המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את culturing תאי (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, על הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך. שיטה זו מתאימה ללמוד RPE בהתנהגות התא על מטריצה חוץ-תאית פרוץ.
ויטמינים ונוגדי חמצון המומלץ על ידי המחקר מחלת עיניים ז, אין אין טיפול יעיל עבור “יבש”, או מנוונת הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD) המייצגת 90% מהמקרים. טיפולים נדרשים כדי להאט או מפגר הפיתוח של אטרופיה גיאוגרפית (ג’י אי), להבנת הפתולוגיה ממברנה של ברוך הוא חלק מהתהליך הזה. שינויים בקרום של אדם ברוך להקדים את ההתקדמות של AMD בתרומה לחברה הנזק של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תאים. לאור העדר מספיק חייתיים ללמוד AMD, לשעבר vivo מודלים של בני ברוך האנושי של הממברנה לשמש כלי שימושי כדי ללמוד על אופן הפעולה של תאי RPE מ מונצחים, קווים התא הראשי, כמו גם קווי RPE נגזר גזע pluripotent המושרה תאים (iPSCs). כאן, אנו מציגים שיטה מפורט המאפשר אחד כדי לקבוע את ההשפעות של התנהגות התא RPE נזרע על explants ממברנה של ברוך האנושי שנקטפו מתורמים האנושי, כולל קובץ מצורף, אפופטוזיס, התפשטות, היכולת phagocytize קולט אור חיצוני מקטעים, הקמת קוטביות, ביטוי גנים. זה וזמינותו מספק מודל ex-vivo של הממברנה של ברוך בן כדי להעריך את המאפיינים פונקציונלי של תאי RPE כאשר נזרע על נחשף/יישון מטריצה חוץ-תאית.
הקשורות לגיל שינויים מבניים הקרום של אדם ברוך, אשר נגרמת על ידי גורמים רבים, כולל nitrosative סטרס חמצוני, מפעילה מספר השפעות מזיקות על הפונקציה של הפיגמנט ברשתית אפיתל (RPE) תאים ותורמת פתולוגיה של הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . כאשר שוקלים טיפול בתחליפי תא המתקדם AMD מנוונת או אטרופיה גיאוגרפית, טיפול סביר ידרוש את השתלת תאים על גבי מצע ניוון תאי RPE. שינויי גיל בתוך הממברנה של אדם ברוך עלולה להשפיע לרעה על ההצלחה של המושתלים שתלי תאי RPE, שגבה את הנזק10,11 9,6,מטריצה חוץ-תאית , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. האדם חקירת קרום ביולוגיה של ברוך ו כיצד מבנה משתנה בתוך המטריצה לתרום ההתקדמות ל AMD היא חיונית להבנת המחלה פתולוגיה. לפיכך, יש צורך החוקרים בשדה הקשורות לגיל העין לפתח פרוטוקולים המתארים vivo לשעבר קציר של הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך.
מבחינה היסטורית, מתקשים להפרעות הקשורות לגיל מודל כגון אטרופיה גיאוגרפית קרום של בני אדם ברוך חיות23. הקושי נובע גורמים רבים כולל את תוחלת החיים של בני אדם לעומת מכרסמים ו מינים אחרים בשימוש תכוף עבור מידול המחלה, כמו גם חוסר macula רוב החולייתנים24. היתרון של השיטה המתוארת במסמך זה הוא כי תאים יכול להיבדק ישירות על הממברנה של ברוך מופק פוסט מורטם עיניים של אנשים בגילאי ו/או חולה. המטרה הכוללת של מאמר זה היא לספק מתודולוגיה מפורט עבור מודל לשעבר vivo של גיל ו/או חולה אנוש ברוך של הממברנה, כולל ניתוקה של אדם ברוך של קרום explants מתורמים אנושי, זריעה של RPE תאים עבור ניסויים במורד הזרם. מודל זה יכול לשמש כמודל הרלוונטיים כדי לחקור את התרומה של מטריצה חוץ-תאית נזק ב RPE תא פתולוגיה ותפקוד20,25,26,27,28.
הממברנה בן ברוך האנושי של (מטריצה חוץ-תאית) תורמת התקדמות המחלה של AMD, ולכן יש צורך להבין כיצד שינו מטריצה זו תורמת בתפקוד תאי RPE. לאור העדר מספיק חייתיים ללמוד שינויי גיל ב- AMD, שמחוץ מערכות מודל המחקים את ההשפעות של המחלה יכול לשמש כלי חשוב להבין הפתופיזיולוגיה. המתודולוגיה המתוארת בכתב היד ניתן לבודד האנושי explants הממברנה של ברוך ואת התרבות RPE תאים, כולל ראשי מונצחים, קווים, או נגזר תאי RPE תא באופן עקבי.
