Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

Published: March 6, 2018 doi: 10.3791/57087
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, UMR 3691, CNRS, Institut Pasteur, 2UTechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech, Institut Pasteur

Summary

Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste cellen

Abstract

Het cytoskelet, samengesteld uit actine Microfilamenten, microtubuli, en intermediaire filamenten (IF), speelt een sleutelrol in de controle van de cel vorm, polariteit en beweeglijkheid. De organisatie van de netwerken actine en microtubulus heeft uitvoerig bestudeerd maar die van IFs is niet nog volledig gekenmerkt. IFs heeft een gemiddelde diameter van 10 nm en vorm een netwerk uit te breiden in het cytoplasma van de cel. Ze zijn fysiek geassocieerd met actine en microtubuli door moleculaire motoren en cytoskeletal linkers. Deze strakke vereniging is de kern van de regelgevende mechanismen die de gecoördineerde regeling van de drie cytoskeletal netten die nodig zijn voor de meeste functies van de cel. Het is daarom belangrijk om te visualiseren IFs alleen en ook samen met elk van de andere cytoskeletal netwerken. Echter, als netwerken zijn zeer dicht in de meeste soorten cellen, met name in gliacellen, waardoor zijn resolutie zeer moeilijk te bereiken met standaard fluorescentie microscopie (lateraal resolutie van ~ 250 nm). Directe stochastische optische wederopbouw microscopie (dSTORM) is een techniek waardoor een winst in laterale resolutie van een orde van grootte. Hier, laten we dat laterale dSTORM resolutie voldoende is voor het oplossen van de dichte organisatie van de IF-netwerken en, in het bijzonder als bundels omringende microtubuli. Deze strakke vereniging dreigt te deelnemen aan de gecoördineerde verordening van deze twee netwerken en mei, uitleggen hoe vimentin IFs sjabloon en organisatie van de microtubuli stabiliseren alsmede microtubulus afhankelijke vesiculaire handel kunnen beïnvloeden. Meer in het algemeen, laten we zien hoe de observatie van twee cytoskeletal componenten met dual-kleur dSTORM techniek brengt nieuw inzicht in hun wederzijdse interactie.

Introduction

Cytoplasmatische Intermediaire filamenten (IFs) zijn 10 nm diameter homo- of heteropolymers van een cel type specifieke deelverzameling van als eiwitten. IFs deelnemen aan een groot aantal cellulaire functies zoals cel proliferatie, beweeglijkheid en stress reacties. Hun belangrijke rol wordt benadrukt door het feit dat meer dan 90 ziekten bij de mens direct door mutaties in als eiwitten veroorzaakt worden; bijvoorbeeld, veranderingen in samenstelling als begeleidt groei van de tumor en de verspreiding van1,2,3. Er is steeds meer aanwijzingen dat de drie systemen van het cytoskelet in samenwerking tot controle cellulaire functies zoals cel polarisatie, divisie en migratie2,3 werken. Aangezien er een nauwe koppeling tussen ruimtelijke architectuur en functies, is het van cruciaal belang zijn om inzicht in de structurele organisatie of als met de andere draden en de cytoskeletal cross-talk beter te begrijpen. Dit artikel bevat een protocol voor het uitvoeren van de super resolutie techniek dual-kleur dSTORM (directe stochastische optische wederopbouw microscopie)4 en hoe het wordt gebruikt voor het onderzoeken van de wisselwerking tussen als en microtubuli in vaste, gekweekt cellen in 2 dimensies (2D).

Verschillende super resolutie technieken zijn ontwikkeld de afgelopen tien jaar, en er ontdekkingen waren op de oorsprong van de Nobelprijs voor de Scheikunde in 20145. Onder al deze technieken ligt de enkel molecuul lokalisatie gebaseerde methoden zoals PALM6 (Photo-Activated lokalisatie microscopie) die gebruik maakt van photoswitchable fluorescente proteïnen, STORM7 met paren van fluorophores of dSTORM4 met conventionele fluorophores. Al deze methoden zijn gebaseerd op hetzelfde principe dat uit (i) de switch van de meeste van de fluorescerende verslaggevers in een "off" staat bestaat"(niet-tl), (ii) de stochastische activering van een subset van hen in een TL staat te lokaliseren hun ruimtelijke positie met nanometer nauwkeurigheid, en (iii) de herhaling van dit proces om te activeren zoveel deelverzamelingen van fluorophores mogelijk. Een uiteindelijke afbeelding wordt gereconstrueerd met behulp van alle taalversies van de geactiveerde moleculen, die een laterale resolutie tot ~ 20-40 nm. Verschillende gecommercialiseerd optische systemen waardoor PALM/STORM zijn nu beschikbaar voor biologen voor routinematige experimenten. Hier, werd een dergelijk systeem gebruikt om de structurele studievereniging van microtubuli en IFs. Onder alle single-molecuul lokalisatie gebaseerde methoden, de techniek dual-kleur dSTORM werd geselecteerd, want het is zeer geschikt voor het observeren van zeer dunne lamellaire gebieden (< 1 µm) van Adherente cellen en kan zorgen voor aanzienlijke verbetering van de resolutie van de afbeelding met minimale investering van tijd en geld. DSTORM is inderdaad een zeer handige en veelzijdige techniek die compatibel is met de standaard organische kleurstoffen routinematig gebruikt voor cellulaire kleuring en immunofluorescentie.

Terwijl één dSTORM kleurenafbeeldingen relatief eenvoudig zijn te verkrijgen met behulp van de fluorophore Alexa6478, vereist dubbele kleur dSTORM voor het optimaliseren van de experimentele omstandigheden, zodat de twee kleurstoffen kunnen goed knipperen in de gekozen buffer, vooral wanneer er beperkte Laser macht. Uitstekende papieren zijn reeds beschikbaar op de methoden instellen Multi-Color beeldbewerking met dSTORM9,10,11,12,13, en deze documenten uitleggen in detail de mogelijke bronnen van artefacten en aangetaste beeldresolutie en instructies om ze te overwinnen. In dit artikel, de optimale proefomstandigheden in termen van fixatie van de cellen, immunokleuring, bereiding van de monsters zijn imaging verwerving en afbeelding wederopbouw beschreven om het verwerven van beelden van dichte cytoplasmatische als netwerken en microtubuli in gliacellen met dual-kleur dSTORM. Kort, de in Chazeau et al.12 beschreven methode van extractie/fixatie werd aangepast aan gliale cellen en gebruikt met een na fixatie stap, geoptimaliseerde antilichamen concentratie, een STORM buffer met 10 mM MEA beschreven in Dempsey9 et al. dat was blijken te zijn optimaal voor de experimentele instellen en het type van de steekproef.

