このプロトコルの目的は、高齢者や病気にかかった人間ブルッフ膜の網膜色素上皮 (RPE) 細胞の培養を示すことです。このメソッドは、侵害された細胞外のマトリックスの RPE 細胞の挙動を研究に適しています。
別にビタミンや抗酸化物質加目病論文での推奨の「乾燥」や萎縮性加齢による黄斑変性症 (AMD) の場合の 90% を表すため有効な治療法はありません。療法が低速または地理的な萎縮 (GA) の発達を遅らせる必要し、ブルッフ膜の病理を理解することは、このプロセスの一部です。人間ブルッフ膜の変化は、網膜色素上皮 (RPE) の損傷に貢献する細胞 AMD の進行を前します。AMD を勉強するための十分な動物モデルの欠如を考えると、高齢者の人間ブルッフ膜のex vivoモデル提供から網膜色素上皮細胞の挙動を調べるための便利なツールが不死化し、RPE 線と同様、主細胞由来の多能性幹細胞 (Ips)。ここでは、添付ファイル、アポトーシスと増殖、感光体の外側を phagocytize する能力を含む人間のドナーから収穫された人間のブルッフ膜植でシード RPE 細胞の挙動の影響を確認することができます詳細な方法を提案します。セグメント、極性、および遺伝子発現の確立。この試金は、網膜色素上皮細胞と細胞外マトリックスの高齢者/侵害でシードの機能特性を評価するために高齢者ブルッフ膜のex vivoモデルを提供します。
Nitrosative 酸化ストレスなど、多くの要因によって引き起こされる人間ブルッフ膜の構造の変更を加齢に伴う網膜色素上皮 (RPE) 細胞し、に貢献の機能複数の有害な効果を発揮する、加齢に伴う黄斑変性症 (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9の病理.高度な萎縮性 AMD または地理的な萎縮細胞補充療法を検討するとき、治療は網膜色素上皮細胞の萎縮のベッドの上に細胞移植を必要可能性が高い。人間ブルッフ膜内の年齢関連の変更することができます悪影響を細胞外マトリックス6,9,10,11に被害を与えられた移植の網膜色素上皮細胞移植の成功,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. ブルッフ膜生物学およびマトリックス内の構造の変化は AMD への進行に貢献調査人間が病の病理を理解することが重要です。従って、高齢者や病気にかかった人間ブルッフ膜のex vivo収穫を記述するプロトコルを開発する加齢に伴う目のフィールドの調査官の重要な必要性があります。
歴史的、地理的な萎縮など動物23歳人間ブルッフの膜モデル加齢に伴う疾患に、難しかったです。この難しさは、齧歯動物およびモデリング、病だけでなく、ほとんどの脊椎動物24黄斑の欠如のために頻繁に使用される他の種と比較して人間の寿命を含む複数の要因から発生します。記載方法の利点は、高齢者や病気の個人のポスト mortem 目から抽出されたブルッフ膜の上に直接セルをテストできることです。この記事の全体的な目的は、高齢者や病気にかかった人間ブルッフ膜のex vivoモデルの詳細な方法を提供する、人間ブルッフの分離人間のドナーから外植体膜などの細胞網膜色素上皮の播種下流の実験。このモデルは、RPE 細胞機能と病理20,25,26,27,28損傷細胞外マトリックスの影響を検討する関連するモデルとして使用できます。
高齢者人間ブルッフ膜 (細胞外マトリックス) は、AMD の病気の進行に貢献し、従ってこの変更された行列が網膜色素上皮細胞機能障害に貢献する方法を理解する必要があります。AMD の加齢変化を検討するための十分な動物モデルの欠乏を与えられて、病気の効果を模倣のモデル システム前のヴィヴォは病態生理を理解するための貴重なツールとして使用できます。本稿で説明している手法を使用して、一貫してブルッフ膜外植片や培養網膜色素上皮細胞、主、不死化、または幹細胞由来網膜色素上皮細胞を含む人間を分離できます。
前述のように、人間のブルッフ膜外植片は、NDRI から供給されます。NDRI ドナー目が許容されるための基準セットを指定すると、プロトコルを設立します。たとえば、ドナーは知られている網膜目の病気をしてはならない、死後後 10 時間以内取得目/地球儀、地球儀が (氷の上の夜通しのパッケージ配達) を経由して死後後 48 時間以内研究室に到着します。適切な年齢範囲と、例えば研究の統計解析に必要な目数を指定します。、20-49 歳の年齢層と 50-89 歳の年齢の間のドナーからの 5 つの世界ペア間ドナーからグローブの 5 つのペア。
