと治療後コレクションの欠乏のおかげでタンパク質です。エナメル質のミクロ解剖臓器は、細胞を培養または選択しないで分子生物学と生化学のすべての技術のため直接使用できます。このプロシージャの利点は特定エナメル芽細胞の生体内で生理学的または病理学的条件で量を反映している RNA および蛋白質のレベルの直接測定。さらに、いくつかの毒性に関する法律 1 つ分化期具体的には、成熟期エナメル芽細胞と分泌段もの23,24ではなくを機能するフッ化物の場合と同様。エナメル器官のさまざまな地域の微小解剖によりいくつかの毒性物質またはその効果が全体エナメル器官または隔離されたセルを検出できない場合があります特定の遺伝子の作用機構の研究ができます。確かに、エナメル芽細胞、特に差別化されたものが収集することは困難や文化in vitro研究テーマに関する報告の欠如が証明しています。分離することができますのみ歯科の上皮細胞は、pre エナメルと頚部ループ20から幹細胞です。また、報告されたエナメル上皮細胞株主にラットの帽子 729、マウス LS830、ALC31、および人間の午前 132、エナメル芽細胞の生体内での分化特性はしばしば失う: 彼らは表現成熟期エナメル芽細胞8など同様に、分泌期エナメル芽細胞、およびまた KLK4 または SLC26A4/ペンドリン アメロブラスチンなど細胞外マトリックス蛋白質 (体) がもっとまたはより少なく特急アメロゲニンを石化することが、エナメル質を生成する行列。歯科上皮幹細胞と胚性エナメル芽細胞の単離は、エナメル芽細胞分化の第一段階を研究するためのオプションを構成するかもしれないが、ターミナル エナメル質石灰化過程に関する研究は実施できない異なるよりも、生体内でモデル。エナメルのこの最後の部分は、エナメル質の決定要因は。ノッチ、Bmp、Msx、Fgf など、歯の開発に関与して重要な要因に対し Shh、Wnt は、よく記載されている33,34, エナメル質にしっかりと関与しているがまだよくわかっていません。エナメル質の重要な要因の評価世界で古い大人 20 から 64 歳までの 92% として主要な公衆衛生問題を構成する虫歯を解読し、革新的な治癒や予防治療、虫歯を発見する必要があります。少なくとも 1 つ齲蝕35,36,37を持っているか。
エナメル質形成を妨害し、エナメル質を変更することができる環境有害物質にさらされる齧歯動物は、環境因子の研究のための良いモデルを構成するかもしれない。同じようなプロシージャは、エナメル質形成に直接的または間接的に関与する興味のある遺伝子の機能解析を使用できます。エナメル質のミクロ解剖器官は有害物質とそのターゲット遺伝子生体内で実験的バイアスの回避の行動のメカニズムを特徴付けるための適当な材料であります。発達のエナメル質の欠陥は特徴付けられる、このようなアプローチは新規汚染物質の潜在的な病理学的影響の予測モデルとして使用できます。
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Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
この仕事は、歯科医学の研究 (IFRO) の大学パリ ・ ディドロ、フランス国立衛生研究所と医学研究 (INSERM)、フランスの研究所によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisphenol A | Sigma Aldrich, Saint Louis MO | 239658 | |
| formalin 10% | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | HT5012 | |
| Tri-Reagent | Euromedex, France | TR118 | |
| RLT buffer | Qiagen, Les Ulis, France | 74126 | RNeasy Protect Mini Kit |
| Androgen receptor antibody | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) | sc-816 | rabbit polyclonal antibody |
| PBS 10x | EUOMEDEX | ET330.A | |
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO | S-1504 | |
| paraplast regular | Leica microsystems, Nanterre cedex, France | 39601006 | called was/parafin in the text |
| tissue OCT | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 411243 | |
| Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm | PHYMEP , Paris, France | 14084-08 | |
| Handle for Scalpel Blades - 12.5 cm | PHYMEP, Paris, France | 10035-12 | |
| Curved Scalpel Blade | PHYMEP , Paris, France | 10035-20 | |
| Dissecting Knife - Fine/Straight Tip | PHYMEP , Paris, France | 10055-12 | |
| Circle Knife | PHYMEP, Paris, France | 10059-15 | |
| scalpel blades n°11 Swann-Morton | VWR, Fontenay-sous-Bois, France | 233-0024 | |
| binocular lens | Leica biosystems, Nanterre cedex, France | MZFLIII |
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