Målet med detta protokoll är att demonstrera odling av näthinnans pigment epitelceller (RPE) på äldre eller sjuka människors Bruchs membran. Denna metod är lämplig att studera RPE cell beteende på en komprometterad extracellulärmatrix.
Förutom vitaminer och antioxidanter som rekommenderas av åldersrelaterad öga sjukdom studien, finns det ingen effektiv behandling för ”torr” eller atrofisk åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) som representerar 90% av fallen. Terapier behövs för att bromsa eller fördröja utvecklingen av geografisk atrofi (GA) och förstå Bruchs membran patologi är en del av denna process. Förändringar i människors Bruchs membran föregår utvecklingen av AMD genom att bidra till skadan av retinal pigment epitel (RPE) celler. Bristen på tillräcklig djurmodeller studera AMD, fungera ex vivo modeller av äldre människors Bruchs membran som ett användbart verktyg att studera beteendet hos RPE-celler från förevigade och primär cell linjer samt RPE linjer härrör från inducerade pluripotenta stamceller celler (iPSCs). Här presenterar vi en detaljerad metod som gör att man kan avgöra effekterna av RPE cell beteende seedade på skördade mänskliga Bruchs membran bladsticklingar från mänskliga donatorer, inklusive bifogade filer, apoptos och spridning, förmåga att fagocytera ljusmätare yttre segment, inrättandet av polaritet och genuttryck. Denna analys ger en ex vivo -modell av åldern Bruchs membran att bedöma funktionella egenskaper hos RPE-celler när seedade på åldern/äventyras extracellulärmatrix.
Åldersrelaterade strukturförändringar att mänskliga Bruchs membran, som orsakas av många faktorer, inklusive nitrosative och oxidativ stress, utövar flera skadliga effekter på funktionen av retinal pigment epitel (RPE) celler och bidrar till den patologi av åldersrelaterad makuladegeneration (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . När man överväger cell substitutionsterapi för avancerade atrofisk AMD eller geografisk atrofi, kommer att behandling sannolikt kräva transplantation av celler på en bädd av RPE cell atrofi. Åldersrelaterade förändringar inom mänskliga Bruchs membran kan negativt påverka framgång transplanterade RPE cell ympkvistar, med tanke på skador till extracellulära matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. undersöka mänskliga Bruchs membran biologi och hur strukturella förändringar inom matrisen bidra till progression till AMD är avgörande för att förstå sjukdomen patologi. Således finns det kritiska behov av utredarna i fältet åldersrelaterade ögat för att utveckla protokoll som beskriver ex vivo skörd av äldre eller sjuka människors Bruchs membran.
Historiskt sett har det varit svårt att modell åldersrelaterade sjukdomar såsom geografisk atrofi och ett år mänskliga Bruchs membran i djur23. Denna svårighet uppstår flera faktorer av livslängden hos människor jämfört med gnagare och andra arter som ofta används för sjukdom modellering, liksom avsaknaden av en makula i de flesta ryggradsdjur24. Fördelen med den metoden som beskrivs häri är att celler kan testas direkt på Bruchs membran utvinns ur post mortem ögon äldre eller sjuka individer. Det övergripande målet med denna artikel är att ge en detaljerad metod för en ex vivo modell av äldre eller sjuka människors Bruchs membran, inklusive isolering av mänskliga Bruchs membran explants från mänskliga donatorer och odling av RPE-celler för nedströms experiment. Denna modell kan fungera som en relevant modell för att undersöka bidraget av extracellulärmatrix skada RPE cell funktion och patologi20,25,26,27,28.
Äldre människors Bruchs membran (extracellulär matrix) bidrar till sjukdomsförloppet av AMD och således finns det ett behov av att förstå hur denna förändrade matris bidrar till RPE cellfunktion. Bristen på tillräcklig djurmodeller studera åldersrelaterade förändringar i AMD, kan ex vivo modellsystem som efterliknar effekterna av sjukdomen tjäna som ett värdefullt verktyg att förstå patofysiologin. Den metod som beskrivs i detta manuskript kan användas konsekvent isolera mänskliga Bruchs membran explants och kultur RPE-celler, inklusive primära, förevigade eller stamceller-derived RPE cellinjer.