Gliacellen express hoofdzakelijk drie soorten als eiwitten: vimentin, nestin en GFAP (gliale zure fibrillary eiwit). Deze drie eiwitten is gebleken dat waren mede polymeriseren in astrocyten14. Eerder toonden wij met behulp van super resolutie gestructureerd verlichting microscopie (SR SIM) dat deze drie als eiwitten kunnen worden gevonden in de dezelfde interne als gloeidraad en dat zij soortgelijke verdeling en dynamiek in gliacellen 15weergegeven. Als gevolg van de overeenkomsten tussen de drie als eiwitten, werd vimentin kleuring gebruikt als een verslaggever voor het hele netwerk als. Met behulp van dSTORM, kunnen we oplossen hoe beperkt als formulier bundels langs microtubuli, die was niet mogelijk met diffractie microscopie technieken15. Deze opmerkingen kunnen helpen te begrijpen hoe vimentin IFs kunnen sjabloon microtubuli en reguleren van hun groei traject, bevordering van het behoud van een polariteit as tijdens cel migratie16. Super resolutiebeelden belangrijke informatie verstrekt over de wederzijdse interactie van de twee cytoskeletal subsystemen en inzicht in de koppeling tussen ruimtelijke vereniging en lokale functie die celtype specifieke17zou kunnen worden gebracht. In het algemeen, kan dual-kleur dSTORM worden gebruikt om te studeren de Overspraak tussen cytoskeletal elementen of andere soorten organellen, mits goede immunokleuring voorwaarden zijn bereikt in termen van dichtheid en specificiteit. Deze techniek nuttig zal zijn voor beter karakteriseren het cytoskelet wijzigingen waargenomen tijdens astrogliosis en in glioblastoma, de meest voorkomende en meest kwaadaardige tumor van het centrale zenuwstelsel, waar de uitdrukking van als eiwitten is gewijzigd 18 ,19,20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coverslips voorbereiding (dag 1, 30 min)

  1. De 18-mm nº1.5H (170 µm +/-5µm) glazen coverslips op een kunststof rek plaatsen.
  2. Zet het rek in een bekerglas van 100 mL gevuld met aceton en weken voor 5 min.
  3. Het rek overbrengen in een bekerglas van 100 mL gevuld met absolute ethanol en weken voor 5 min.
  4. Het rek overbrengen naar een nieuw bekerglas van 100 mL gevuld met absolute ethanol en plaats het bekerglas in een ultrasone reiniger apparaat (zie tabel van materialen) bij kamertemperatuur. Druk op "on" en wacht 10 minuten.
  5. Het rek onder de motorkap van een laminaire flow en laat de coverslips droog of drogen van de coverslips met gefilterde luchtstroom.
  6. Zet het rek met coverslips in een schonere plasma-apparaat. Zet de vacuümpomp, de deur dicht, wachten op 3 min te maken van het vacuüm en overschakelen op de plasma voor 1 min. Gebruik de coverslips kort na het schoonmaken. Bewaar ze niet.

2. cel beplating (dag 1, 20 min)

  1. Groeien de gliale cellijn U373 in Minimum essentiële Medium (MEM) met 10% foetale runderserum, 1% penicilline-streptomycine, en 1% niet-essentiële aminozuur in 10 cm diameter kunststof petrischaal.
  2. Plaats van schone glazen coverslips in 12-Wells-platen onder de motorkap laminaire flow en voeg 1 mL voorverwarmde cel voedingsbodem per putje.
  3. Neem een schotel met cellen uit de cel incubator (37 ° C, 5% CO2).
  4. Verwijder het medium en voeg 10 mL PBS.
  5. Verwijder de PBS en voeg 1 mL 0,05% trypsine-EDTA.
  6. Zet de schotel terug in de incubator voor 2-3 min.
  7. Voeg 10 mL van warme medium voorverwarmd bij 37 ° C op de schotel en resuspendeer de cellen.
  8. Zaad ongeveer 100.000 cellen per putje (~ 150 µL van cellen) in de 12-Wells-platen die de coverslips bevatten.
  9. Wacht ten minste 6 uur (of 's nachts) om de verspreiding van de cel.

3. cel fixatie (dag 2, 2h)

  1. Het cytoskelet buffer met 80 mM buizen, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, bereiden en breng de pH op 6.9.
  2. Wassen van de cellen een keer met PBS.
  3. Verwijder de PBS en voeg voorzichtig 1 mL per putje van extractie/fixatie oplossing (0,25% Glutaaraldehyde, 0,3% Triton X-100 in de buffer cytoskelet) voorverwarmd bij 37 ° C.
  4. Incubeer gedurende 60 s bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder de oplossing en zachtjes Voeg 1 mL per putje van voorverwarmde en vers bereide 4% PFA (paraformaldehyde) oplossing verdund in de buffer van het cytoskelet.
    Let op: Gebruik van handschoenen en werken onder de chemische motorkap.
  6. Plaats de 12-well plaat terug in de incubator bij 37° C gedurende 10 minuten.
  7. Verwijder de PFA en voeg 3 mL PBS per well.
    Opmerking: Werken onder de chemische motorkap met handschoenen en zet de gerecycleerde PFA in een bepaalde opslaglocatie.
  8. Spoel tweemaal met PBS.
  9. Verwijder de PBS en vers bereide 10 mM NaBH4 oplossing verdund in PBS om het doven van de autofluorescence vanuit Glutaaraldehyde toevoegen.
  10. Incubeer gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Zet de gerecycleerde NaBH4 in een bepaalde opslaglocatie.
  12. Driemaal 5 minuten wassen met PBS.
  13. Verwijder van de PBS en voeg de blokkerende oplossing (5% BSA in PBS).
  14. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (of 's nachts bij 4 ° C).
    Opmerking: Het cytoskelet buffer kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur voor een paar maanden. PFA, NaBH4 en Glutaaraldehyde moeten worden behandeld met speciale zorg (kap, handschoenen en specifieke recycling bakken). Oplossingen moeten worden toegevoegd en verwijderd zachtjes om het behoud van de integriteit van de cellen. Het is belangrijk om niet laten de cellen droog.

