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Medicine

पर्यावरणीय विषालु के संपर्क में आए चूहों के Mandibular Incisor से तामचीनी अंग का सूक्ष्म-विच्छेदन

Published: March 29, 2018 doi: 10.3791/57081
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

Summary

तामचीनी गठन और संभव परिवर्तन को समझना ameloblast गतिविधि के अध्ययन की आवश्यकता है । यहाँ, हम सूक्ष्म-काटना तामचीनी अंगों के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत विधि का वर्णन स्राव युक्त-और परिपक्वता चरण ameloblasts कि आगे मात्रात्मक और गुणात्मक प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

तामचीनी पर्यावरण की स्थिति और जीवन के तरीके से जिसके परिणामस्वरूप दोष उनके उच्च प्रसार की वजह से सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंताएं हैं । ameloblasts नाम तामचीनी संश्लेषण के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं की बदली गतिविधि से इन दोषों परिणाम, जो तामचीनी अंग में मौजूद. amelogenesis के दौरान, ameloblasts प्रसार, भेदभाव, और मौत की घटनाओं की एक विशिष्ट और सटीक अनुक्रम का पालन करें । एक चूहे लगातार बढ़ रही कृन्तक शारीरिक और रोग की स्थिति में ameloblast गतिविधि और भेदभाव चरणों का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त प्रयोगात्मक मॉडल है । यहां, हम सूक्ष्म काटना के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत विधि का वर्णन पर्यावरण विषालु से अवगत कराया चूहों का अंग तामचीनी । सूक्ष्म विच्छेदित दंत epithelia स्राव-और परिपक्वता चरण ameloblasts है कि गुणात्मक प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे immunohistochemistry परख और सीटू संकरण में , साथ ही मात्रात्मक विश्लेषण के लिए जैसे RT-qPCR, आरएनए-seq, और वेस्टर्न सोख्ता.

Introduction

कई विकासात्मक तामचीनी दोषों पर्यावरण विषालु और/या अनुपयुक्त जीवन शैली1,2,3,4के लिए जोखिम से परिणाम हो सकता है । घटनाओं और वर्तमान में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग कर amelogenesis के अणुओं को बाधित करने का लक्षण वर्णन कई विषालु के लिए जोखिम के जल्दी मार्करों के रूप में जिसके परिणामस्वरूप तामचीनी दोषों के उपयोग को बढ़ावा देगा, और के स्वास्थ्य के इतिहास का पुनर्गठन करने में मदद कर सकते है प्रसवकालीन अवधि के दौरान प्रत्येक रोगी जब तामचीनी synthetized1,2है । तामचीनी संश्लेषण चार मुख्य चरणों में ameloblast गतिविधि5के आधार पर विभाजित किया जा सकता है । पहला कदम regroups के प्रणेता सेल और पूर्व ameloblast प्रसार । दूसरे चरण के दौरान, विभेदित ameloblasts गुप्त तामचीनी मैट्रिक्स प्रोटीन (EMPs), मुख्य रूप से amelogenin, enamelin और ameloblastin, जो अंतिम तामचीनी की मोटाई निर्धारित करते हैं । इस प्रकार, EMP संश्लेषण के किसी भी व्यवधान तामचीनी के मात्रात्मक दोषों की ओर जाता है. पूर्ण तामचीनी मोटाई के जमाव के बाद, परिपक्वता चरण शुरू होता है । इस चरण के दौरान, चौड़ाई और मोटाई में एपेटाइट crystallite वृद्धि तामचीनी एक जैविक ऊतक में पाया उच्चतम mineralization अनुपात तक पहुंचने के लिए अनुमति देता है, ऊपर से 96% तक वजन के साथ । गुणात्मक तामचीनी दोषों के लिए परिपक्वता चरण के दौरान होने वाली घटनाओं में खलल डालना. अंत में, ameloblasts के बाद परिपक्वता के एक चरण में प्रवेश, भी कुतर में रंजकता कहा जाता है, और दांत तामचीनी दोषों (यदि कोई हो) अपूरणीय और अपरिवर्तनीय दोष बनाने के दौरान apoptosis से गुजरना, इस प्रकार दोष की संभावित पूर्वव्यापी रिकॉर्डिंग प्रदान ameloblast तनाव । कुतर में amelogenesis के साथ घटनाओं के एक समान अनुक्रम का अनुसरण करता है कि उनके कृन्तक लगातार बढ़ रहे हैं, जो उन्हें amelogenesis की सामान्य प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल बनाता है । इस प्रकार, तामचीनी गुणवत्ता और/या मात्रा के परिवर्तन में amelogenesis परिणाम के किसी भी व्यवधान, व्यवधान घटना के समय खिड़की पर निर्भर करता है । उस अर्थ में, डाइअॉकॉ्सिन के लिए जोखिम, सीसा, और अंत में स्रावी-बाधित रसायनों (EDCs) जैसे bisphenol ए (BPA), genistein, और vinclozolin, तामचीनी hypomineralizations उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है1,2,3 ,6,7,8. असममित सफेद अपारदर्शी धब्बे भ्रूण की अवधि के दौरान एक कम खुराक BPA खुराक के लिए उजागर चूहों के कृन्तक पर और जन्म के बाद पहले महीने1की पहचान की गई. चूहों में इन तामचीनी दोषों, और उन मानव दाढ़ incisor hypomineralization (मिह), शेयर समान नैदानिक, संरचनात्मक, और जैव रासायनिक विशेषताओं के उन । मिह एक हाल ही में वर्णित दंत तामचीनी विकृति है, जिसके लिए एटियलजि अभी भी अस्पष्ट9,10 के बावजूद कई कारण कारकों की परिकल्पना की गई है9,10,11 ,12.