כפי שהוזכר קודם לכן, explants ממברנה של אדם ברוך הטרייה של NDRI. פרוטוקול נוסדה עם NDRI אשר מציינת על הקריטריונים שהוגדרו עבור התורם עיניים להיות מקובל. לדוגמה, תורמים כנראה אין מחלות עיניים ברשתית מוכר, העיניים/גלובס מאוחזרות בתוך 10 h לאחר המוות, גלובס מגיעים במעבדה בתוך 48 שעות לאחר המוות (באמצעות משלוח החבילה לילי על קרח). ציין את טווח הגילאים המתאים ואת מספר העיניים הדרושים לניתוח סטטיסטי של המחקר, למשל., חמישה זוגות של גלובס מתורמים בין הגילאים 20-49 שנים עד חמישה זוגות גלוב מתורמים בין הגילאים 50-89 שנים.
הזמינות של גלובס העין משתנה, בדרך כלל ממוצע של עשרה זוגות של גלובס זמין בכל חודש. החבילה העין מגיע עם מידע בסיסי, שזוהה מבטל את התורם: גיל, גזע, שעת המוות, סיבת המוות, ותתדרך העבר הרפואי (פירוט מחלה או מחלות רקע).
והכי חשוב, קציר ממברנה explants של אדם ברוך דורש את ההסרה של המקטע הקדמי של העין, הזגוגיות, המאפשר הבידוד של קומפלקס ממברנה-דמית העין של RPE-ברוך. ברגע קרום של ברוך מבודד, תאי RPE יכול להיות נזרע על גבי explants acellular בריכוזים שונים, תרבותי לניסויים במורד הזרם. הכנה וטיפול פרוצדורלי כמתואר להלן הוא קריטי, תשומת לב הכיוון של הממברנה של ברוך מבודד כדי לוודא כי המשטח laminal הוא שפונה למעלה תוך כדי לא לגעת במשטח מכנית כדי למנוע נזק מטריצה חוץ-תאית מבנה פני השטח.
יש גם לציין כי בעת שימוש ממברנה explant מערכות של ברוך, ישנם משתנים מסוימים אשר עשויים להשפיע על תוצאות ניסויים במורד הזרם כגון רקע גנומית התורמים, לגיל קרום של ברוך, או שעה לאחר המוות של ברוך ממברנה, ואת המיקום של הממברנה של ברוך, כלומר., מרכזי או היקפי חלק explants ממברנה של ברוך. כמו עם כל המחקר רקמות אנושיות אחרות, אחד לגייס את המספר דוגמת עין התורם המתאים יש את הכוח סטטיסטית הצורך ולהתאים גיל עין התורם במידת הצורך. קביעת קריטריונים מחמירים על קבלת העיניים מבנקים העין הוא פרמטר קריטי. לקבל רק העיניים זה הם enucleated לאחר המוות פחות מ 10 h ואשר ניתן לקצור הכנה ממברנה של ברוך בתוך 24-48 שעות לאחר המוות. האתר עצב הראייה יכול לשמש כסמן לאוריינטציה, ולהשתמש באותם המיקומים עבור ניסיוני ולשלוט קבוצות לימוד. על-ידי נקיטת אמצעים אלה, אחד יכול למזער את השתנות ניסיוני.
לסיכום, ההבנה של ברוך-RPE את מתחם דירות ממברנה-דמית העין, איך זה מושפע הגיל ומחלות חיוני להבנת תרומתה הפתופיזיולוגיה של AMD. דגם מערכות שמעסיקים שמחוץ טכניקות הן כלי חשוב לחקור תופעות אלה באמצעות רקמה אנושית. במסמך זה, אנו מתארים מתודולוגיה מעסיקה explants התורם האנושית כמודל הרלוונטיים vivo לשעבר של הממברנה של ברוך בן. טכניקה זו מאפשרת להשתמש ממברנה בגילאי ו/או חולה אנוש ברוך של כלי מחקר כדי לחקור כיצד מבנה משתנה בתוך המטריצה יכול להשפיע על-ידי כיסוי RPE בהתנהגות התא כולל ביטוי של קובץ מצורף, התפשטות, ג’ין-25 , 27. פיתוח מוצלח של ex-vivo דגם מערכות דומות לקדם את ההבנה שלנו של AMD וכדי להקל על הפיתוח של הרומן אפשרויות טיפוליות.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה היא נתמכת על ידי מחקר למנוע עיוורון, ניו יורק, www.rpbusa.org של מרכז ניו יורק רבתי עבור רשתית ניווניות מחלות למלחמה בעיוורון, www.blindness.org. המחברים רוצה להודות Luanna ברתולומיאו, Ph.d., שלה סקירה ביקורתית של כתב היד הזה.
Human donor globes | National Disease Research Interchange, NDRI | ||
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
Carbon-dioxide independent media | Thermo Fisher Scientific | 18045-088 | |
60-mm polystyrene petri dish | Corning Inc. | 351007 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores | Merck Millipore | JGWP04700 | |
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system | Thermo Fisher Scientific | 09-753-102 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576-5G | |
35 × 10mm culture dish | VWR International | 25373-041 | |
Trephine | Accutome | AM0570 60 | |
96 well plate | Corning Inc. | 3595 | |
Minimum essential media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032-1MU | |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1914 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 1336-21-6 |