इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य वृद्ध और/या रोगग्रस्त मानव Bruch की झिल्ली पर रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं के संवर्धन को प्रदर्शित करने के लिए है । यह विधि एक समझौता extracellular मैट्रिक्स पर RPE सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है ।
विटामिन और एंटीऑक्सीडेंट उंर से संबंधित नेत्र रोग अध्ययन द्वारा सिफारिश के अलावा, वहां के लिए कोई प्रभावी चिकित्सा है “सूखी,” या एट्रोफिक उंर से संबंधित धब्बेदार अध (AMD) जो मामलों के ९०% का प्रतिनिधित्व करता है । चिकित्सा के लिए भौगोलिक शोष (GA) के विकास को धीमा या मंदबुद्धि की जरूरत है, और समझ है Bruch झिल्ली विकृति इस प्रक्रिया का हिस्सा है । मानव Bruch की झिल्ली में परिवर्तन रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं की क्षति के लिए योगदान देकर AMD की प्रगति के पहले । AMD अध्ययन करने के लिए पर्याप्त पशु मॉडलों की कमी को देखते हुए, वृद्ध मानव Bruch की झिल्ली के पूर्व vivo मॉडल एक उपयोगी उपकरण के रूप में अमर और प्राथमिक सेल लाइनों से RPE कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रेरित pluripotent स्टेम से व्युत्पंन RPE लाइनों की सेवा कक्ष (iPSCs) । यहां, हम एक विस्तृत तरीका है कि एक RPE सेल व्यवहार के प्रभाव का निर्धारण करने की अनुमति देता वर्तमान मानव दाताओं से काटा मानव Bruch की झिल्ली explants, लगाव, apoptosis और प्रसार सहित, क्षमता phagocytize photoreceptor बाहरी खंड, ध्रुवीयता की स्थापना, और जीन अभिव्यक्ति । यह परख वृद्ध Bruch की झिल्ली के एक पूर्व vivo मॉडल प्रदान करता है RPE कोशिकाओं के कार्यात्मक विशेषताओं का आकलन जब वृद्ध पर वरीयता प्राप्त/
आयु से संबंधित संरचनात्मक परिवर्तन मानव Bruch की झिल्ली, जो nitrosative और ऑक्सीडेटिव तनाव सहित कई कारकों के कारण होता है, रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं के समारोह पर कई बचके प्रभाव डालती है और करने के लिए योगदान देता है उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन (AMD) की विकृति1,2,3,4,5,6,7,8,9 . जब उंनत एट्रोफिक AMD या भौगोलिक शोष के लिए सेल प्रतिस्थापन थेरेपी पर विचार, उपचार की संभावना RPE सेल शोष के एक बिस्तर पर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण की आवश्यकता होगी । मानव Bruch की झिल्ली के भीतर आयु से संबंधित परिवर्तन प्रत्यारोपित RPE कोशिका भ्रष्टाचार की सफलता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकते हैं, extracellular मैट्रिक्स के लिए नुकसान को देखते हुए6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. जांच मानव है Bruch झिल्ली जीवविज्ञान और मैट्रिक्स के भीतर संरचनात्मक परिवर्तन कैसे AMD के लिए प्रगति में योगदान रोग विकृति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, उम्र में जांचकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है संबंधित नेत्र क्षेत्र प्रोटोकॉल है कि वृद्ध और/या रोगग्रस्त मानव Bruch की झिल्ली के पूर्व vivo कटाई का वर्णन का विकास ।
ऐतिहासिक रूप से, यह भौगोलिक शोष और पशुओं में एक वृद्ध मानव Bruch की झिल्ली के रूप में मॉडल उंर से संबंधित विकारों के लिए मुश्किल हो गया है23। इस कठिनाई को कुतर और अन्य प्रजातियों अक्सर रोग मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया, साथ ही सबसे रीढ़24में एक मैक्युला की कमी की तुलना में मनुष्यों की दीर्घायु सहित कई कारकों से उत्पन्न होती है । इस के साथ साथ वर्णित विधि का लाभ यह है कि कोशिकाओं Bruch की झिल्ली पर सीधे परीक्षण किया जा सकता है वृद्ध और के पोस्ट मार्टम आंखों से निकाला/ इस अनुच्छेद के समग्र लक्ष्य के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करने के लिए एक पूर्व vivo मॉडल के वृद्ध और/या रोगग्रस्त मानव है Bruch झिल्ली मानव Bruch की झिल्ली explants के अलगाव सहित मानव दाताओं से और RPE कोशिकाओं के बोने के लिए बहाव प्रयोगों । यह मॉडल RPE सेल फंक्शन और पैथोलॉजी20,25,26,27,28पर extracellular मैट्रिक्स क्षति के योगदान की जांच करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
आयु वर्ग के मानव Bruch की झिल्ली (extracellular मैट्रिक्स) AMD के रोग प्रगति करने के लिए योगदान देता है और इस तरह वहाँ एक को समझने की जरूरत है कैसे इस बदल मैट्रिक्स RPE कोशिका शिथिलता के लिए योगदान देता है. AMD में उम्र से संबंधित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त पशु मॉडलों की कमी को देखते हुए, पूर्व vivo मॉडल सिस्टम है कि रोग के प्रभाव की नकल pathophysiology को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं । इस पांडुलिपि में वर्णित पद्धति का प्रयोग लगातार मानव Bruch की झिल्ली explants और संस्कृति RPE कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए किया जा सकता है जिनमें प्राथमिक, अमर, या स्टेम सेल-व्युत्पन्न RPE कोशिका रेखाएं शामिल हैं.