एक अंय महत्वपूर्ण तामचीनी hypomineralization विकृति पर्यावरणीय कारकों के कारण दंत फ्लोरोसिस (DF) है, जो अत्यधिक फ्लोराइड अवशोषण का परिणाम है (> 0.1 मिलीग्राम/किग्रा/दिन)13,14। फ्लोराइड का मुख्य स्रोत है कि या तो पूरक या प्राकृतिक रूप से फ्लोराइड से समृद्ध है पीने का पानी है । फ्लोराइड भी अक्सर दंत क्षय को रोकने के लिए निर्धारित है, लेकिन नियत्रंण खुराक केवल 50% विषाक्त एक से कम है (≤ 0.05 मिलीग्राम/ मिह और DF, दो अक्सर पर्यावरणीय कारकों के लिए जोखिम से उत्पंन विकृतियों, आम सुविधाओं है कि फ्लोराइड के hypomineralizing प्रभाव के potentiation के कारण विशेषता की आवश्यकता हो सकती है जैसे कि EDCs2 के रूप में अंय विषालु के साथ संयुक्त या amoxicillin15.

सूक्ष्म-अलग अंतर चरणों में ameloblasts युक्त चूहा तामचीनी अंग के विच्छेदन ameloblast गतिविधि को बाधित करने में सक्षम अणुओं की कार्रवाई के तंत्र को समझने में मदद मिलेगी और तामचीनी दोषों के कारण दांत विस्फोट के बाद का निदान किया जाना है । दूसरे शब्दों में, तामचीनी जीन अभिव्यक्ति और तामचीनी मैट्रिक्स पर्यावरण विषालु के कारण संरचना के परिवर्तन के लक्षण वर्णन विषालु के लिए जोखिम के इतिहास के पुनर्गठन की अनुमति देता है, और जनता के लिए पर्यावरण सुरक्षा निगरानी की सुविधा स्वास्थ्य.

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Protocol

वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त सभी जानवरों की देखभाल और फ्रांसीसी कृषि मंत्रालय से प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार बनाए रखा गया था (A-75-06-12) ।

1. पशु विषालु के लिए जोखिम

  1. इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने से पहले, आवश्यक संस्थागत अनुमोदन प्राप्त करें और सभी पशु देखभाल दिशानिर्देशों का अनुपालन सुनिश्चित कर लें ।
  2. अनुसंधान के लिए अलग प्रयोगात्मक समूहों के संविधान की अनुमति प्रोटोकॉल के डिजाइन लागू करने के लिए अणु के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए (ओं) ameloblast स्राव मंच और ameloblast परिपक्वता मंच पर जांच की । यहां, पुरुष Wistar चूहों के चार समूहों के संयोजन में या नहीं BPA (चित्र 1a)2के साथ फ्लोराइड (NaF) के लिए उनके जोखिम के आधार पर गठित किया गया । सभी जानवरों को मनाया गया और 65 दिन पर विच्छेदित (चित्र 1b) ।