4. immunokleuring (dag 2, 5h)

  1. Bereid de oplossing van primaire antilichamen met behulp van anti-vimentin en anti-tubuline met een verdunning van de 1:500 in de blokkerende oplossing.
  2. Verdunde primaire antilichamen 100 µL druppels zetten een paraffine film laag en plaats de coverslips op de top van hen met cellen naar beneden.
  3. Incubeer de cellen met primaire antilichamen voor 2 h. Zet de coverslips terug in een 12-well bord gevuld met PBS. Spoel driemaal gedurende 5 minuten elke keer in PBS bij kamertemperatuur op een roteerschudapparaat.
  4. In de tussentijd bereidt de oplossing van de secundaire antilichamen met behulp van anti-muis Alexa647 en anti-rat Alexa555 bij een verdunning van een 1:1, 000 in de blokkerende oplossing. Incubeer de cellen met secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Ga verder zoals 4.2. de cellen beschermen tegen licht.
  5. Zet het dekglaasje aan terug in een 12-well plaat gevuld met PBS. Spoel driemaal gedurende 5 minuten elke keer in PBS bij kamertemperatuur op een roteerschudapparaat. Verwijder de PBS en Voeg 0,5 mL PBS vermengd met 1 µL van 0.1 µm tetraspeck kralen.
  6. Zet de putten op een roteerschudapparaat voor 30 min. spoelen met PBS. Verwijder de PBS en Incubeer de cellen gedurende 5 minuten met een 4% PFA oplossing in PBS. Spoel driemaal in PBS.
    Opmerking: Vaste cellen kunnen worden opgeslagen voor een paar weken in PBS bij 4° C. Immunokleuring moet gebeuren op het laatste moment.

5. monstervoorbereiding (dag 3, 5 min)

  1. Zet aliquots van MEA (cysteamine, 1 M, pH 8.3), glucose-oxidase (100 x, 50 mg/mL), katalase (500 x, 20 mg/mL) in een ijs-mand.
  2. Bereiden van 50 mL Tris-NaCl buffer (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) aangevuld met 10% van de glucose (100 mg/mL).
  3. 1.2 mL imaging buffer net voor beeldbewerking met 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) glucose oxidase, 40 µg/mL katalase (80-200 U/mL) voor te bereiden in de Tris-NaCl buffer met 10% glucose.
  4. Mount het dekglaasje aan met de gelabelde cellen op de magnetische monsterhouder (b.v. chamlide kamer) en voeg de imaging buffer om de kamer volledig te vullen. Zet het deksel op en zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de imaging buffer en het deksel.
  5. Reinig de onderkant van het monster met absolute ethanol en controleer of er geen lek. Gebruik vet te verzegelen van de monsterhouder goed indien nodig.
    Opmerking: Bereiden van 1 M voorraad van MEA oplossing (pH 8.3 aangepast met behulp van HCl), de voorraad van glucose-oxidase bij 50 mg/mL en de voorraad van katalase bij 20 mg/mL in water, maak aliquots en sla ze op-20 ° C voor maximaal één maand voor MEA en een jaar voor glucose-oxidase en katalase. Refreeze niet aliquots. De Tris-NaCl buffer bereiden en op te slaan bij kamertemperatuur gedurende enkele maanden. Voeg glucose op de dag van het experiment (stap 5.3).

