Målet med denne protokol er at demonstrere dyrkning af retinale pigment epitel (ÅV) celler på alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran. Denne metode er velegnet til at studere ÅV celle adfærd på en kompromitteret ekstracellulære matrix.
Bortset fra vitaminer og antioxidanter anbefalet af den aldersbetingede øjensygdom Study, er der ingen effektiv behandling for “tørre”, eller atrofisk aldersrelateret makuladegeneration (AMD) som udgør 90% af tilfældene. Behandlinger er nødvendige for at bremse eller forsinke udviklingen af geografisk atrofi (GA), og forstå Bruchs membran patologi er en del af denne proces. Ændringer i menneskelige Bruchs membran foran progression af AMD ved at bidrage til beskadigelse af retinale pigment epitel (ÅV) celler. I betragtning af manglen på tilstrækkelige dyremodeller for at studere AMD, tjene ex vivo modeller for alderen menneskelige Bruchs membran som et nyttigt redskab til at undersøge funktionaliteten af ÅV celler fra udødeliggjort og primære cellelinjer samt ÅV linjer afledt af induceret pluripotente stamceller celler (iPSCs). Vi præsenterer her, en detaljeret metode, der gør det muligt at fastslå virkningerne af ÅV celle adfærd seedede på høstede menneskelige Bruchs membran explants fra menneskelige donorer, herunder udlæg, apoptose og spredning, evnen til at phagocytize fotoreceptor ydre segmenter, etablering af polaritet og genekspression. Denne analyse giver en ex vivo model af alderen Bruchs membran til at vurdere de funktionelle egenskaber af ÅV celler når seedede på alderen/kompromitteret ekstracellulære matrix.
Aldersrelaterede strukturelle ændringer til menneskelige Bruchs membran, som er forårsaget af mange faktorer, herunder nitrosative og oxidativ stress, udøver flere skadelige virkninger på funktionen af retinale pigment epitel (ÅV) celler og bidrager til den patologi af aldersrelateret makuladegeneration (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Når de overvejer celleudskiftnings for avancerede atrofisk AMD eller geografisk atrofi, vil behandling sandsynligvis kræve transplantation af celler på en seng af ÅV celle atrofi. Aldersrelaterede forandringer i menneskelige Bruchs membran kan påvirke succes af transplanterede ÅV celle grafts, givet at skaden til ekstracellulære matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Investigating menneskelige Bruchs membran biologi og hvordan strukturelle ændringer inden for matrixen bidrage til progression til AMD er afgørende for at forstå sygdom patologi. Der er således et kritisk behov for efterforskere i feltet aldersbetingede øje at udvikle protokoller, der beskriver ex vivo høst af alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran.
Historisk set har det været svært at model aldersbetingede lidelser såsom geografisk atrofi og en ældre menneskers Bruchs membran i dyr23. Dette problem skyldes flere faktorer herunder levetiden af mennesker i forhold til gnavere og andre arter, der ofte anvendes for sygdom modellering, samt manglen på en gule plet i de fleste hvirveldyr24. Fordelen ved metoden beskrevet heri er, at cellerne kan testes direkte på Bruchs membran udvundet fra post mortem øjne af alderen og/eller syge enkeltpersoner. Det overordnede mål med denne artikel er at fremlægge en detaljeret metodologi for en ex vivo model af alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran, herunder isolering af menneskelige Bruchs membran explants fra menneskelige donorer og såning af ÅV celler til downstream eksperimenter. Denne model kan tjene som en relevant model til at undersøge bidrag af ekstracellulære matrix skader på ÅV celle funktion og patologi20,25,26,27,28.
Alderen menneskelige Bruchs membran (ekstracellulære matrix) bidrager til sygdomsprogression af AMD og der er således behov for at forstå hvordan denne ændrede matrix bidrager til ÅV celle dysfunktion. I betragtning af manglen på tilstrækkelige dyremodeller for at studere Aldersrelaterede forandringer i AMD, kan ex vivo modelsystemer der efterligner virkningen af sygdom tjene som et værdifuldt redskab til at forstå patofysiologien. Den metode, der beskrives i dette håndskrift kan bruges konsekvent isolere menneskelige Bruchs membran explants og kultur ÅV celler, herunder primær, udødeliggjort eller stamcelle-afledt ÅV cellelinjer.