2. Hemi का विच्छेदन-वयस्क चूहों से Mandibles

  1. कं2 asphyxiation द्वारा चूहों Euthanize, वैकल्पिक रूप से शरीर के बाकी हिस्सों से अलग सिर को decapitation द्वारा पीछा किया । एक समर्पित बॉक्स16में 5 मिनट के लिए2 सह चूहों बेनकाब ।
  2. निचले कृन्तक करने के लिए आसान पहुँच प्राप्त करने के क्रम में एक #11 स्केलपेल का उपयोग कर कम होंठ से सभी त्वचा को हटा दें ।
  3. एक ही स्केलपेल के साथ, दो निचले कृन्तक के बीच एक चीरा एक मामूली दबाव के साथ बनाने के लिए और mandible दो हिस्सों में विभाजित किया जाएगा ।
  4. एक स्केलपेल के साथ लौकिक mandibular संयुक्त कट जबड़े अलग करने के लिए, और ठीक चिमटी के साथ hemi-mandible पकड़ो ।
  5. एक स्केलपेल के साथ आसपास के कोमल ऊतकों में कटौती और सभी मांसपेशियों को हटाने, tendons, और हड्डी पूरी तरह से साफ है जब तक एक खुरचनी का उपयोग कर बंधन ।

3. अलगाव की Incisor17,18

  1. ध्यान से incisor के प्रमुख अनुदैर्ध्य अक्ष के लिए ब्लेड समानांतर रखकर हड्डी दाढ़ी । ग्रीवा पाश के पास incisor के अंत तक incisor (समीपस्थ अंत) के सुझावों के पास बोनी रिज पर शुरू करो । चीरा गति समीपस्थ से बाहर की दिशा के लिए आय ।
  2. hemi-mandible के gonion को दूर करने के लिए स्केलपेल के साथ गर्भाशय के लूप को एक पहली कटौती विलम्बी बनाएं और गर्भाशय के लूप या incisor के स्रावी चरण को क्षति पहुंचाए बिना आसानी से ameloblasts ( चित्र 2में लाल रेखा) को ले जाने की अनुमति दें ।
  3. दूसरी दाढ़ के नीचे एक दूसरी कट बनाओ, और हड्डी और incisor के औसत दर्जे का सतह के बीच स्केलपेल डालें । जब सभी बेसल हड्डी उठा लिया है, incisor बाहर घुमाने और तामचीनी अंग ऊतक ठीक चिमटी का उपयोग कर ख़राब से बचने के लिए इसे ध्यान से ले ।

4. दूरबीन लेंस के तहत तामचीनी अंग के सूक्ष्म-विच्छेदन

  1. एक पिपेट का उपयोग incisor पर खारा फॉस्फेट बफर (पंजाबियों 1x) के 200 µ एल ड्रॉप । ओष्ठ सतह का सामना करना पड़ के साथ ठीक चिमटी के साथ incisor ले लो । रंग और ऊतक के नारंगी भागों के बीच एक स्केलपेल निशान बनाओ । यह निशान अंतर्निहित सफेद स्थान है जो बाद में चौकस है (चित्रा 2) से मेल खाती है ।
  2. परिमार्जन, एक खुदाई या समकक्ष उपकरण के साथ, शिखर अंत करने के लिए स्केलपेल निशान से सेल सतह स्राव मंच (बेरंग) ameloblasts के लिए इसी, और स्केलपेल निशान से परिपक्वता चरण (नारंगी) incisor के लिए ameloblasts की नोक ।
  3. 2-मिमी संक्रमण चरण के लिए इसी ऊतक निकालें, के रूप में पहले वर्णित19। mesenchyme द्वारा संदूषण से बचने के लिए तामचीनी अंग विच्छेदन के दौरान incisor को न खोलें ।
  4. incisor (चित्रा 2) के शिखर भाग पर तुरंत स्थित ग्रीवा पाश काट के रूप में पहले से20वर्णित है ।
  5. इसे आगे की जांच के लिए 10% formalin या lysis समाधान में लीजिए ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