6. Beeldacquisitie (dag 3, ~ 1h per cel)

  1. Schakel de Microscoop. Zet de acquisitie software en druk op Start systeem.
  2. Selecteer de knoppen uitvouwen van overname , Tab. het hulpprogramma Setup Imaging in de groep van het hulpprogramma Setup Manager. Selecteer de modus laser WF (breed veld) van overname. Selecteer het doel 100 X nb 1.46 . Selecteer het TIRF u-HP -modus die gebruikmaakt van een collimator te verminderen van het gezichtsveld worden verlicht en de laser energie te concentreren in een kleiner gebied. Gebruik de optovar 1.6 x lens waarmee een pixelgrootte van 100nm.
  3. Selecteer het gereedschap van de tijdreeksen en de time-lapse met 50 000 frames en 0.0 ms tussen frames instellen. Vouw het gereedschap van de kanalen in de acquisitie parameter gereedschapsgroep en selecteer "Toon alle".
  4. Instellen van de Alexa647-track: Controleer de 642 en 405 laser lijnen voor excitatie en aanvaarden om in te schakelen hen. Selecteer het filter "655 LP" emissie in de Imaging Setup. Wijzig de naam van "647".
  5. Klik op '+' in het hulpprogramma kanalen toe te voegen nog een licht pas en selecteer de modus "schakelaar track elke: frame" in het hulpprogramma Setup Imaging . 561, 488 en 405 laserlijnen controleren en aanvaarden om in te schakelen hen. Selecteer de "BP 570-650 + LP750" emissie filteren en gebruik optovar lens 1.6 x. Controleer of de TIRF-uHP-modus is geselecteerd. Wijzig de naam van de track "555".
  6. Selecteer het gereedschap overname modus en stelt u de framegrootte op 200 x 200 pixels. Selecteer het gereedschap Focus apparaten en strategie en de duidelijke focus op 1 000 frames instellen (als er een focus-lock-systeem).
  7. Olie zetten de doelstelling en het monster in te zetten. Selecteer het tabblad zoeken , en open de sluiter van de fluorescentie-lamp. Zoek de focus en kijk voor de cel op het beeld met behulp van het oculair. Zet het in het midden van het gezichtsveld met behulp van de joystick.
  8. Selecteer het tabblad overname om terug te gaan naar de overname-modus. Selecteer de "647" track, stel de 642-laser macht tot 0,2%, stel de 405-laser macht om 0, de belichtingstijd ingesteld op 50 ms en de winst van 50. Kies de modus doorlopend overname te observeren van de cel op het scherm. De focus aanpassen. Zorg ervoor dat er ten minste één tetraspeck parel in het gezichtsveld, verhoogt het contrast om ze te zien indien nodig. Een auto-schaal modus gebruiken voor de weergave. Neem een beeld van de breed-gebied epifluorescence van het vimentin-netwerk door te klikken op Uitlijnen en opslaan. Controleer de TIRF verlichting, klik op TIRF, de hoek van de verlichting en/of collimator aanpassen indien nodig hebben van een homogeen veld van verlichting en opslaan.
    Opmerking: Het is belangrijk dat de TIRF en epifluorescerende beelden van hoge kwaliteit zijn voordat u start van de ruwe data-acquisitie. Discontinue, niet-uniforme wijze gelabelde filamenten zal aanleiding geven tot slechte kwaliteit dSTORM beelden.
  9. Uncheck de "647" track en selecteren en controleren van de "555" track. Neem een beeld van de epifluorescence van het netwerk van microtubuli en opslaan. Nemen van een TIRF afbeelding en sla het ook.
  10. Uncheck de "555" track, selecteren en controleren de "647" track en druk op continue. De winst op 0 zetten en belichtingstijd op 10 ms. Stel de 642-nm laser macht tot 100% om het grootste deel van de Alexa647-kleurstoffen pomp aan de donkere staat (~ 2 kW/cm2). Zodra de fluorophores beginnen te knipperen, zet de blootstelling aan 15 ms en krijgen tot 300. Selecteer de wijze van de TIRF van de verlichting. Het bereik indicator -modus zonder auto-schaal gebruiken om te verifiëren dat enkel molecuul signalen doen niet het verzadigen van de camera (aangegeven door de rode kleur). In dat geval de winst te verlagen totdat de verzadiging verdwijnt. Tetraspeck kralen blijft verzadigde aan het begin van de overname. Druk op Stop om te stoppen met de voortdurende aandacht van de cel.
  11. Vouw van de tool Online verwerking en controleer Online verwerking van PALM om te visualiseren van het beeld van de STORM tijdens de overname. Gebruik de volgende parameters: 9 voor de piek masker grootte (diameter 9 pixels), en 6 voor de piek intensiteit aan lawaai. Scripties parameters definieert de moleculen die bij de verwerking (helder genoeg en niet overlappende) in aanmerking worden genomen. Selecteer in de PAL-statistieken tool, Plot type: histogramen Histogram Bron: Precision. Druk op Start acquisitie.
  12. Heroriënteren tijdens aankoop, indien nodig (als er geen focus-lock device). Aanpassen van de parameters (blootstelling, laser bevoegdheden) en uiteindelijk zet de lijn van de 405-nm laser (vanaf 0,001%) te houden een middelhoge dichtheid van fluorophores met een minimale afstand van 1 µm tussen afzonderlijke moleculen (> 9 pixels van 100 nm, de piek masker grootte) ( Figuur 1A-B). Als de dichtheid van het molecuul een beetje te hoog is, gebruiken de HILO (zeer geneigd en optische gelamineerd blad) wijze van verlichting in plaats van TIRF. Dit zal de kracht van de laser met 20% verhogen. Ervoor te zorgen dat de piek van lokalisatie precisie op het histogram onder de gereconstrueerde afbeelding is gecentreerd rond of minder dan 10 nm.
    Opmerking: Meestal vermindert het aantal moleculen met tijd, en de kracht van 405 nm laser is langzaam dienovereenkomstig verhoogd. Het doel is het verminderen van de localisatie precisie (histogram weergegeven onder de Super resolutiebeeld) zoveel mogelijk met een piek minder dan 10 nm (Figuur 1 c). Verhoogt het contrast van de afbeelding van de PALM indien nodig, als te veel heldere kralen in het veld aanwezig zijn.
  13. Druk op Stop om te stoppen met de film wanneer meer dan 106 lokalisaties hebben bereikt (meestal na 40 000 frames). De lasers terug naar 0,2% zetten (642 nm) en 0 (405 nm). De ruwe gegevens van de STORM-overname opslaan met de indeling .czi. Uncheck track "647" in het hulpprogramma voor kanalen en selecteren en controleren van de track "555".
  14. De belichtingstijd ingesteld op 25 ms en krijgen tot 0. Druk op de knop continue en zowel 488 en 561 lasers vastgesteldop 100% tot pomp Alexa555 kleurstoffen aan de donkere staat (~ 2 kW/cm2 elk). Zodra de fluorophores beginnen te knipperen, zet de winst tot 250, de HILO verlichting modus gebruiken en controleren dat afzonderlijke moleculen niet de camera met de mode van de indicator bereik verzadigen doen. Als dat het geval, verlagen de winst. Druk op Stop. De kracht van de 488-laser tot 50% afnemen.
  15. Druk op Start acquisitie. Tijdens de overname, verhoog geleidelijk de winst om altijd op de grens van verzadiging. Stap voor stap de kracht van de laser van 405 nm te houden een middelhoge dichtheid van één molecuul in het gezichtsveld (zie stap 6.18) verhogen. De kracht van de 488 laser tot 20-30% dalen wanneer de 405 laser hoger is dan 15%. Vervolgens dalen geleidelijk de 488 terwijl het verhogen van de 405 laser lijn zodat het knipperen van de moleculen zo snel mogelijk. De 488 laser lijn in combinatie met de laser 561 excitatie bij maximale intensiteit verhoogt op zowel de korting op de tarieven van de fluorophores, terwijl de 405 laser lijn alleen de op tarief verhoogt.
  16. Stop de overname als de taalversies van de meer dan 500 000 hebben bereikt (na ongeveer 20 000 frames) of meer wanneer geen meer moleculen knipperen. De ruwe gegevens van de STORM-overname opslaan met de indeling .czi.
    Opmerking: Begin altijd met de hogere golflengte te vermijden bleken (of activering) van de andere kleuren. Aangezien de chamlide kamer niet is afgesloten, is het mogelijk de imaging buffer om regelmatig te wijzigen, bijvoorbeeld om te testen verschillende buffer voorwaarden. Met behulp van de 488 laser lijn aan het afbreken van de Alexa 555 kleurstoffen is alleen nodig als de 561 laser macht beperkt (met 100 mW lasers is).

7. image wederopbouw (5 min)

  1. Gebruik het Model-gebaseerde correctie type met automatische segmenten met een maximale grootte van 8 in het hulpprogramma voor PAL-Drift . Druk op toepassen meerdere keren in een rij totdat de drift wordt gecorrigeerd. Dit model-gebaseerde correctie geldt een algoritme gebaseerd op cross-correlatie analyse die de drift corrigeert.
  2. Met behulp van de hulpprogramma's voor PAL-Filter , verbeteren het uiterlijk van de afbeelding van de STORM door het selecteren van alleen de moleculen die best waren gelokaliseerd. Bijvoorbeeld het beperken van de localisatie precisie tot en met 30 nm en de PSF tot 120-180 nm.
  3. Gebruik een pixelresolutie van 5 of 10 nm in de PAL-render tool, evenals een Gaussiaanse weergavemodus, met een factor van de uitbreiding van 1 PSF Selecteer renderen auto dynamisch bereik HR met een waarde van 95% en Render auto dynamisch bereik SWF-met een waarde van 90%. Selecteer de Render beste kwaliteit.
  4. Selecteer de PALM converteren, in het menu van de PALM van het tabblad verwerking (post-processing modus). Druk op selecteren , en vervolgens toepassen. De gemaakte afbeelding opslaan met een formaat. LSM (en niet .czi, zeer belangrijk).
    Opmerking: De wederopbouw van de afbeelding kan worden uitgevoerd onmiddellijk na de verwerving of later met behulp van de beeldverwerking-modus van de acquisitie software. In de off line post-verwerkingsmodus voor gebruikersgroepsbeleid, is het mogelijk om opnieuw analyseren de stapels met verschillende waarden voor de parameters (piek masker grootte, piek intensiteit aan lawaai). Altijd kiezen om te "negeren overlappende moleculen" en niet "gemiddelde voordat localisatie".