Som nævnt tidligere, er menneskelige Bruchs membran explants indkøbt fra NDRI. En protokol, der er etableret med NDRI, der angiver kriterier for donor øjne at være acceptabel. For eksempel, donorer skal have ingen kendte retinal øjensygdomme, øjne/glober er hentet inden for 10 timer efter døden og glober ankommer til laboratoriet inden for 48 timer efter døden (via overnight pakke levering på is). Angiv den relevante aldersgruppe og antallet af øjne brug for statistisk analyse af undersøgelsen, fx., fem par af glober fra donorer i alderen 20-49 år og fem globe par fra donorer i alderen mellem 50-89 år.
Tilgængeligheden af øjet glober varierer generelt gennemsnit ti par af glober rådighed hver måned. Øjet pakke ankommer med grundlæggende, de identificerede donor oplysninger: alder, race, dødstidspunktet, dødsårsag, og kort forbi sygehistorie (sygdom notering eller co-morbiditet).
Vigtigst, kræver høst menneskelige Bruchs membran explants fjernelse af den forreste segment af øjet og glasagtige, giver mulighed for isolation af ÅV-Bruchs membran-choroidea kompleks. Når Bruchs membran er isoleret, kan ÅV celler seedede på de acellulær explants ved varierende koncentrationer og kulturperler for downstream eksperimenter. Forberedelse og proceduremæssig håndtering som beskrevet heri er kritisk, være opmærksom på orientering af den isolerede Bruchs membran til at sikre den laminal overflade vender-op mens du ikke rører overfladen mekanisk for at undgå at beskadige den ekstracellulær matrix overfladestruktur.
Det skal også bemærkes, at når du bruger Bruchs membran eksplantat systemer, der er nogle variabler, der kan påvirke resultaterne af downstream eksperimenter som enkelte donor genomisk baggrund, alder af Bruchs membran eller postmortem tid af Bruchs membran, og placeringen af Bruchs membran, dvs., centrale eller perifere del af Bruchs membran explants. Som med alle andre menneskelige væv undersøgelse, skal man rekruttere passende donor øje prøvenummer for at have den nødvendige statistiske magt og matche donor øje alder eventuelt. Fastsættelse af strenge kriterier for at acceptere øjne fra øjet banker er et afgørende parameter. Kun acceptere øjne der er kerneløse mindre end 10 h postmortem og som Bruchs membran forberedelse kan høstes inden for 24-48 timer efter døden. Webstedet synsnerven kan anvendes som markør for orientering, og bruge de samme steder for eksperimenterende og styre studiegrupper. Ved at træffe disse foranstaltninger, kan man minimere eksperimentel variation.
I Resumé, forståelse af ÅV-Bruchs membran-choroidea kompleks og hvordan det påvirkes af alder og sygdom er afgørende for at forstå dens bidrag til patofysiologien af AMD. Modelsystemer, der beskæftiger ex vivo teknikker er et værdifuldt redskab til at undersøge disse effekter ved hjælp af menneskelige væv. Heri, beskriver vi en metode, der beskæftiger menneskelige donor explants som relevante ex vivo model af alderen Bruchs membran. Denne teknik gør det muligt at bruge alderen og/eller syge menneskers Bruchs membran som et forsknings-værktøj til at undersøge, hvordan strukturelle ændringer inden for matrixen kan påvirke overliggende ÅV celle adfærd herunder udlæg, spredning og gen expression25 , 27. vellykket udvikling af lignende ex vivo modelsystemer vil fremme vores forståelse af AMD og lette udviklingen af nye terapeutiske muligheder.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er støttet af forskning for at forebygge blindhed, New York, www.rpbusa.org og den større New York Center for Retinal degenerativ sygdom Foundation Fighting blindhed, www.blindness.org. Forfatterne vil gerne takke Luanna Bartholomew, Ph.D., for hendes kritiske gennemgang af dette manuskript.
Human donor globes | National Disease Research Interchange, NDRI | ||
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
Carbon-dioxide independent media | Thermo Fisher Scientific | 18045-088 | |
60-mm polystyrene petri dish | Corning Inc. | 351007 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores | Merck Millipore | JGWP04700 | |
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system | Thermo Fisher Scientific | 09-753-102 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576-5G | |
35 × 10mm culture dish | VWR International | 25373-041 | |
Trephine | Accutome | AM0570 60 | |
96 well plate | Corning Inc. | 3595 | |
Minimum essential media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032-1MU | |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1914 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 1336-21-6 |