5. आगे की जांच के लिए अलग तामचीनी अंग ऊतकों का संग्रह

  1. ड्रॉप 200 µ l पंजाबियों 1x incisor पर बफर ।
  2. एक #11 स्केलपेल ब्लेड के साथ, ध्यान से अलग करने के लिए पूर्व में किए गए स्केलपेल निशान की मदद से प्रत्येक चरण के लिए पृथक रूप से बफर में दंत उपकला कोशिकाओं
  3. सेल आरएनए और प्रोटीन निकालने के लिए, एक lysis समाधान है कि दोनों प्रोटीन और RNAs की निकासी की अनुमति देता में ऊतक डाल ( सामग्री की तालिकादेखें).
    नोट: ट्यूब में ऊतक खुदाई मोड़ द्वारा उच्च गुणवत्ता RNAs तैयार है, और फिर एक सजातीय मिश्रण प्राप्त करने तक कोशिकाओं पीसने । मिश्रण आरएनए और प्रोटीन निकालने के लिए निर्माता की प्रक्रिया है, जो पहले2,8,17बताया गया था के अनुसार के लिए तैयार है । आमतौर पर, लगभग 5-10 µ g कुल RNAs और 150 µ g कुल प्रोटीन प्रत् येक तैयारी के लिए प्राप् त किए गए थे ।
  4. ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए, immunohistochemistry (आइएचसी), और सीटू संकरण (ISH) में , 2 ज के लिए 10% formalin में सेल परत डाल, तो पंजाब में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 1x । ऊतक तो जमे हुए वर्गों के लिए अक्टूबर वैक्स/आयल या ऊतक में एंबेड किया जा सकता है ।
  5. EMP निकालने के लिए, ठीक चिमटी के साथ incisor ले । हवा (थोड़ा निर्जलीकरण) के लिए एक छोटी जोखिम के बाद, एक सफेद स्थान incisor, जो तामचीनी mineralization की दीक्षा का प्रतिनिधित्व करता है की ओष्ठ सतह के मध्य भाग के आसपास दिखाई देगा । इस सफेद स्थान संक्रमण-/early परिपक्वता ameloblasts के चरण से मेल खाती है, तो यह EMPs के निष्कर्षण के लिए एक संकेतक के रूप में उपयोग करें21.

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Representative Results

दंत फ्लोरोसिस12,13के रूप में कई तामचीनी दोषों, अत्यधिक फ्लोराइड अवशोषण या तामचीनी hypomineralization कुछ EDCs1के लिए जोखिम के कारण मिह के समान के कारण पर्यावरणीय परिस्थितियों से परिणाम हो सकता है, 7,22. इन विकास तामचीनी दोषों चूहों पर प्रयोग किया जा सकता है (चित्रा 1)1,2,7,23,24। चूहे hemi-mandible एक एकल incisor एक अंतर द्वारा तीन दाढ़ से अलग होता है diastema बुलाया । लगातार बढ़ रही incisor में दो खनिज ऊतक होते हैं, odontoblasts द्वारा उत्पादित दंतधातु, और अन्य उपकला कोशिकाओं के साथ तामचीनी अंग में मौजूद ameloblasts द्वारा उत्पादित तामचीनी (चित्रा 2). मूषक incisor के लिए amelogenesis का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रतीत होता है, दाढ़ के विपरीत, यह जानवर के जीवन भर में सभी ameloblast प्रसार/