जैसा कि पहले उल्लेख किया है, मानव Bruch की झिल्ली explants NDRI से स्रोत रहे हैं । एक प्रोटोकॉल NDRI के साथ स्थापित किया गया है जो दाता आंखों के लिए निर्धारित मानदंड निर्दिष्ट करता है स्वीकार्य है । उदाहरण के लिए, दाताओं कोई जाना जाता रेटिना नेत्र रोग होना चाहिए, आंखें/globes 10 के भीतर प्राप्त कर रहे है मौत के बाद एच और globes ४८ के भीतर प्रयोगशाला में आने के बाद मौत के बाद (बर्फ पर रातोंरात पैकेज वितरण के माध्यम से) । उपयुक्त आयु सीमा और अध्ययन के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आवश्यक आंखों की संख्या निर्दिष्ट करें, उदा, ५० की उंर के बीच दाताओं से 20-49 साल और पांच ग्लोब जोड़े की उंर के बीच दाताओं से globes के पांच जोड़े-८९ साल ।
आंख globes की उपलब्धता, आम तौर पर हर महीने उपलब्ध globes के दस जोड़े औसत बदलता है । आंख पैकेज बुनियादी, de-दाता जानकारी की पहचान के साथ आता है: आयु, दौड़, मौत का समय, मृत्यु का कारण, और संक्षिप्त पिछले चिकित्सा इतिहास (रोग लिस्टिंग या comorbidities) ।
सबसे महत्वपूर्ण बात, हार्वेस्टिंग मानव Bruch की झिल्ली explants आंख और अवलेह के पूर्वकाल खंड को हटाने की आवश्यकता है, RPE-Bruch की झिल्ली-रंजित परिसर के अलगाव के लिए अनुमति देता है । एक बार Bruch की झिल्ली अलग है, RPE कोशिकाओं अलग सांद्रता और बहाव के प्रयोगों के लिए प्रसंस्कृत पर acellular explants पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है । तैयारी और के रूप में वर्णित प्रक्रिया से निपटने के लिए महत्वपूर्ण है, अलग है Bruch झिल्ली के उंमुखीकरण पर ध्यान देने के लिए सुनिश्चित करें कि laminal सतह का सामना करना पड़ रहा है, जबकि सतह को छू नहीं खिंचने से बचने के लिए extracellular मैट्रिक्स सतह संरचना ।
यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब Bruch की झिल्ली explant प्रणालियों का उपयोग कर, वहां कुछ चर कि इस तरह के व्यक्तिगत दाता जीनोमिक पृष्ठभूमि के रूप में बहाव प्रयोगों के परिणामों को प्रभावित कर सकता है, Bruch की झिल्ली की उंर, या गुजाइश के समय Bruch है झिल्ली, और Bruch की झिल्ली का स्थान, अर्थात, Bruch की झिल्ली explants के मध्य या परिधीय भाग. किसी भी अंय मानव ऊतक अध्ययन के साथ के रूप में, एक उचित दाता आंख नमूना संख्या की भर्ती के लिए आवश्यक सांख्यिकीय शक्ति और मैच दाता आंख उंर अगर उचित होगा । आंख बैंकों से आंखें स्वीकार करने के लिए सख्त मानदंड स्थापित एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है । केवल आंखें है कि 10 से कम h गुजाइश enucleated है और जो Bruch की झिल्ली तैयारी मौत के बाद 24-48 ज के भीतर काटा जा सकता है स्वीकार करते हैं । ऑप्टिक तंत्रिका साइट अभिविंयास के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और प्रायोगिक और नियंत्रण अध्ययन समूहों के लिए एक ही स्थान का उपयोग करें । इन उपायों को लेकर, एक प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं ।
संक्षेप में, RPE-Bruch की झिल्ली की समझ-रंजित परिसर और कैसे यह उम्र और रोग से प्रभावित है AMD के pathophysiology में अपने योगदान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । मॉडल सिस्टम है कि पूर्व vivo तकनीक रोजगार एक महत्वपूर्ण उपकरण के लिए मानव ऊतक का उपयोग कर इन प्रभावों की जांच कर रहे हैं । इस के साथ साथ, हम एक पद्धति है कि वृद्ध Bruch की झिल्ली के एक प्रासंगिक पूर्व vivo मॉडल के रूप में मानव दाता explants रोजगार का वर्णन । इस तकनीक का एक अनुसंधान उपकरण के रूप में वृद्ध और/या रोगग्रस्त मानव Bruch की झिल्ली का उपयोग करने की अनुमति देता है कैसे मैट्रिक्स के भीतर संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने के लिए अनुलग्नक सहित RPE सेल व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, प्रसार, और जीन अभिव्यक्ति25 , 27. समान पूर्व विवो मॉडल प्रणालियों के सफल विकास और AMD की हमारी समझ और उपंयास चिकित्सीय विकल्पों के विकास की सुविधा होगी ।
The authors have nothing to disclose.
इस अनुसंधान के लिए अंधापन, ंयूयॉर्क, www.rpbusa.org, और ग्रेटर ंयूयॉर्क रेटिना अपक्षयी रोग फाउंडेशन लड़ अंधापन, www.blindness.org के लिए केंद्र को रोकने के अनुसंधान द्वारा समर्थित है । लेखक Luanna Bartholomew, पीएच. डी., इस पांडुलिपि के उसे महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Human donor globes | National Disease Research Interchange, NDRI | ||
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
Carbon-dioxide independent media | Thermo Fisher Scientific | 18045-088 | |
60-mm polystyrene petri dish | Corning Inc. | 351007 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores | Merck Millipore | JGWP04700 | |
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system | Thermo Fisher Scientific | 09-753-102 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576-5G | |
35 × 10mm culture dish | VWR International | 25373-041 | |
Trephine | Accutome | AM0570 60 | |
96 well plate | Corning Inc. | 3595 | |
Minimum essential media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032-1MU | |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1914 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 1336-21-6 |