이 프로토콜의 목표는 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 경작을 설명. 이 메서드는 손상 된 세포 외 매트릭스에 RPE 세포 행동 공부에 적합.
비타민 및 항 산화 의학 눈 질병 연구에 의해 권장, “건조” 또는 위축 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 경우 90%를 나타내는 대 한 더 효과적인 치료가입니다. 치료는 느리게 하거나 지리적 위축 (GA)의 개발을 지체 필요 하 고이 과정의 일부인 Bruch의 막 병 리를 이해. 인간의 Bruch 막 변경 세포 망막 안료 상피 (RPE)의 손상에 기여 함으로써 AMD의 진행을 앞. AMD를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, 세 인간의 Bruch 막의 ex vivo 모델 역할 RPE 세포에서의 동작을 연구 하는 유용한 도구 불후 및 RPE 라인으로 1 차 셀 라인 유도 만능 줄기에서 파생 된 셀 (Ipsc)입니다. 여기, 우리 인간 기증자, 첨부 파일, apoptosis, 확산, 포토 리셉터 외부 phagocytize 수 등에서 수확된 인간의 Bruch 막 explants에 시드 RPE 세포 행동의 효과 확인할 수 있도록 상세한 방법 제시 세그먼트, 극성, 및 유전자 발현의 설립. 이 분석 결과 세/손상 세포 외 기질에 시드 때 RPE 세포의 기능적 특성을 평가 하기 위해 세 Bruch 막의 비보 전 모델을 제공 합니다.
나이 관련 구조 변경 인간의 Bruch 막, nitrosative 및 산화 스트레스 등 많은 요인에 의해 발생에 미치는 망막 안료 상피 (RPE) 세포에 기여 하 고 기능에 여러 해로운 효과 연령 관련 황 반 변성 (AMD)1,2,3,,45,6,7,8,9의 병 리 . 고급 위축 AMD 또는 지리적 위축에 대 한 세포 대체 요법을 고려할 때 치료 RPE 세포 위축의 침대에 세포의 이식이 필요 합니다. 인간의 Bruch 막 내에서 나이 관련 변경 부정적인 기질6,9,,1011 에 피해를 주어 이식된 RPE 세포 이식의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bruch의 막 생물학과 매트릭스 내에서 구조를 변경 하는 방법을 AMD에 진행에 기여 하는 연구 인간 질병 병 리를 이해 하는 데 필수적 이다. 따라서, 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 수확 전 비보 를 설명 하는 프로토콜을 개발 하는 눈 나이 관련 분야에서 수 사관에 대 한 중요 한 필요가 있다.
역사적으로, 그것은 지리적 위축 등 동물23세 인간의 Bruch의 멤브레인 모델 나이 관련 무질서에 어렵게 되었습니다. 이 이러한은 설치류 및 질병 모델링, 뿐만 아니라 대부분 척추24에서 망막의 부족을 위해 자주 사용 하는 다른 종에 비해 인간의 장 수를 포함 한 여러 요소에서 발생 합니다. 여기에 설명 된 방법의 장점은 셀 세 또는 병에 걸린 개인의 게시물 부검 눈에서 추출한 Bruch의 막에 직접 테스트할 수 있습니다. 이 글의 전반적인 목표 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 ex vivo 모델에 대 한 상세한 방법론을 제공 하는, 인간의 Bruch의 격리를 포함 하 여 인간 기증자에서 막 explants 및 RPE의 시드 셀에 대 한 다운스트림 실험입니다. 이 모델 기질 손상 RPE 세포 기능과 병 리20,25,26,,2728에 기여를 조사 관련 모델 될 수 있습니다.
세 인간 Bruch 막 (기질) AMD의 질병의 진행에 기여 하 고 따라서이 변경 된 매트릭스 RPE 세포 역 기능에 기여 하는 방법을 이해할 필요가 있다. AMD에서 연령과 관련 된 변화를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, ex vivo 모델 시스템 질병의 효과 모방 하는 이상 이해 하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이 원고에 설명 된 방법론 일관 Bruch의 막 explants 및 문화 RPE 세포 주, 불멸 하 게, 또는 줄기 세포 유래 RPE 세포 라인을 포함 하 여 인간을 사용할 수 있습니다.
