Målet med denne protokollen er å vise dyrking av netthinnens pigment (RPE) epitelceller på alderen og/eller syke menneskelige Bruchs membran. Denne metoden er egnet til å studere RPE celle atferd på en kompromittert ekstracellulær matrix.
Bortsett fra vitaminer og antioksidanter anbefalt av Age-Related Eye Disease Study, er det ingen effektiv terapi for “tørr”, eller atrofier age-makuladegenerasjon (AMD) som representerer 90% av tilfellene. Behandling er nødvendig for å bremse eller retard utviklingen av geografiske atrofi (GA), og forstå Bruchs membran patologi er del av denne prosessen. Endringer i menneskelig Bruch membran foran progresjon av AMD ved å bidra til skade av netthinnens pigment epiteliale (RPE) celler. Gitt mangelen på tilstrekkelig dyremodeller å studere AMD, tjene ex vivo modeller av alderen menneskelige Bruchs membran som en nyttig verktøyet å studere atferden til RPE celler fra udødeliggjort og primære cellelinjer samt RPE linjene avledet fra indusert pluripotent stilk celler (iPSCs). Her presenterer vi en detaljert metode som gjør det mulig å fastslå effekten av RPE celle atferd seeded på høstet menneskelige Bruchs membran explants fra menneskelige givere, inkludert vedlegg, apoptose og spredning, muligheten til å phagocytize photoreceptor ytre segmenter, etablering av polaritet og genuttrykk. Denne analysen gir en ex vivo modell av alderen Bruch membran å vurdere funksjonelle egenskaper av RPE celler når seeded på alderen/kompromittert ekstracellulær matrix.
Age-relaterte strukturelle endringer i menneskelig Bruch membran, som er forårsaket av mange faktorer, inkludert nitrosative og oksidativt stress, har flere skadelige effekter på funksjon av netthinnens pigment epiteliale (RPE) celler og bidrar til den patologi av aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Når cellen erstatning terapi for avansert atrofier AMD eller geografiske atrofi, vil behandling trolig kreve transplantasjon av celler på en seng av RPE celle atrofi. Alder-relaterte endringer i menneskelig Bruch membranen kan påvirke suksessen av transplantert RPE celle grafts, skadene ekstracellulær matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. gransker menneskelige Bruchs membran biologi og hvordan strukturelle endringer innenfor matrise bidra til fremdriften til AMD er avgjørende for å forstå sykdom patologi. Dermed er det et kritisk behov for etterforskerne i feltet aldersrelatert øye å utvikle som beskriver ex vivo høsting av alderen og/eller syke menneskelige Bruchs membran.
Historisk har det vært vanskelig å modell aldersrelaterte lidelser som geografisk atrofi og en alderen menneskelige Bruchs membran i dyr23. Dette problemer oppstår fra flere faktorer, inkludert levetiden av Human sammenlignet gnagere og andre arter brukte for sykdom modellering, samt mangel på en macula i de fleste virveldyr24. Fordelen av metoden beskrevet her er at cellene kan testes direkte på Bruchs membran utvunnet fra post mortem øyne alderen og/eller syke individer. Det overordnede målet med denne artikkelen er å gi en detaljert metodikk for en ex vivo modell av alderen og/eller syke menneskelige Bruchs membran, inkludert isolering av menneskelig Bruch membran explants fra menneskelige givere og såing av RPE celler for nedstrøms eksperimenter. Denne modellen kan tjene som en relevant modell å undersøke bidrag av ekstracellulær matrix skader på RPE celle funksjon og patologi20,25,26,27,28.
Alderen menneskelige Bruchs membran (ekstracellulær matrix) bidrar til sykdomsprogresjon av AMD, og dermed er det behov for å forstå hvordan denne endrede matrise bidrar til RPE celle dysfunksjon. Gitt mangelen på tilstrekkelig dyremodeller å studere alder-relaterte endringer i AMD, kan ex vivo modellsystemer som etterligner effekten av sykdom tjene som et verdifullt verktøy for å forstå patofysiologien. Metodikk beskrevet i dette manuskriptet kan brukes konsekvent isolere menneskelige Bruchs membran explants og kultur RPE cellene, inkludert primær, udødeliggjort eller Stamcelle-avledet RPE linjer.