चूहा incisor से सूक्ष्म विच्छेदित तामचीनी अंग एक सफेद स्थान है कि एक मामूली निर्जलीकरण के बाद प्रकट होता है की मदद से ameloblast विभेद चरण के अनुसार अलग किया जा सकता है, और यह संक्रमण के एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है स्राव के बीच चरण-और परिपक्वता-चरण19,21,25। माइक्रो-विच्छेदित तामचीनी ऊतकों की गुणवत्ता Trichrome Masson के धुंधला (चित्रा 3) द्वारा जाँच की जा सकती है । सूक्ष्म अवलोकन ठेठ तामचीनी उपकला कोशिकाओं और ameloblast कटघरा दिखाया । mesenchymal संदूषण के अभाव कोलेजन हरी धुंधला (चित्रा 3) और अभिव्यक्ति (चित्र बी) के अभाव द्वारा सत्यापित किया गया था । इन सूक्ष्म-विच्छेदित ऊतकों का उपयोग गुणात्मक विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है जैसे आइएचसी (आरेख 3 c) और ISH, और मात्रात्मक विश्लेषण जैसे RT-qPCR (आरेख), आरएनए-seq, और पश्चिमी सोख्ता । उदाहरण के लिए, एण्ड्रोजन रिसेप्टर विशेष रूप से इस प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर परिपक्वता चरण ameloblasts में स्थानीयकृत किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें) (चित्र 3सी)8. मुख्य ameloblast भेदभाव चरणों विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न द्वारा विशेषता है26 कि सूक्ष्म-विदारक तामचीनी अंग पर पहचाना जा सकता है । उदाहरण के लिए, स्राव-चरण ameloblasts एक्सप्रेस enamelin2 और परिपक्वता चरण ameloblasts एक्सप्रेस Kallikrein 4 (KLK4) (चित्रा 3 बी) । वे ferritin के उच्च स्तर है कि लोहे की उच्च मात्रा में स्टोर करने की क्षमता प्रदान करते हैं, जो तामचीनी के नारंगी रंग के लिए जिंमेदार है27।

amelogenesis के फ्लोराइड व्यवधान आसानी से आरएनए के लिए सेल lysates के अवलोकन के बाद किया जा सकता है निकालने: नियंत्रण परिपक्वता चरण lysates नारंगी थे, जबकि फ्लोराइड-इलाज वालों बेरंग (चित्र 4a) के लिए हल्के पीले थे. सूक्ष्म विच्छेदित परिपक्वता चरण तामचीनी अंग से निकाली गई आरएनए स्तर के विश्लेषण से पता चला KLK4 नीचे फ्लोराइड उपचार (चित्रा 4B) पर विनियमन, जो भी एक बड़े पैमाने पर transcriptomic विश्लेषण द्वारा सबूत था हाल ही में रिपोर्ट2. विशिष्ट प्रोटीन स्राव द्वारा या तो व्यक्त-या परिपक्वता चरण ameloblasts भी सूक्ष्म-विच्छेदित तामचीनी अंग का उपयोग कर स्थानीयकृत किया जा सकता है28. उदाहरण के लिए, एण्ड्रोजन रिसेप्टर विशेष रूप से सूक्ष्म-विच्छेदित तामचीनी अंग8,28का उपयोग कर स्थानीयकृत था.

Figure 1
चित्रा 1: तामचीनी दोषों bisphenol के साथ या नहीं संयोजन में फ्लोराइड (NaF) को उजागर चूहों पर मनाया (BPA). (क) वर्तमान अध्ययन के लिए गठित Wistar चूहों के चार प्रायोगिक समूहों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, समूह जो विभिन्न पर्यावरणीय चूहों पर लागू की गई शर्तों पर निर्भर हैं. गर्भावधि दिन 1 से (fecondation) दिन सुबह तक 21 (P21), 5 µ ग्राम/किलो BPA मकई तेल की 0.5 मिलीलीटर में मौखिक रूप से गर्भवती और स्तनपान कराने वाली महिलाओं के लिए दैनिक gavage द्वारा प्रशासित किया गया था, जबकि अकेले मकई तेल नियंत्रण समूह के लिए प्रशासित किया गया था । प्रातः के बाद, प्रत्येक बांध की पहचान की गई और इसी दो समूहों में से एक में बेतरतीब ढंग से वितरित किया गया. पुरुष चूहों इस अध्ययन के लिए चयनित किया गया और 5 µ g/kg/दिन BPA अकेले, 5 मिमी NaF अकेले, या दोनों एक ही खुराक पर 65 दिनों तक जन्म के बाद (P65). नियंत्रण समूह विलायक अकेले दिया गया था । (ख) जन्मोत्तर दिवस 30 (P30) में, चूहों लंबे समय से कम खुराक BPA प्रदर्शित सफेद अपारदर्शी धब्बे और एक नहीं रह स्पष्ट दंत phenotype वयस्क चूहों (P65) के लिए पहचान की गई थी । ठेठ दंत फ्लोरोसिस (DF) के सफेद और नारंगी बैंड बारी NaF के साथ इलाज चूहों में मनाया गया । एक और गंभीर phenotype एक महत्वपूर्ण incisor disease द्वारा विशेषता दोनों एजेंटों को उजागर चूहों में पहचान की गई थी । सजातीय नारंगी incisal तामचीनी typified नियंत्रण चूहों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । स्राव से ameloblasts का अलगाव-और परिपक्वता-सूक्ष्म-विच्छेदित तामचीनी अंग से चरणों. चूहे hemi-mandible तीन दाढ़ और दो खनिज ऊतकों के साथ लगातार बढ़ रही incisor, दंतधातु द्वारा उत्पादित odontoblasts (पीले रंग में), और ameloblasts द्वारा उत्पादित तामचीनी (नारंगी में) शामिल हैं । जब incisor अलग और थोड़ा निर्जलित है, ओष्ठ सतह के शिखर भाग के पास एक सफेद स्थान चौकस है । यह भेदभाव के ameloblast चरण की पहचान करने में मदद करता है, क्योंकि यह स्राव के बीच संक्रमण चरण शामिल है-और परिपक्वता चरणों । तामचीनी अंग ध्यान से सूक्ष्म विदारक है, ameloblast विभेद चरणों के आधार पर 3 भागों में अलग है, और गुणात्मक (ऊतकवैज्ञानिक) विश्लेषण या मात्रात्मक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए या तो इस्तेमाल किया (आरटी द्वारा mRNA और प्रोटीन विश्लेषण-qPCR और वेस्टर्न सोख्ता, क्रमशः) ।