8. de schatting van de nauwkeurigheid van de lokalisatie van een beeld van de STORM (10 min)

  1. Open uw STORM ruwe gegevens en gebruik van de beeldverwerking tab. Selecteer de methode van de PALM en dan PALM weer. Druk op selecteren.
  2. Druk op toepassen om te beginnen met de wederopbouw met behulp van een piek masker grootte van 9 en een piek intensiteit aan lawaai van 6 (of de parameters die u voor de afbeelding kiest).
  3. Selecteer het gereedschap Rechthoek Graphics en teken een rechthoek op de onbewerkte afbeelding rond een enkel molecuul aanwezig op het glasoppervlak. Er zijn meestal een paar afzonderlijke moleculen er.
  4. Druk op toepassen opnieuw, en alleen de moleculen aanwezig binnen de regio van de rechthoek zal worden geanalyseerd.
  5. Selecteer in de PAL-statistieken tool, Plot type: histogram en Histogram Bron: X positie of Y-positie, te visualiseren de positie histogrammen.
  6. Sla de tabel met de lijst met taalversies van de aan de linkerkant onder de foto's.
  7. Met behulp van een software voor data-analyse, het maken van histogrammen van X en Y-posities (Figuur 1 d).
  8. Passen de distributies door een Gaussiaan en sla de σX en σY -waarden. De lokalisatie precisie σSMLM wordt geschat door (σX *σY) ^ 0,5.
  9. Herhaal stap 8.3-8.8 op zoveel moleculen mogelijk en het gemiddelde van de σSMLM

9. kanaal registratie (5 min)

  1. Open de afbeelding van de STORM van elke kleur met behulp van de software van Fiji (afbeelding J).
  2. Selecteer het gereedschap Toverstaf voor het meten van de standpunten van elk tetraspeck-kralen.
  3. Berekenen van de X- en Y-verschuivingen voor elke kraal en gemiddelde hen.
  4. De opdracht "Vertalen" te vertalen van het tweede beeld met de berekende X- en Y-verschuivingen.
  5. Het samenvoegen van de twee afbeeldingen met behulp van de opdracht Kanalen verenigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een microscoop voorzien van 50 mW 405 nm en 100 mW 488, 561 en 642 nm solid-state lasers, een EMCCD van 512 x 512 camera, een alpha Plan Apo 100 X / 1,46 objectieve en Band Pass 570-650 / lange Pass 655 emissie filters werd gebruikt voor de representatieve resultaten hieronder gepresenteerd.

Figuur 1A geeft een voorbeeld van het molecuul dichtheid en signaal / ruisverhouding dat tijdens raw image aquisition moet worden gebruikt. Goede kwaliteit afbeeldingen worden verkregen met een minimum van ~ 1 µm tussen naburige moleculen. In goede omstandigheden knipperende moet fluorophores aanwezig zijn in slechts één frame. Goede knipperen vereist om aan te passen de imaging voorwaarden van de buffer (reductieve agent, pH, zuurstof opruiming systeem) en laser bevoegdheden, die invloed hebben op de op - en af-tarieven van de fluorophores, en daarom de plicht cyclus (de Fractie van tijd die een fluorophore besteedt in de op staat)9,11. Figuur 1B, integendeel, geeft een voorbeeld van raw-afbeeldingen waar de dichtheid van het molecuul is te hoog en enkel molecuul kan worden opgelost.

Figuur 1 c toont een typische histogram van lokalisatie preciseringen voor alle de moleculen gedetecteerd en geanalyseerd door de software van de fabrikant uit een stapel 20 000 frames. Dit histogram komt overeen met het dSTORM-beeld van de microtubuli netwerk weergegeven in figuur 3B. Waarden van lokalisatie preciseringen verstrekt door de software van de fabrikant zijn in goede overeenkomst met waarden geschatte volgende stap 8, met behulp van het aanwijsapparaat precisie van een enkel molecuul gelokaliseerd op verschillende tijdstippen punten22 (Figuur 1 d).

Figuur 2A toont een typisch voorbeeld van dSTORM beeld van vimentin door samensmelting van filamenten immunolabeled met Alexa647. De toename van de resolutie duidelijk waarneembaar op vergelijking met de afbeelding die verkregen met een standaard wide-veld Microscoop (figuur 2B-C). De fluorescentie intensiteit profielen vertegenwoordigd in figuur 2D Toon dat super resolutie microscopie beeldvorming kunt oplossen van vimentin bundels. De dSTORM-resolutie is voldoende om het aantal door samensmelting van filamenten aanwezig in de bundels te tellen.

Figuur 3 toont een typisch voorbeeld van dual-kleur dSTORM beeld van de vimentin en tubuline netwerken immunolabeled met Alexa647 en Alexa555 respectievelijk. De overlay van de twee netwerken toont dat de vimentin-bundels zijn vaak gelokaliseerd langs microtubuli, belangrijke structurele voorlichting over de koppeling tussen de twee subsystemen van het cytoskelet.

Figuur 4 illustreert verschillende voorbeelden van dSTORM beelden van microtubuli verkregen in niet-optimale omstandigheden. Eerst met behulp van Alexa488 en een buffer met 143 mM bèta-mercaptoethanol (een andere reductieve agent gebruikt in plaats van MEA9,10,11) en een zuurstof opruiming systeem (opgebouwd uit glucose-oxidase 0,5 mg/mL en 40 µg Mo/mL katalase), de fluorophores waren knipperen maar waren niet helder genoeg om de juist gelokaliseerde (te laag foton nummer) (figuur 4A). Ten tweede, met behulp van Alexa555 met bèta-mercaptoethanol 143 mM, 50 mM MEA en een zuurstof opruiming systeem, de fluorophores kon niet naar hun donkere staat worden gepompt en daarom niet goed ruimtelijk gescheiden (te hoog taakcyclus, d.w.z. de Fractie van de tijd in de stand "aan" is te lang) (figuur 4B). Ten slotte, met behulp van Alexa568, met bèta-mercaptoethanol 143 mM, 50 mM MEA en een zuurstof opruiming systeem, de fluorophores waren niet helder en waren knippert langzaam met zeer lang "op" en "uit" Staten (lage foton van nummer en te hoog taakcyclus) (figuur 4C). In al deze niet-optimale voorwaarden, werd het netwerk van microtubuli slecht teruggegeven in de Super-resolutiebeelden. Kortom, optimale omstandigheden vereisen fluorophores met hoge foton nummer en lage taakcyclus9,10 in de overeenkomstige imaging buffer. Merk op dat optimaliseren labeling van dichtheid en imaging buffer voorwaarden voor het verkrijgen van goede knipperende omstandigheden een standaardprocedure voor dual-kleur dSTORM is en niet specifiek voor IF-microtubulus imaging is.