앞에서 설명 했 듯이, 인간의 Bruch 막 explants는 NDRI에서 공급 됩니다. 프로토콜 허용 되 기증자 눈에 대 한 설정 기준을 지정 NDRI로 설치 된다. 예를 들어 기증자도 없고 알려진된 망막 눈 질병, 눈/글로브가 죽음 후에 10 h 이내 검색 있고 글로브 (얼음에 숙박 패키지 배달)을 통해 죽음 후 48 h 이내 실험실에 도착. 적절 한 나이 범위와 연구, 예의 통계 분석에 필요한 눈의 수를 지정., 20-49 세 50-89 년의 세 사이의 기증자 로부터 5 글로브 쌍 사이 기증자에서 글로브의 5 쌍.
눈 글로브의 가용성, 일반적으로 평균 10 쌍 글로브 사용할 수의 매달 마다 다릅니다. 기본, 취소 확인 된 기증자 정보 눈 패키지 도착: 나이, 인종, 죽음, 죽음의 원인의 때, 과거의 병력 (질병 목록 또는 comorbidities) 간략 한.
가장 중요 한 것은, 인간의 Bruch 막 explants 수확 눈의 유리 체, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한의 격리 수 있도록 앞쪽 세그먼트의 제거를 해야 합니다. 일단 Bruch의 막 분리, RPE 세포 다양 한 농도에서 acellular explants에 시드 고 다운스트림 실험에 대 한 양식 수 있습니다. 여기에 설명 된 대로 중요, 되도록 laminal 표면 이다 연결-최대 하지 기계적 손상을 방지 하려면 표면 감동 하는 동안 격리 Bruch 막의 방향에 주의 기울이고 준비 및 절차 처리는 기질 표면 구조입니다.
또한 주목 해야 한다 Bruch의 막 explant 시스템을 사용 하는 경우는 개별 기증자 게놈 배경 등 다운스트림 실험의 결과, Bruch의 막의 나이 또는 Bruch의의 사후 시간에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 변수 막, 그리고 Bruch의 막, 즉의 위치., 중앙 또는 주변 Bruch의 막 explants의 부분. 다른 인체 조직 연구와 마찬가지로 하나 필요한 통계적 인 힘을 일치 하는 기증자 눈 나이 적절 한 경우 적절 한 기증자 눈 샘플 번호를 모집 합니다. 안구 은행에서 눈을 수락에 대 한 엄격한 기준을 설정 하는 것은 중요 한 매개 변수입니다. 눈을 10 h 사후 enucleated는 그리고 Bruch의 막 준비 죽음 후 24-48 시간 이내에 수확 수 있습니다 허용 합니다. 시 신경 사이트 방향에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다와 같은 위치를 사용 하 여 실험 및 연구 그룹을 제어. 이러한 조치를 취 함으로써 한 실험적인 변화를 최소화할 수 있습니다.
요약 하자면, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 하 고 연령과 질병에 의해 영향의 이해가 AMD의는 이상에 그것의 기여를 이해 하는 데 중요 합니다. Ex vivo 기술을 사용 하는 모델 시스템 인간 직물을 사용 하 여 이러한 효과 조사 하기 위해 귀중 한 도구입니다. 여기는 인간 기증자 explants 세 Bruch 막의 관련 전 비보 모델로 사용 하는 방법에 설명 합니다. 이 기술은 구조 매트릭스 내에서 변경 하는 방법을 조사 하는 연구 도구 오버레이 RPE에 영향을 미칠 수 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 멤브레인을 사용 하 수 있도록 첨부 파일, 확산, 그리고 유전자 식25 셀 동작 , 27. 비슷한 ex vivo 모델 시스템의 성공적인 개발 AMD의 우리의 이해를 심화 하 고 새로운 치료 옵션의 개발을 촉진.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 망막 퇴행 성 질병 기초 싸우는 장 님에 대 한 방지 실명, 뉴욕, www.rpbusa.org, 및 더 큰 뉴욕 센터 연구에 의해 지원 됩니다 www.blindness.org. 저자는 Luanna 바르 톨 로메 오, 박사,이 원고에의 그녀의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다.
Human donor globes | National Disease Research Interchange, NDRI | ||
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
Carbon-dioxide independent media | Thermo Fisher Scientific | 18045-088 | |
60-mm polystyrene petri dish | Corning Inc. | 351007 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores | Merck Millipore | JGWP04700 | |
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system | Thermo Fisher Scientific | 09-753-102 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576-5G | |
35 × 10mm culture dish | VWR International | 25373-041 | |
Trephine | Accutome | AM0570 60 | |
96 well plate | Corning Inc. | 3595 | |
Minimum essential media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032-1MU | |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1914 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 1336-21-6 |