Figure 3
चित्रा 3: सूक्ष्म-विच्छेदित स्राव की गुणवत्ता नियंत्रण-और-तामचीनी अंग की परिपक्वता चरणों । चूहा तामचीनी अंग 3 ग्रीवा पाश, स्राव चरण ameloblasts, और परिपक्वता चरण ameloblasts युक्त भागों में अलग है । (क) Trichrome Masson के दाग सूक्ष्म-विदारक भागों के विभिन्न उपकला कोशिकाओं और mesenchymal कोशिकाओं के अभाव से पता चला. स्केल बार, 100 µm. (ख) आर टी द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण-स्राव से निकाले RNAs के qPCR प्रयोगों-और परिपक्वता चरण तामचीनी अंग. enamelin और KLK4 अभिव्यक्ति का एक विशिष्ट पैटर्न देखा गया था, के रूप में अच्छी तरह के रूप में mesenchymal कोशिकाओं में अपेक्षित कोलेजन 1 की अनुपस्थिति । (ग) फ्लोरोसेंट धुंधला एक एंटीबॉडी इस्तेमाल किया ( सामग्री की तालिकादेखें) विशेष रूप से एण्ड्रोजन रिसेप्टर के खिलाफ निर्देशित केवल परिपक्वता द्वारा व्यक्त-चरण ameloblasts. स्केल बार, 20 µm. इस आंकड़े का बड़ा वर्शन देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि सूक्ष्म-विच्छेदित चूहा तामचीनी अंग के साथ परिणाम प्राप्त किया । (क) जब कोशिकाएं आरएनए निष्कर्षण के लिए एक lysis बफर में reसस्पैंड किया गया ( सामग्री की तालिकादेखें), परिपक्वता चरण ऊतक युक्त ameloblasts नियंत्रण में नारंगी दिखाई दिया-और BPA-इलाज की स्थिति । स्राव-चरण भाग पीला है कोई बात नहीं शर्तों । NaF उपचार में, सभी lysates हल्के पीले रंग के थे । (ख) विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों के लिए प्रस्तुत चूहों के तामचीनी अंगों से आरएनए तैयारी के साथ प्राप्त RT-qPCR डेटा का उदाहरण. NaF नीचे-परिपक्वता अवस्था में विनियमित KLK4, और BPA स्राव में वृद्धि की enamelin अभिव्यक्ति-चरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