Volgens de stelling van Nyquist-Shannon, is het noodzakelijk om fluorophores ten minste elke 10 nm tot hebben een resolutie van 20 nm. Uitgebreid tot 2D structuren, Dempsey et al. geschat dat het noodzakelijk een etikettering van ~ 104 fluorophores per µm2 is . Zoals de IF-netwerk dichter is en zijn door samensmelting van filamenten dunner (10 nm vs 25 nm diameter zonder de primaire en secundaire antilichamen) te vergelijken met het netwerk van microtubuli zijn, vastgesteld we hebben dat tweemaal meer lokalisaties zijn nodig om te beschrijven de IF-netwerk. We behaalde goede beelden met 5 000 lokalisaties/µm2 want indien en 2500 lokalisaties/µm² voor microtubuli, verkregen met 40 000 frames en 20 000 frames respectievelijk. De afbeelding met de hoogste resolutie werd verkregen met een nauwkeurigheid van de lokalisatie van σSMLM ~ 8-12 nm naar schatting na stap 8 van het protocol (aanwijsapparaat precisie van een enkel molecuul gelokaliseerd op verschillende tijden punten22). Deze schatting van lokalisatie precisie was in goede overeenstemming met de waarden die zijn verstrekt door de software van de fabrikant wordt weergegeven in een histogram van lokalisatie preciseringen geëxtraheerd uit alle gedetecteerde moleculen in de onbewerkte gegevens (voorbeeld in Figuur 1 c). Dergelijke lokalisatie precisie kon bieden een afbeelding met een resolutie van ~ 30 nm (2,35 * precisie) als de labeling dichtheid hoog genoeg is. We routinematig waargenomen vimentin gloeilampen met een volle breedte op halve maximale (FWMH) van ~ 40 nm en microtubuli met een breedte van FWMH van ~ 55 nm. Aangezien de beeldresolutie, is afhankelijk van zowel de precisie van de lokalisatie en de dichtheid van de lokalisatie, bieden wij experimentele omstandigheden waarmee de beste resultaten, rekening houdend met beide criteria.

Figure 1
Figuur 1 : Optimale dichtheid van afzonderlijke moleculen tijdens overname en localisatie precisie schatting.
(A-B) Links: Representatieve raw-afbeeldingen uit één frame met een optimale dichtheid van afzonderlijke moleculen in de heldere Braziliaanse (A) en met een te hoge dichtheid (B) tijdens STORM verwerving (stap 6.12.) van de vaste U373 cellen gekleurd met anti-vimentin en anti-muis Alexa647. Recht: RAW-beelden waar de afzonderlijke moleculen met fluorescentie niveau boven de piek intensiteit aan Ruisdrempel (ingesteld op 6) zijn omgeven door cirkels (wit of rood). De diameter van de cirkel wordt ingesteld door de piek masker grootte (ingesteld op 9 pixel) en de kleur bepaalt of de moleculen (rood) of niet overlappen (wit). Merk op dat hoge dichtheid van afzonderlijke moleculen (onder B) leiden tot een hoog aantal overlappende moleculen die niet in aanmerking voor de wederopbouw van de afbeelding STORM genomen worden. A inzet: grafiek toont een typische fluorescentie-intensiteit-Profiel van een enkel molecuul in het rood en haar Gaussiaans passen in het zwart. In dit voorbeeld is de localisatie precisie σx = 6,7 nm. Schaal bar, 1 µm. (C) typische histogram van lokalisatie preciseringen voor alle de moleculen gedetecteerd en geanalyseerd door de software van de fabrikant. Het kan worden gevisualiseerd en regelmatig tijdens de overname van de ruwe gegevens dankzij de online verwerking wordt bijgewerkt. Dit histogram komt overeen met het dSTORM-beeld van de microtubuli netwerk weergegeven in figuur 3B. (D) Links: STORM afbeelding van een enkel molecuul presenteert op het glasoppervlak na de wederopbouw. Recht: Histogrammen van de X- en Y-posities verkregen na Gaussian montage. Montage van de X- en Y-distributies Gaussiaans geven een schatting van de nauwkeurigheid van de lokalisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Vertegenwoordiger dSTORM afbeelding van een netwerk van vimentin. dSTORM beeld (B), bijbehorende standaard breed-gebied beeld (B) en (C) weergegeven: de voorrand van een U373 gliale cel vastgesteld zoals beschreven in het protocol en gekleurd voor vimentin met Alexa647 bedekken. Bodem: zoom van het gemarkeerde gebied. (D) transversale intensiteit profielen langs de gele lijn op de ingezoomde afbeeldingen in A en B. schaal bar, 2 µm en 500 nm in de zoom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Representatief dual dSTORM kleurenafbeelding van vimentin en microtubulus netwerken. (A) Vimentin netwerk gekleurd met Alexa647 (dezelfde als in figuur 2A). (B) microtubulus netwerk aangeduid met Alexa555. (C) Overlay van de vimentin (rood) en de netwerken van de microtubuli (cyaan) met een zoom gebied aan de rechterkant. Het dSTORM beeld van vimentin werd verkregen met ~1.5 miljoen van lokalisaties uit 40 000 frames. Het beeld van de dSTORM van microtubuli werd verkregen met ~ 850 000 lokalisaties uit 20 000 frames. Schaal bar, 2 µm en 500 nm in de zoom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Voorbeelden van niet-optimale imaging voorwaarden van microtubuli. Wanneer de fluorophores knipperen maar zijn niet helder genoeg zijn met een Alexa488 etikettering van tubuline in U373 gliale cellen en 143 mM BetaMercaptoethanol en zuurstof scavenger in de beeldvorming buffer (A), wanneer de fluorophores helder genoeg zijn maar niet goed uitgeput in het donker staat (op de maximale laser kracht beschikbaar) en blink langzaam met Alexa555 label tubuline in 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA en zuurstof scavenger buffer (B) en als fluorophores langzaam knipperen en niet helder met behulp van Alexa568 Label tubuline in een storm buffer waarin 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA en zuurstof scavenger (C). In al deze gevallen hebben de beelden dSTORM resolutie gedegradeerd. Schaal bar, 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Representatief dual-kleur dSTORM afbeelding van vimentin en microtubulus netwerken van een U373 cel vast met koude methanol gedurende 5 minuten (A) Vimentin en (B) microtubuli netwerken aangeduid met Alexa647 en Alexa555 respectievelijk met gemarkeerde zoomt. Let op de aanwezigheid van afzonderlijke moleculen aan de voorzijde van de cellen gelokaliseerd in het cytoplasma minderen van de algehele regeling van de netwerken van de gloeidraad. Schaal bar, 2 µm en 500 nm in de zoom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Vergelijking van dSTORM gereconstrueerd beelden
Gereconstrueerde dSTORM beeld door de software van de fabrikant (A) en onweer (FiJi plugin) (B). (C) Overlay van (A) in magenta en (B) in het groen. Schaal bar, 2 µm en 500 nm in de zoom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritische stappen in het protocol

Wij presenteren hier een protocol die artefacten in de dSTORM beelden van microtubuli en IFs in gliacellen minimaliseert. Artefacten kunnen worden gecreëerd bij elke stap van de bereiding van de monsters en de beeldvorming: fixatie, blokkeren, immunolabeling, drift tijdens overname, niet-optimale knipperende voorwaarden23. We geven hieronder de belangrijkste stappen.