Som nevnt tidligere, er menneskelige Bruch membran explants Hentet fra NDRI. En protokoll er etablert med NDRI som angir kriteriene som er angitt for donor øyne å være akseptabelt. For eksempel givere må har ingen kjente retinal øyesykdommer, øyne/Globe hentes innen 10 timer etter døden og globuser kommer i laboratoriet innen 48 timer etter død (via levering over natten pakken på is). Angir passende aldersgruppe og antall øyne nødvendig for statistisk analyse av studien, f.eks., fem par Globes fra givere mellom 20-49 år og fem verden par fra givere mellom 50-89 år.
Øye Globes varierer, vanligvis gjennomsnitt ti par Globes tilgjengelig hver måned. Øye pakken kommer med grunnleggende, de identifiserte giverinformasjon: alder, rase, dødstidspunktet, dødsårsaken, og korte tidligere medisinsk historie (sykdom liste eller samtidige).
Viktigst, krever høsting menneskelige Bruch membran explants fjerning av anterior segment av øyet og linsen, slik at isolering av RPE-Bruchs membran-akkord komplekset. Når Bruchs membranen er isolert, kan RPE celler seeded på acellular explants i ulike konsentrasjoner og kultivert for nedstrøms eksperimenter. Forberedelse og fremgangsmåter for håndtering dette er kritisk, betaler oppmerksomhet til retningen til isolerte Bruchs membran sørge laminal overflaten er vendt opp stund ikke berørende overflaten mekanisk for å unngå skade på ekstracellulær matrix overflaten struktur.
Det bør også bemerkes at ved Bruchs membran explant systemer, finnes det noen variabler som kan påvirke resultatene av nedstrøms eksperimenter som individuelle donor genomisk bakgrunnsfarge, alder av Bruchs membran eller postmortem tid for Bruchs membran, og plasseringen av Bruchs membran, dvs., sentral eller ekstern del av Bruchs membran explants. Som med alle andre menneskelig vev studien, må en rekruttere hvor passende donor øye utvalg har nødvendig statistiske makt og matche donor øye alder hvis aktuelt. Etablere strenge kriterier for å akseptere øyne fra øye banker er en viktig parameter. Bare godta øyne som er enucleated mindre enn 10 h postmortem og Bruchs membran forberedelse kan høstes innen 24-48 timer etter døden. Synsnerven nettstedet kan brukes som en markør for retning, og bruke de samme stedene for eksperimentelle og kontroll kollokvier. Ved å ta disse tiltakene, kan en minimere eksperimentell variasjoner.
I sammendraget er forståelse av RPE-Bruchs membran-akkord kompleks og hvordan den påvirkes av alder og sykdom avgjørende for å forstå sitt bidrag i patofysiologien av AMD. Modellsystemer det ansette ex vivo teknikker er et verdifullt verktøy for å undersøke effektene ved hjelp av menneskelig vev. Her, beskriver vi en metode som sysselsetter menneskelige donor explants som relevante ex vivo modell av alderen Bruch membran. Denne teknikken gjør det mulig å bruke alderen og/eller syke menneskelige Bruchs membran som et forskningsverktøy for å undersøke hvordan strukturelle endringer innenfor matrise kan påvirke overliggende RPE celle atferd inkludert vedlegg, spredning og gene expression25 , 27. vellykkede utviklingen av lignende ex vivo modellsystemer vil ytterligere vår forståelse av AMD og Letter utviklingen av romanen behandlingsalternativer.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen støttes av forskning for å hindre blindhet, New York, www.rpbusa.org og Greater New York Center for Retinal Degenerative sykdom Foundation Fighting blindhet, www.blindness.org. Forfatterne vil gjerne takke Luanna Bartholomew, Ph.D., for hennes kritisk gjennomgang av dette manuskriptet.
Human donor globes | National Disease Research Interchange, NDRI | ||
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
Carbon-dioxide independent media | Thermo Fisher Scientific | 18045-088 | |
60-mm polystyrene petri dish | Corning Inc. | 351007 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores | Merck Millipore | JGWP04700 | |
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system | Thermo Fisher Scientific | 09-753-102 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576-5G | |
35 × 10mm culture dish | VWR International | 25373-041 | |
Trephine | Accutome | AM0570 60 | |
96 well plate | Corning Inc. | 3595 | |
Minimum essential media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032-1MU | |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1914 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 1336-21-6 |