बदल ameloblast गतिविधि और/या बाधित ameloblast प्रसार, भेदभाव, और परिपक्वता प्रक्रियाओं अपरिवर्तनीय तामचीनी दोषों के लिए नेतृत्व और, बारी में, तामचीनी दोषों के लक्षण वर्णन बदल की समझ विकसित करने में मदद कर सकते हैं amelogenesis के दौरान ameloblast गतिविधि । इस प्रकार, अलग तामचीनी अंग पर अध्ययन रोग तामचीनी दोष जो कुछ भी अपने मूल, पर्यावरण या आनुवंशिक के लिए अग्रणी घटनाओं स्पष्ट निर्धारक हैं ।

इस तकनीक को मूल रूप से हिल एट अल द्वारा वर्णित किया गया है । 17 और रॉबिंसन एट अल । 18, और तामचीनी अंग भेदभाव के प्रत्येक चरण पर विशिष्ट प्रभाव प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह तो EMP निकालने19,24,25के लिए अनुकूलित किया गया है । हम वर्तमान में इस प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए तामचीनी अंग के मुख्य भागों अलग और विभिंन पर्यावरणीय स्थितियों में जैविक नमूनों को इकट्ठा करने के लिए RNAs और प्रोटीन का विश्लेषण (संभवतः अंतर और अतिरिक्त सेलुलर प्रोटीन) मात्रात्मक और गुणात्मक का उपयोग तकनीक.

सूक्ष्म विच्छेदन की परिशुद्धता अपने आवेदन से पहले पर्याप्त प्रशिक्षण की आवश्यकता है, संरक्षित तामचीनी अंग के संग्रह की अनुमति देने के लिए और mesenchymal संदूषण और किसी भी ऊतक विनाश से बचने के लिए । इसके अलावा, चूहों या छोटे चूहों के साथ सफल होने के लिए काफी मुश्किल है । दरअसल, प्रक्रिया के trickiest भाग के लिए ऊतक आकृति विज्ञान, प्रोटोकॉल, और आइएचसी और ISH में अभिविन्यास, के रूप में शास्त्रीय सामांयतः इन दो तरीकों के लिए कृन्तक पर प्रदर्शन तकनीकों का विरोध किया है ।

एक सूक्ष्म-विच्छेदित तामचीनी अंग का उपयोग करने के मुख्य लाभ में से एक की तुलना में विखनिज पूरे hemi-mandible तामचीनी RNAs और प्रोटीन के रखरखाव के किसी भी उपचार के बाद संग्रह की कमी के लिए धन्यवाद है । सूक्ष्म विदारक तामचीनी अंग का चयन या संवर्धन कोशिकाओं के बिना आणविक जीवविज्ञान और जैव रसायन की सभी तकनीकों के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रक्रिया का लाभ आरएनए और प्रोटीन का स्तर है कि शारीरिक या रोग की स्थिति में vivo में विशिष्ट ameloblasts में उनकी मात्रा को दर्शाता है की प्रत्यक्ष माप है । इसके अलावा, विशेष रूप से एक अंतर मंच पर कुछ विषालु अधिनियम, के रूप में फ्लोराइड के साथ मामला है, जो परिपक्वता पर कार्य करता है चरण ameloblasts और नहीं स्राव-चरण वाले23,24. तामचीनी अंग के विभिन्न क्षेत्रों के सूक्ष्म विच्छेदन कुछ विषालु या विशिष्ट जीन जिसका प्रभाव पूरे तामचीनी अंग पर या अलग कोशिकाओं पर undetectable हो सकता है की कार्रवाई के तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है । वास्तव में, ameloblasts, विशेष रूप से विभेदक लोगों को इकट्ठा करने के लिए और संस्कृति में इन विट्रो, जो अध्ययन की कमी के द्वारा सत्यापित किया जाता है इस विषय पर रिपोर्ट मुश्किल है । केवल दंत उपकला कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है कि गर्भाशय ग्रीवा पाश से पूर्व ameloblasts और स्टेम कोशिकाओं रहे हैं20. इसके अलावा, रिपोर्ट ameloblastic सेल लाइंस, मुख्य रूप से चूहा टोपी-729, माउस LS830, ALC31, और मानव हूं-132, अक्सर vivo ameloblasts में भेदभाव विशेषताओं खो: वे एक्सप्रेस extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन (EMPs) जैसे ameloblastin स्राव के लिए इसी तरह के चरण ameloblasts, और भी KLK4 या SLC26A4/pendrin, जैसे कि परिपक्वता चरण ameloblasts8, लेकिन अधिक या कम करने में असमर्थ है amelogenin व्यक्त करने के लिए और mineralize करने के लिए मैट्रिक्स तामचीनी उत्पादन करने के लिए । दंत उपकला स्टेम कोशिकाओं और भ्रूण ameloblasts के अलगाव ameloblast भेदभाव के पहले चरण का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प का गठन कर सकते हैं, लेकिन टर्मिनल तामचीनी mineralization प्रक्रिया पर अध्ययन के साथ अलग से बाहर नहीं किया जा सकता vivo में मॉडल । amelogenesis के इस पिछले भाग तामचीनी गुणवत्ता के लिए निर्धारक है । मुख्य कारकों में शामिल है दांत विकास, जैसे Bmp, Msx, Fgf, पायदान, श्श्श, Wnt अच्छी तरह से वर्णित है33,34, उन कसकर तामचीनी गुणवत्ता में शामिल अभी भी खराब समझ रहे हैं । तामचीनी गुणवत्ता में प्रमुख कारकों के लक्षण वर्णन दंत क्षय को समझने और दंत क्षय, जो दुनिया में 20 से 64 साल पुराने वयस्कों के 92% के रूप में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या का गठन के लिए अभिनव उपचारात्मक या निवारक उपचार की खोज करने के लिए आवश्यक है है या कम से35,36,37क्षय है ।