Schoonmaken van de coverslips is een belangrijke stap naar het beperken van de niet-specifieke binding van fluorophores op het oppervlak en dus te beperken de achtergrondruis in de dSTORM-afbeelding.

Het is raadzaam om de vaststelling van het monster met een stap van extractie en fixatie oplossingen met behulp van een mix van Glutaaraldehyde en triton, waarna fixatie met PFA (paraformaldehyde) (stap n ° 3). Het protocol van de fixatie werd aangepast van Chazeau et al.12: we daalde de incubatietijd van extractie/fixatie stap tot 60 s (stap 3.4), verwijderen van de glucose uit de buffer cytoskelet, en de extra-stap van permeabilization overgeslagen. Het voordeel van deze methode is dat de vrij bewegende cytoskeletal subeenheden worden afgevoerd, waardoor super resolutie beeldvorming met minder achtergrond12. Meer in het algemeen de fixatie stap is cruciaal omdat slechte fixatie (met behulp van oude PFA, koude oplossingen, ook lange/korte incubatietijd stappen) leiden tot gedeeltelijke vernietiging van de netwerken van de gloeidraad (gebroken microtubuli, microtubuli die de voorkant van de cel niet halen en/of in een lage dichtheid). Merk op dat het ook kunt u gebruik maken van de methanol fixatie, zeker als slechts het vimentin-netwerk is beeld zoals beschreven in Leduc et al.15. Achtergrondgeluiden kan echter worden waargenomen in de cel (Figuur 5). Hoewel dSTORM beelden met methanol vaste verkregen cellen zijn van mindere kwaliteit, zij nog steeds informatie verschaffen over welke zowel als en microtubulus netwerken eruit moeten bijvoorbeeld in termen van de dichtheid van de gloeidraad. Fixatie met alleen Glutaaraldehyde gaf zeer slechte resultaten voor IFs, hoewel het is het beste protocol voor microtubulus fixatie23.

In het deel van immunokleuring is het belangrijk te gebruiken anti-muis-antilichamen die kruisreactie met antilichamen ontwikkeld in rat minimaliseren. We kunnen niet Fab fragmenten (anti-muis) gebruiken om deze reden, omdat ze niet-specifiek met de rat anti-tubuline naast de muis anti-vimentin cross-react.

Als gevolg van de beperkte laser kracht beschikbaar is het nodig om zowel 488 en 561 nm laserlijnen te pomp van de Alexa555-kleurstoffen aan de donkere staat. 488 laser hoogvermogen (~ 50%) is tijdens de overname te observeren goede knipperen en lage taakcyclus (het aantal keer dat een fluorophore besteedt in de op staat), hoewel het verhoogt ook de achtergrondgeluiden ook noodzakelijk. De TIRF verlichting modus beperkt de excitatie van fluorophores in een dunne laag (~ 200 nm boven het glas dekglaasje aan). De signaal-ruisverhouding worden verhoogd door de achtergrond licht, maar vermindert ook de excitatie-kracht. De HILO-modus kunt axiale afdelen en kan efficiënt voor het optimaliseren van de signal-to-noise verhouding. Het is daarom een goede intermediair tussen epi en TIRF. De HILO-modus is essentieel voor excite efficiënt de Alexa555 fluorophores, waarvoor hoge laser macht goed knipperen.

Een andere belangrijke stap is de overname van onbewerkte gegevens (stap 6). Het is noodzakelijk om de parameters van de overname (belichtings, winst, TIRF- en zelfs als er geen focus block device protocol beschikbaar is) terwijl de film wordt verworven. Het bijhouden van een optimale dichtheid van heldere fluorophores is belangrijk (figuur 1A): het moet laag genoeg zijn ruimtelijk scheiden elke kleurstof, maar hoog genoeg om de hele structuur na 40 000 frames visualiseren. Als het aantal geactiveerde moleculen te laag is, moeten langer stapels worden verworven. Wij verkregen goede beelden met ~ taalversies van de 5000 per µm² voor IFs en taalversies van de 2 500 per cm² voor microtubuli.

Wijzigingen en probleemoplossing van de methode

Het is belangrijk om te werken met verse monsters en geoptimaliseerde imaging buffers. pH moet juist worden aangepast, met name voor de MEA.

Vimentin en microtubuli moeten uniform gelabelde kijken wanneer beeld met standaard breed-gebied microscopie techniek (WF). Als door samensmelting van filamenten doorspekt/onderbroken met klassieke microscopie kijkt, zal dit bij het gebruik van super resolutie worden versterkt. In dit geval is het beter voor te bereiden op nieuwe monsters. Niet-geoptimaliseerde fixatie voorwaarden (oude PFA etc.) kunnen leiden tot microtubuli op zoek gefragmenteerd. Hoge achtergrond op het glasoppervlak kan voortvloeien uit een inefficiënte blokkeren. In dat geval kan BSA (bovien serumalbumine) worden vervangen door FBS (foetale runderserum), en gebruikt in elke incubatie stappen.

Als de labeling dichtheid te hoog is (figuur 1B) en kan niet worden voldoende geduwd in de donkere af-state, zelfs met de hoogste macht van de laser, de hoeveelheid secundaire antilichamen (beter dan het verminderen van de hoeveelheid primaire antilichamen) moeten worden verlaagd. Dit vereist echter dat de voorbereiding van nieuwe monsters. In het algemeen, is het noodzakelijk te evalueren empirisch de hoeveelheid secundaire antilichamen te gebruiken.

Als de fluorophores niet normaal knippert (ze moet in de heldere Braziliaanse tijdens maar één frame), Controleer of de pH van de buffer die beeldvorming is juiste (pH 8.3). Bereid nieuwe oplossingen als het probleem aanhoudt (vooral MEA). Controleer altijd of de TIRF collimator (TIRF u_HP) brandt. Met beperkte laser macht, verkrijgen van de juiste knipperen kan worden uitdagende (de aan en uit tarieven alsook kleurstof helderheid afhankelijk van laser macht, zoals beschreven in van de Linde et al.11). Andere kleurstoffen zoals Alexa488 of Atto488 kunnen worden onderzocht als meer macht van de excitatie-laser beschikbaar14 is.