通常の平均使用可能な地球儀の 10 ペア毎月目地球儀の可用性が異なります。目パッケージは、基本的な匿名化したドナー情報と共に到着: 年齢、競争、死、死の原因の時、既往歴 (病気一覧または併存疾患) 簡単な。
最も重要なは、目の硝子体、網膜色素上皮-脈絡膜脈絡膜複合体の分離を可能にする眼の除去が必要です人間ブルッフ膜外植体を収穫します。一度、ブルッフ膜が分離されている網膜色素上皮細胞をさまざまな濃度で無細胞植にシードし、下流の実験のために培養できます。記載としては重要な亂の表面が機械的に損傷を防ぐため表面を触れていないが直面して-を確認する分離ブルッフ膜の向きに注意を払って準備と手続き型の処理、細胞外マトリックスの表面構造。
ブルッフの膜植システムを使用している場合、個々 の供給ゲノム背景など下流の実験の結果、ブルッフの膜の年齢や、ブルッフの死後の時間に影響を与える可能性があります。 いくつかの変数があることを指摘する必要があります。膜とブルッフの膜、すなわち場所。 中枢または末梢、ブルッフ膜外植体の一部。他のヒト組織研究と統計力を持つし、一致ドナー眼年齢に応じて適切なドナー目サンプル数を募集する必要があります。アイバンクから目を受け入れるための厳格な基準を確立することは重要なパラメーターです。10 h 未満死後を除を死の後 24-48 時間以内、ブルッフ膜作製を収穫することができます目を受け付けます。視神経サイト向きのマーカーとして使用されるかもしれないし、の同じ場所を使用実験および研究グループを制御します。これらの措置を講ずること、実験的変動を最小限に抑えることができます 1 つ。
要約すると、網膜色素上皮-脈絡膜脈絡膜複合体および年齢や病気によって影響の理解は AMD の病態への貢献を理解する重要です。前のヴィヴォ技術採用モデル システムは、人間のティッシュを使用してこれらの効果を調査する貴重なツールです。ここで、高齢者ブルッフ膜の関連性の高いex vivoモデルとして人間のドナー植を採用する方法論について述べる。この手法マトリックス内の構造の変化を調査する研究ツールは RPE を重ねることを影響することが、高齢者や病気にかかった人間ブルッフ膜を使用することができます添付ファイル、増殖、および遺伝子発現25を含むセル動作,27. 同じような前のヴィヴォモデル システムの開発に成功、AMD の理解を深めるし、新規治療方法の開発を促進します。
The authors have nothing to disclose.
この研究は網膜変性疾患基礎戦いの盲目の失明を防ぐため、ニューヨーク、www.rpbusa.org、およびグレーター ニューヨーク センター研究によってサポートされて www.blindness.org。著者は、この原稿の彼女の批評の Luanna バーソロミュー、博士を感謝したいです。
Human donor globes | National Disease Research Interchange, NDRI | ||
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
Carbon-dioxide independent media | Thermo Fisher Scientific | 18045-088 | |
60-mm polystyrene petri dish | Corning Inc. | 351007 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores | Merck Millipore | JGWP04700 | |
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system | Thermo Fisher Scientific | 09-753-102 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576-5G | |
35 × 10mm culture dish | VWR International | 25373-041 | |
Trephine | Accutome | AM0570 60 | |
96 well plate | Corning Inc. | 3595 | |
Minimum essential media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032-1MU | |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1914 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 1336-21-6 |