amelogenesis को बाधित करने और तामचीनी गुणवत्ता में परिवर्तन करने में सक्षम पर्यावरणीय विषालु से परिचित कुतर पर्यावरणीय कारकों पर अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल का गठन कर सकते हैं । इसी तरह की प्रक्रियाओं को भी प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से amelogenesis में शामिल ब्याज की जीन पर कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । माइक्रो-विच्छेदित तामचीनी अंग एक उपयुक्त सामग्री विषालु की कार्रवाई के तंत्र और उनके लक्ष्य जीन vivo में किसी भी प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह से बचने के लिए विशेषताएं है । जब विकास तामचीनी दोषों की विशेषता हो जाएगा, इस तरह के एक दृष्टिकोण उपंयास प्रदूषक के संभावित रोग प्रभावों का एक पूर्वानुमान मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

यह काम विश्वविद्यालय पेरिस द्वारा वित्त पोषित किया गया था-Diderot, फ्रांसीसी राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (INSERM), और फ्रेंच Odontological अनुसंधान संस्थान (IFRO) के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bisphenol A Sigma Aldrich, Saint Louis MO 239658
formalin 10% Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO HT5012
Tri-Reagent Euromedex, France TR118
RLT buffer Qiagen, Les Ulis, France 74126 RNeasy Protect Mini Kit
Androgen receptor antibody Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) sc-816 rabbit polyclonal antibody
PBS 10x EUOMEDEX ET330.A
Sodium fluoride (NaF) Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO S-1504
paraplast regular Leica microsystems, Nanterre cedex, France 39601006 called was/parafin in the text
tissue OCT VWR, Fontenay-sous-Bois, France 411243
Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm PHYMEP , Paris, France 14084-08
Handle for Scalpel Blades - 12.5 cm PHYMEP, Paris, France 10035-12
Curved Scalpel Blade PHYMEP , Paris, France 10035-20
Dissecting Knife - Fine/Straight Tip PHYMEP , Paris, France 10055-12
Circle Knife PHYMEP, Paris, France 10059-15
scalpel blades n°11 Swann-Morton VWR, Fontenay-sous-Bois, France 233-0024
binocular lens Leica biosystems, Nanterre cedex, France MZFLIII

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reकर्षण अंक 133 चूहा Incisor तामचीनी अंग Amelogenesis खनिज तामचीनी Hypomineralization अंत-स्रावी अवरोधकों फ्लोराइड
पर्यावरणीय विषालु के संपर्क में आए चूहों के Mandibular Incisor से तामचीनी अंग का सूक्ष्म-विच्छेदन
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Houari, S., Babajko, S., Loiodice,… More

Houari, S., Babajko, S., Loiodice, S., Berdal, A., Jedeon, K. Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants. J. Vis. Exp. (133), e57081, doi:10.3791/57081 (2018).

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