Som tidigare nämnts köps mänskliga Bruchs membran bladsticklingar från NDRI. Ett protokoll upprättas med NDRI som anger kriterierna för givare ögon kan accepteras. Exempelvis givare måste ha inga kända retinal ögonsjukdomar, ögon/glober hämtas inom 10 h efter döden och glober anländer till laboratoriet inom 48 h efter döden (via paketet övernattbefordran på is). Ange lämplig ålder och antal ögon behövs för statistisk analys av studien, t.ex., fem par jordglober från givare i åldrarna 20 – 49 år och fem Globen par från givare mellan 50-89 år.
Tillgången till ögat glober varierar, vanligtvis i genomsnitt tio par jordglober tillgänglig varje månad. Ögat paketet anländer med grundläggande, avidentifierad givare information: ålder, ras, död, dödsorsak, och kort tidigare sjukdomshistoria (sjukdom notering eller samsjuklighet).
Viktigast av allt, kräver skörd mänskliga Bruchs membran bladsticklingar avlägsnande av den främre delen av ögat och glaskroppen, möjliggör för isolering av RPE-Bruchs membran-åderhinnan komplex. När den Bruchs membran är isolerade, kan RPE-celler vara seedade på de acellulärt bladsticklingar vid varierande koncentrationer och odlade för nedströms experiment. Förberedelse och processuella hantering som beskrivs häri är kritisk, att uppmärksamma orienteringen för den isolerade Bruchs membran kontrollera laminal ytan är vänd upp medan inte röra ytan mekaniskt för att undvika att skada den extracellulär matrix ytstruktur.
Det bör också noteras att när du använder den Bruchs membran explant system, det finns vissa variabler som kan påverka resultaten av nedströms experiment såsom enskilda givare genomisk bakgrund, ålder av den Bruchs membran, eller efter döden tid av Bruchs membran, och platsen för den Bruchs membran, dvs., central eller perifer del av Bruchs membran bladsticklingar. Som med någon annan mänsklig vävnad studie, måste en rekrytera lämpliga givare ögat provnumret för att ha nödvändiga statistiska makt och matcha givare ögat ålder vid behov. Att fastställa strikta kriterier för att acceptera ögon från ögat banker är en kritisk parameter. Bara acceptera ögon som är enucleated mindre än 10 h efter döden och som den Bruchs membran förberedelse kan skördas inom 24-48 h efter döden. Synnerven webbplatsen kan användas som en markör för orientering och använder samma platser för experimentell och styra studiegrupper. Genom att vidta dessa åtgärder, kan man minimera experimentella variabilitet.
I sammanfattning, förståelse av RPE-Bruchs membran-åderhinnan komplex och hur den påverkas av ålder och sjukdom är avgörande för att förstå dess bidrag till patofysiologin av AMD. Modellsystem som använder tekniker för ex vivo är ett värdefullt verktyg för att undersöka dessa effekter med mänsklig vävnad. Häri, beskriver vi en metodik som sysselsätter mänskliga givare bladsticklingar som relevanta ex vivo modell av åldern Bruchs membran. Denna teknik gör att man kan använda äldre eller sjuka människors Bruchs membran som ett verktyg för forskning att undersöka hur strukturella förändringar inom matrisen kan påverka överliggande RPE cell beteende inklusive fastsättning, spridning och gen uttryck25 , 27. framgångsrik utveckling av liknande ex vivo modellsystem kommer att främja förståelsen av AMD och underlätta utvecklingen av nya terapeutiska alternativ.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av forskning för att förhindra blindhet, New York, www.rpbusa.org och Greater New York Center för retinala degenerativa sjukdomen Foundation kämpar blindhet, www.blindness.org. Författarna vill tacka Luanna Bartholomew, Ph.D., för hennes kritiska granskning av detta manuskript.
Human donor globes | National Disease Research Interchange, NDRI | ||
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
Carbon-dioxide independent media | Thermo Fisher Scientific | 18045-088 | |
60-mm polystyrene petri dish | Corning Inc. | 351007 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores | Merck Millipore | JGWP04700 | |
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system | Thermo Fisher Scientific | 09-753-102 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576-5G | |
35 × 10mm culture dish | VWR International | 25373-041 | |
Trephine | Accutome | AM0570 60 | |
96 well plate | Corning Inc. | 3595 | |
Minimum essential media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032-1MU | |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1914 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 1336-21-6 |