Als de fluorophores stoppen met knipperen vóór het einde van de 40 000 frames, wijzigt u de imaging buffer die kan hebben is geoxideerd. Controleer of er geen luchtbellen tussen de buffer en de deksel na de wijziging van de buffer. Verzegelde monsters kunnen voor een paar uur in een raw beeld worden.

Als STORM films worden overgenomen op een regelmatige TIRF Microscoop voorzien van een EMCCD, is het mogelijk met onweer24 te reconstrueren van de beelden. Vergelijkbare opties zijn beschikbaar voor de correctie van de drift, afbeelding filteren en beeldweergave. Onweer is een plugin die gebruikt in combinatie met Fiji/imageJ. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met de software van de fabrikant en onweer (Figuur 6).

KINDERBED (cyclooctatetraeen) kan worden toegevoegd aan de beeldvorming buffer ter verbetering van de precisie van de lokalisatie van afzonderlijke moleculen. Het verhoogt het aantal fotonen uitgezonden per cyclus voor Alexa64725. Een betere localisatie precisie inderdaad werd waargenomen (tot 6 nm) wanneer 2 mM COT toe te voegen aan de STORM-buffer beschreven stap 5 of met 100 mM MEA zoals beschreven in verwijst naar25. Echter in deze voorwaarden, het aantal heldere moleculen tijdens overname daalt veel sneller dan zonder COT, beperking van het totale aantal taalversies van de molecuul aan het einde van de overname en potentieel leiden tot geringe bemonstering van de IF-netwerk. Andere imaging buffers werden gemeld goed samenwerken met Alexa kleurstoffen, bijvoorbeeld met behulp van lactase en oxyrase als zuurstof systeem26opruiming. In dit protocol rapporteren we de samenstelling van de buffer die gaf de beste resultaten in termen van resolutie voor onze soort monsters en imaging instellen, maar elk monster type vereist buffer, naast het labelen en fixatie voorwaarden optimalisering.

Beperkingen van de methode en mogelijke verbeteringen

De methode die hier gepresenteerd is beperkt tot vaste cellen en 2D-afbeeldingen. Met behulp van een standaard set imaging omhoog met een Microscoop TIRF en een EMCCD, de meest beperkende factor was de bevoegdheden van de laser (100 mW voor de 561 nm laser was niet voldoende om de Alexa555-kleurstoffen knipperen). Een lijn van 532 nm laser mogelijk efficiënter om te wekken deze kleurstoffen. Een mogelijke verbetering van de methode zou zijn voor het uitvoeren van 3D dSTORM met behulp van optische astigmatisme27. Dit vereist minimale wijzigingen van het protocol, met uitzondering van een lagere labeling dichtheid en een verhoogde framenummer. 3D dual kleur STORM afbeelding zou bieden een beter beeld van IFs gewikkeld microtubuli, vooral in bundels. Merk op dat door samensmelting van filamenten actine ook kon worden waargenomen met behulp van dezelfde methode fixatie en een geoptimaliseerde hoeveelheid fluorescerende phalloidin8. 3 kleur STORM kan worden gebruikt om het observeren van de organisatie van de drie cytoskeletal subsystemen.

Het gebruik van primaire en secundaire antilichamen verhoogt de grootte van het object van belang aangezien het secundaire antilichaam is gelokaliseerd tot 20 nm van het doel. Typisch, een microtubulus 25-nm diameter zal hebben een breedte van ~ 50 nm na labeling. Een mogelijkheid om de afstand tussen het doel en de kleurstof is om direct label de primaire antilichamen met de juiste verf. Idealiter moet de nanobodies aangeduid met organische kleurstoffen gebruikt28.

Wij bieden hier slechts een eenvoudige methode voor het inschatten van de precisie van de gemiddelde lokalisatie van een enkel molecuul na Endesfelder et al.22. De totale resolutie van de beelden die rekening houden met beide lokalisatie precisie en labelen van dichtheid, kan ook worden gemeten met behulp van de Fourier Ring correlatie aanpak29.

Met betrekking tot de chatbox registratie is het moeilijk om overlay perfect alle de parels aanwezig in het gezichtsveld. Een meer complexe correctie kan worden gevonden in Chazeau et al. 12.

Beperkingen die voortvloeien uit het knipperen van fluorophores en bleken van de sondes kunnen worden overwonnen met behulp van DNA-PAINT (DNA punten accumulatie voor Imaging in Nanoscale topografie)30. Bij deze methode wordt is de knipperende nodig voor één molecuul lokalisatie gemaakt door voorbijgaande binding van korte-kleurstof-geëtiketteerden oligonucleotides naar hun complementaire doelen.

Conclusie

Dit artikel presenteert een robuust protocol standaardinteracties dual-kleur dSTORM imaging in 2 dimensies van cytoskeletal filamenten in vaste cellen. De experimentele omstandigheden die optimaal zijn in termen van fixatie, immunolabeling en beeldvorming buffer voor ons type monster werden aangetroffen in detail worden beschreven. Vervolgens het proces van ruwe data-acquisitie en het type van knipperende beelden die moeten worden geregistreerd (molecuul dichtheid, signaal / ruisverhouding, fluorophore plicht cyclus enz) alsmede het corrigeren van de drift en filter gegevens te reconstrueren dSTORM beelden wordt gepresenteerd. Deze stappen zijn generiek voor dual-kleur dSTORM beeldvorming en proef systeemeigen. Ten slotte ziet u hoe deze techniek helpt om op te lossen de dichte organisatie van de twee gekoppelde cytoskeletal netwerken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken Mickael Lelek, Orestis Faklaris en Nicolas Bourg voor vruchtbare discussie, Andrey Aristov en Elena Rensen voor hulp met de techniek van de super resolutie Shailaja Seetharaman voor zorgvuldige lezing van het manuscript. Wij erkennen dankbaar de UtechS fotonische BioImaging (Imagopole) Citech van Institut Pasteur (Parijs, Frankrijk), alsmede de Frankrijk-BioImaging infrastructuurnetwerk ondersteund door het Franse nationale Research Agency (ANR-10-INSB-04; Investeringen voor de toekomst), en de Région Ile-de-France (program Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) voor het gebruik van de Microscoop van Elyra. Dit werk werd gesteund door de de Ligue Contre le Cancer en het Frans National Research Agency (ANR-16-CE13-0019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 133 intermediaire filamenten vimentin microtubuli STORM super resolutie microscopie cytoskelet
Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S.… More

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter