Summary
이 방법론의 전반적인 목표는 게 최적의 실험 조건 샘플 준비에서 이미지 수집 및 재건 고정 셀에서 microtubules 및 중간 필 라 멘 트의 2D 듀얼 컬러 dSTORM 이미지를 수행 하려면
Abstract
말라 microfilaments, microtubules, 및 중간 필 라 멘 트 (IF)의 구성 골격 세포 모양, 극성, 및 운동 성의 제어에 핵심 역할을 한다. 말라와 microtubule 네트워크의 조직을 광범위 하 게 공부 하지만 IFs의 하지 아직 완전히 특징 이다. IFs는 평균 직경 10 nm의 형태로 세포 세포질에 걸쳐 확장 네트워크가 있다. 그들은 말라와 microtubules 분자 모터와 cytoskeletal 링커를 통해 물리적으로 연결 됩니다. 이 꽉 협회는 대부분의 세포 기능에 필요한 3 개의 cytoskeletal 네트워크의 조정된 규칙을 보장 하는 규제 메커니즘의 핵심 이다. 그것은 따라서 IFs 혼자와 각각 다른 cytoskeletal 네트워크의 함께 시각화 중요 합니다. 그러나, 만약 네트워크는 특히 glial 세포에서에서 대부분 셀 형식에 매우 조밀한 해상도 표준 형광 현미경 검사 법으로 달성 하기 매우 어려운 게 (~ 250의 해상도 측면 nm). 직접 확률적 광학 재건 현미경 (dSTORM) 한 작업량의 측면 해상도 증가 허용 하는 기술 이다. 여기, 우리가 측면 dSTORM 해상도 조밀한 조직 IF 네트워크의 그리고, 특히,의 경우 번들 microtubules를 둘러싼 해결을 보여줍니다. 이러한 꽉 협회는 이러한 두 네트워크의 조정된 규칙에 참여, 설명 어떻게 vimentin IFs 템플릿 및 microtubule 조직 안정화로 microtubule 종속 기공을 인신 매매에 영향을 미칠 수. 더 일반적으로, 우리는 듀얼 컬러 dSTORM 기술로 두 개의 cytoskeletal 컴포넌트의 관찰 그들의 상호적인 상호 작용에 대 한 새로운 통찰력을 제공 하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
세포질 중간 필 라 멘 트 (IFs)는 10 nm 직경 호모-또는 heteropolymers의 경우 단백질의 세포 유형 특정 하위 집합입니다. IFs는 세포 기능 세포 운동 성, 확산 및 스트레스 응답의 큰 범위에 참여합니다. 그들의 주요 역할은 90 이상 인간의 질병 직접 경우 단백질;에 돌연변이 의해 발생 하는 사실에 의해 강조 표시 예를 들어, 경우 구성에서 변경 함께 종양의 성장과 확산1,2,3. 3 골격 시스템 제어 셀 분극, 부문 및 마이그레이션2,3같은 세포질 기능을 공동에서 작업 하는 증거가 성장 하고있다. 공간 구조와 기능 간의 밀결합을 이므로 다른 필 라 멘 트와 함께 IF의 구조 조직에 대 한 통찰력을 얻을 하 고 cytoskeletal 잡담 이해 결정적 이다. 이 문서에서는 수퍼 해상도 기술 듀얼 컬러 dSTORM (직접 확률적 광학 재건 현미경)4 와 어떻게 경우 사이 상호 작용을 조사 하는 데 사용은 및 microtubules 수행 하는 프로토콜에 고정, 교양 2 차원 (2D)에 셀입니다.
지난 여러 슈퍼 해상도 기법 개발 되었습니다 10 년, 그리고 거기 발견 20145화학에 있는 노벨상의 근원에 있었다. 이러한 모든 기술 중에서 거짓말 같은 팜6 (Photo-Activated 지역화 현미경) photoswitchable 형광 단백질을 사용 하 여 폭풍7 쌍의 fluorophores 또는 dSTORM4 단일 분자 지역화 기반 방법 기존의 fluorophores와. 이러한 모든 메서드는 (i) 형광 기자 들의 대부분의 스위치 "off" 상태로 구성 된 동일한 원칙을 기반 으로"(비-형광), (ii)는 형광으로 그들의 부분 집합의 확률적 활성화 상태 지역화 하기 위해 그들의 공간 위치 나노미터의 정확도, 및 (iii) 가능한 fluorophores의 많은 하위 집합을 활성화 하려면이 과정의 반복입니다. 20 ~ 40까지 가로 해상도 제공 하는 활성화 된 분자의 모든 지역화를 사용 하 여 최종 이미지 재구성 nm. 팜/폭풍을 수 있도록 여러 상용된 광학 시스템 이제 일상적인 실험에 대 한 생물학에 대 한 사용할 수 있습니다. 여기, 하나의 같은 시스템 microtubules의 IFs 구조 협회 연구 사용 되었다. 모든 단일 분자 지역화 기반 방법 중, 듀얼 컬러 dSTORM 기술을 선정 되었다, 그것은 매우 얇은 플레이트 영역을 관찰 하는 데 적합 하기 때문에 (< 1 µ m) 부착 셀의 이미지 해상도의 상당한 향상을 제공할 수 있습니다 최소한의 시간과 돈을 투자입니다. 실제로, dSTORM 면역 형광 세포 얼룩을 정기적으로 사용 하는 표준 유기 염료와 호환 되는 매우 편리 하 고 다양 한 기술입니다.
듀얼 컬러 dSTORM 실험 조건을 최적화 하는 제한 된 경우에 특히 두 염료 선택된 버퍼에 제대로 깜박일 수 있습니다 하는 데 필요한 하나의 색상 dSTORM 이미지 fluorophore Alexa6478를 사용 하 여 얻기 위해 상대적으로 간단한 동안, 레이저 파워입니다. 우수한 논문 dSTORM9,10,11,,1213, 멀티 컬러 이미지를 설정 하는 방법에 사용할 수 있으며 이러한 서류 자세히의 가능한 소스 설명 유물과 저하 이미지 해상도 그들을 극복 하는 방법. 이 문서, 셀 고정, immunostaining, 샘플 준비 최적의 실험 조건, 이미지 수집 및 이미지 재구성에서는 밀도 세포질 경우 네트워크와에 microtubules의 이미지 순서 설명 듀얼 컬러 dSTORM와 glial 세포입니다. 간단히, Chazeau 외12 에서 설명 하는 추출/고정 방법을 glial 세포에 적응 되었고 후 정착 단계, 최적화 된 항 체 농도와 사용, 10 m m 폭풍 버퍼 MEA 뎀시9 외 인에 설명 된 실험 설정 및 샘플 형식에 대 한 최적의 발견.
Glial 세포는 주로 세 가지 유형의 경우 단백질을 표현: vimentin, nestin와 GFAP (glial 산 성 fibrillary 단백질). 이 3 개의 단백질은 이다14공동 유해를 표시 했다. 우리는 이전 슈퍼 해상도 구조화 조명 현미경 (SR SIM)이 세 경우 단백질 같은 단일 경우 필 라 멘 트에 찾을 수 있습니다 그리고 glial 세포 15에서 비슷한 분포 및 역학 표시는 사용 하는 것을 보였다. 3 IF 단백질 사이의 유사성 때문 vimentin 얼룩 사용 되었다 기자로 서 모든 경우에 네트워크에 대 한. DSTORM를 사용 하 여, 우리 어떻게 회절 가능 했다 microtubules 따라 경우 양식 번들 현미경 기법15제한 해결 관리. 이러한 관측 vimentin IFs 템플릿 microtubules 수 하는 방법을 이해 하 고 셀 마이그레이션16극성 축 유지 보수 홍보 그들의 성장 궤도 조절 하는 데 도움이 됩니다. 슈퍼 해상도 이미지 두 cytoskeletal 서브 시스템의 상호 작용에 중요 한 정보를 제공 하 고 공간 협회와 셀 형 특정17수 있는 로컬 기능 사이의 링크에 대 한 통찰력을 가져. 일반적으로, 밀도 및 특이성 좋은 immunostaining 조건에 도달 하 듀얼 컬러 dSTORM cytoskeletal 요소 또는 다른 유형의 세포, 사이 누화를 공부에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 astrogliosis 중 고 세포종에서 골격 변화 특성을 더 도움이 될 것입니다, 그리고 가장 일반적인 및 가장 악성 종양의 경우 단백질의 표정은 이다 중앙 신경 변경 18 19,,2021.
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Protocol
1. Coverslips 준비 (1 일, 30 분)
- 18 m m nº1.5H (5µm + 170 µ m) 유리 coverslips를 플라스틱 선반에 놓습니다.
- 랙 아세톤과 5 분 담가 가득 100 mL 비 커에 넣어.
- 100 mL 비 커에 전송 랙 절대 에탄올 5 분 담가 가득합니다.
- 절대 에탄올 가득한 새로운 100 mL 비 커에 선반을 전송 하 고 초음파 청소기 장치에서 비 커를 배치 (재료의 표 참조) 실내 온도에. "에" 누르고 10 분 기다립니다.
- 층 류 흐름 후드 랙 넣고 coverslips 건조 또는 필터링 된 공기 흐름으로 coverslips를 건조 하 게.
- 플라즈마 클리너 장치에 coverslips와 선반을 넣어. 진공 펌프에 스위치, 문을 닫고, 진공 청소 후 1 분 사용 된 coverslips에 대 한 플라즈마에 스위치를 3 분까지 기다립니다. 그들을 저장 하지 마십시오.
2. 셀 도금 (1 일, 20 분)
- Glial 세포 라인 U373 최소 필수 매체 (MEM)에 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스, 및 1% 비필수 아미노산 10 cm 직경 플라스틱 페 트리 접시에 성장.
- 층 류 흐름 후드 12-잘 접시에 깨끗 한 유리 coverslips를 놓고 잘 당 preheated 셀 매체의 1 mL를 추가 합니다.
- (37 ° C, 5% CO2) 셀 인큐베이터에서 세포를 포함 하는 접시를 가져가 라.
- 매체를 제거 하 고 10 mL PBS를 추가.
- PBS를 제거 하 고 추가 1 mL 0.05% 트립 신-EDTA.
- 다시 2-3 분 인큐베이터에에서 접시를 놓습니다.
- 접시에 37 ° C에 미리 데워 따뜻한 매체의 10 mL을 추가 하 고 셀을 resuspend.
- 종자는 coverslips를 포함 하는 12-잘 접시에 잘 (셀 ~ 150 µ L) 당 약 100 000 셀입니다.
- 셀 확산 수 있도록 적어도 6 h (또는 숙박)을 기다립니다.
3. 셀 고정 (주 2 일 2 시간)
- 80mm 파이프, 7 m m MgCl2, 1mm EGTA, 150 mM NaCl, 골격 버퍼를 준비 하 고 6.9에 산도 조정.
- PBS 한번 셀을 씻어.
- PBS를 제거 하 고 부드럽게 잘 추출/고정 솔루션의 당 1 mL을 추가 (0.25%도, 0.3% 골격 버퍼에 Triton X-100) 37 ° c.에 preheated
- 60에 대 한 품 어 실 온에서 s.
- 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 잘 데워와 갓 4 %PFA (paraformaldehyde) 솔루션의 골격 버퍼에 희석 당 1 mL를 추가 합니다.
주의: 장갑을 사용 하 고 화학 후드 작동. - 다시 10 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서에서 12-잘 접시를 놓습니다.
- 제거는 PFA 고 잘 당 PBS의 3 mL를 추가 합니다.
참고: 장갑과 화학 후드 작업과 재활용된 PFA 특정 빈에 넣어. - PBS로 2 회 세척.
- PBS를 제거 하 고 글에서 나오는 autofluorescence을 냉각 하기 위하여 PBS에 희석 갓된 10 mM NaBH4 솔루션을 추가 합니다.
- 실 온에서 7 분 동안 품 어.
- 특정 빈에 재활용된 NaBH4 를 넣어.
- PBS로 세척 몇 번이 고 5 분입니다.
- PBS를 제거 하 고 차단 솔루션 (PBS에 5 %BSA 솔루션)를 추가 합니다.
- 1 시간 실 온에서 (또는 하룻밤 4 ° C에서)에 대 한 품 어.
참고: 골격 버퍼는 몇 달 동안 실내 온도에 저장할 수 있습니다. PFA, NaBH4 도 (후드, 장갑, 그리고 특정 재활용 쓰레기통) 특별 한 주의 함께 처리 되어야 합니다. 솔루션 추가 하 고 셀의 무결성을 유지 하기 위해 부드럽게 제거 한다. 그것은 건조 하는 셀을 못하게 하는 것이 중요입니다.
4. Immunostaining (일 2, 5 h)
- 안티-vimentin 및 안티 tubulin 차단 솔루션에서 1: 500 희석 사용 하 여 기본 항 체의 솔루션을 준비 합니다.
- 100 µ L 방울 희석된 주 항 체를 파라핀 영화 레이어에 넣고 아래쪽으로 직면 하는 세포와 그들의 위에 coverslips를 배치.
- 2 헤 PBS 가진 coverslips 12-잘 접시에 가득 넣어에 대 한 1 차 항 체와 세포를 품 어. 5 분 궤도 셰이 커에 실 온에서 PBS에 각 시간에 대 한 세 번 린스.
- 한편, 반대로 마우스 Alexa647과 반대로 쥐 Alexa555 차단 솔루션에서 1:1, 000의 희석 사용 하 여 보조 항 체 솔루션을 준비 합니다. 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체와 세포를 품 어. 4.2 처럼 진행 합니다. 빛 으로부터 세포를 보호합니다.
- PBS는 coverslip 다시 12-잘 접시에 가득 합니다. 5 분 궤도 셰이 커에 실 온에서 PBS에 각 시간에 대 한 세 번 린스. PBS를 제거 하 고 PBS 섞인 0.1 µ m tetraspeck 구슬의 1 µ L의 0.5 mL를 추가 합니다.
- 30 분 PBS와 린스에 대 한 궤도 통에 우물을 넣어. PBS를 제거 하 고 PBS에 4 %PFA 솔루션 5 분에 대 한 셀을 품 어. PBS에서 몇 번이 고 씻어.
참고: 고정된 셀 몇 4 ° c.에 PBS에 주 동안 저장 될 수 있다 Immunostaining는 마지막 순간에 이루어져야 한다.
5. 샘플 준비 (3 일, 5 분)
- MEA (시스테, 1 M, pH 8.3), 포도 당 산화 효소 (100 x, 50 mg/mL), 카 탈 라 제 (500 x, 20 mg/mL)의 aliquots는 얼음 바구니에 넣어.
- NaCl Tris 버퍼의 50 mL를 준비 (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) 포도 (100 mg/mL)의 10% 보충.
- 10% 포도 당으로 NaCl Tris 버퍼에 10mm MEA, 0.5 mg/mL (75 U/mL) 포도 당 산화 효소, 40 µ g/mL catalase (80-200 U/mL)와 이미징 직전 버퍼 이미징의 1.2 mL를 준비 합니다.
- 마그네틱 샘플 홀더 (예: chamlide 챔버)에 레이블이 지정 된 셀을 포함 하는 coverslip 탑재 하 고 챔버를 완전히 채우기 위해 이미지 버퍼를 추가 합니다. 는 뚜껑을 넣고 이미징 버퍼와 뚜껑 사이 아무 공기 방울이 있는지 확인.
- 절대 에탄올 샘플의 바닥을 청소 하 고 누출 하지 않습니다 확인 합니다. 그리스를 사용 하 여 필요한 경우 샘플 홀더를 제대로 인감.
참고: 1 M 재고 MEA 솔루션 (pH 8.3 HCl을 사용 하 여 조정), 50 mg/mL에서 포도 당 산화 효소의 물에 20 mg/mL에서 catalase의 재고를 준비, aliquots 만들고 MEA 및 포도 당 산화 효소 및 catalase의 연도 대 한 최대 한 달 동안-20 ° C에서 저장. Aliquots을 refreeze 하지 마십시오. NaCl Tris 버퍼를 사전에 준비 하 고 몇 달 동안 실내 온도에 저장. 실험 (단계 5.3)의 날에 포도 당을 추가 합니다.
6. 이미지 수집 (3 일, 셀 당 ~ 1 h)
- 현미경에 전환 합니다. 수집 소프트웨어에 스위치와 시스템 시작을 누릅니다.
- 설치 관리자 도구 그룹에서 인수 탭 확장 이미징 설치 도구를 선택 합니다. 인수의 레이저 WF (와이드 필드) 모드를 선택 합니다. 100 X 나 1.46 목표를 선택 합니다. TIRF u-HP 모드 조명 되 고 보기의 필드를 줄이기 위해는 겨냥 틀을 사용 하 여 선택 하 고 더 작은 영역으로 레이저 에너지를 집중. optovar 1.6 x 렌즈 100nm의 픽셀 크기를 사용 합니다.
- 시계열 도구를 선택 하 고 시간 경과 50 000 프레임 및 프레임 사이의 0.0 ms를 설정. 인수 매개 변수 도구 그룹에서 채널 도구를 확장 하 고 "모두 보기"를 선택 하십시오.
- Alexa647 트랙 설정: 여기 라인 레이저는 642와 405 그들을 수락 확인. 영상 설정에서 "655 LP" 방출 필터를 선택 합니다. "647을"를 이름을 바꿉니다.
- 클릭 다른 가벼운 패스를 추가 하 고 선택 모드를 채널 도구에서 '+'에 "스위치 트랙 모든: 프레임" 이미지 설치 도구에서. 561 488, 405 레이저 라인을 확인 하 고 그들을 설정 하려면 수락. 선택은 "혈압 570-650 + LP750" 방출 필터 및 optovar 렌즈 1.6을 사용 하 여 x. TIRF-uHP 모드 선택 되어 있는지 확인 하십시오. 트랙을 "555"의 이름을 바꿉니다.
- 획득 모드 도구를 선택 하 고 200 x 200 픽셀 프레임 크기를 설정 합니다. 초점 장치 및 전략 도구를 선택 하 고 (경우 초점 잠금 시스템) 1 000 프레임에 확실 한 포커스를 설정.
- 목표에 석유를 넣고 샘플을 넣어. 찾기 탭을 선택 하 고 형광 램프의 셔터를 엽니다. 초점을 찾을 하 고 접 안 렌즈를 사용 하 여 이미지를 찾습니다. 조이스틱을 사용 하 여 보기의 필드의 중앙에 넣어.
- 획득 모드 돌아가 인수 탭을 선택 합니다. "647" 트랙 선택, 642-레이저 전력 0.2%로 설정, 0 405-레이저 전원 설정, 노출 시간 설정 50 ms 및 50의 이득. 연속 수집 모드 관찰 화면에 셀을 선택 합니다. 초점을 조정 합니다. 보기의 필드에 하나 이상의 tetraspeck 구슬 있는지 확인, 필요한 경우 그들을 보고 대비를 증가. 자동-스케일 모드를 사용 하 여 디스플레이 대 한. Vimentin 네트워크의 넓은 필드 epifluorescence 이미지를 스냅 클릭 하 여가지고 고 그것을 저장 합니다. TIRF 조명을 확인 하려면 TIRF 클릭, 조명의 동종 분야 하 고 그것을 저장 하는 데 필요한 경우 조명 겨냥 틀의 각도 조정 합니다.
참고: TIRF와 epifluorescent 이미지는 높은 품질의 원시 데이터 수집을 시작 하기 전에 중요 하다. 불연속, 비균일 레이블이 필 라 멘 트 품질 dSTORM 이미지 상승을 줄 것 이다. - "647" 트랙의 선택을 취소 하 고 선택 하 고 확인 "555" 트랙. Microtubule 네트워크의 epifluorescence 이미지 가져가 라 하 고 그것을 저장 합니다. TIRF 이미지와 너무 합니다.
- "555" 트랙을 선택을 취소, 선택 하 고 "647" 트랙을 확인 다음 연속. 0으로 이득의 넣고 10 양 노출 시간 설정 642 nm 레이저 전원 100% 어두운 상태로 (~ 2 kW/cm2) Alexa647 염료의 대부분을 펌프. 일단은 fluorophores 점멸 시작, 15 ms에 노출 넣고 300를 얻을. 조명의 TIRF 모드를 선택 합니다. 자동 규모 없이 범위 표시 모드를 사용 하 여 단일 분자 신호 (빨간 색으로 표시 된) 카메라를 포화 하지 않습니다 확인. 채도 사라질 때까지 그 경우에 이득 감소. Tetraspeck 구슬 수집의 시작 부분에 포화 상태로 유지 됩니다. 셀의 연속 관측을 중지 하려면 중지 를 누릅니다.
- 온라인 처리 도구를 확장 하 고 온라인 팜 처리 중 폭풍 이미지 시각화를 확인. 다음 매개 변수를 사용 하 여: 피크 마스크 크기 (9 픽셀 직경) 및 잡음에 피크 강도 대 한 6 9. 논문 매개 변수 처리 (충분히 밝고 하지 중복)에 고려는 분자를 정의 합니다. PAL-통계 도구에서 플롯 유형 선택: 히스토그램, 그리고 히스토그램 소스: 정밀도. 수집을 시작을 누릅니다.
- 중, 촛점 (아무 초점 잠금 장치 경우) 필요한 경우. (노출, 레이저 힘) 매개 변수를 조정 (0.001%에서 시작) 단일 분자 사이 1 µ m의 최소 거리 fluorophores의 중간 밀도 유지 하는 405 nm 레이저 선 결국 전환 (> 9 픽셀 100 nm, 피크 마스크 크기) ( 그림 1A-B). 분자 밀도 조금 너무 높은 경우 TIRF 대신 조명 힐로 (높은 경향 및 광학 적 층 시트) 모드를 사용 합니다. 이 레이저 힘 20% 증가 합니다. 주위에 또는 10 아래 아래 복원된 이미지 히스토그램에 지역화 정밀도의 최대 중심으로 확인 nm.
참고: 시간과 함께, 분자 수가 감소 하는 일반적으로 그리고 405 nm 레이저 파워를 따라 천천히 증가. 지역화 정밀 (슈퍼 해상도 이미지 아래에 표시 되는 히스토그램) 피크 10 아래 가능한 한 많이 감소 하는 목표는 nm (그림 1C). 필요한 경우, 너무 많은 밝은 구슬 필드에 존재 하는 경우 팜 이미지의 명암을 증가. - 106 국부 (일반적으로 40 000 프레임) 후에 도달 되는 영화를 막으려고 중지 를 누릅니다. 0.2%로 다시 레이저를 넣어 (642 nm)와 0 (405 nm). .Czi 형식으로 폭풍 수집의 원시 데이터를 저장 합니다. 트랙 "647" 채널 도구에서 선택을 취소 합니다 선택 하 고 트랙 "555" 확인.
- 25 ms 노출 시간을 설정 하 고 0을 얻을. 연속 버튼 누르고 펌프 Alexa555 염료 어두운 상태 (~ 2 kW/cm2 각)을 100% 모두 561 488 레이저 설정. fluorophores 점멸, 250, 이득을 넣어 시작 힐로 조명 모드를 사용 하 고 단일 분자 범위 표시 모드와 카메라를 포화 하지 마십시오 확인. 그 경우는 이득 감소. 중지를 누릅니다. 488-레이저 파워 50%를 감소.
- 수집을 시작을 누릅니다. 중, 채도의 제한에서 반드시 이득을 점차적으로 증가. 405 nm 레이저 파워 시야 (참조 단계 6.18)에 단일 분자의 중간 밀도 유지를 단계적으로 증가. 405 레이저 15% 보다 높은 경우 488 레이저 파워를 20-30% 감소. 그런 다음 점차적으로 분자를 가능한 한 빨리 점멸 유지 하기 위해 405 레이저 라인을 증가 하는 동안은 488 감소. 최대한 강도로 561 여기 레이저와 결합 488 레이저 라인 모두 온 / 오프는 fluorophores의 405 레이저 라인만에 비율을 증가 하는 반면 증가 한다.
- 아니 더 많은 분자는 깜박이 이상의 500 000 있어 (후 약 20 000 프레임)에 도달 된 수집 이상 중지 합니다. .Czi 형식으로 폭풍 수집의 원시 데이터를 저장 합니다.
참고: 항상 더 높은 파장을 피하기 위해 표백 (또는 활성화) 다른 색상의 시작 합니다. 그것은 정기적으로, 예를 들어 이미지 버퍼를 변경할 수 때문에 chamlide 챔버는 봉인 하지 다른 버퍼 조건을 테스트 합니다. 488 레이저 라인을 사용 하 여 알 렉 사 555 염료를 고갈 하 561 레이저 파워 (100 mW 레이저)와 제한 된 경우에 필요 하다.
7. 이미지 재건 (5 분)
- PAL-드리프트 도구에서 8의 최대 크기를 가진 자동 세그먼트 모델 기반 보정 유형을 사용 합니다. 눌러 적용 여러 번 연속에서 드리프트 해결 될 때까지. 이 모델 기반 보정 알고리즘 수정 드리프트 교차 상관 분석에 따라 적용 됩니다.
- PAL-필터 도구를 사용 하 여 분자를 현지 최고의 했다만 선택 하 여 폭풍 이미지의 모양을 향상 시킬. 예를 들어 30 지역화 정밀도 제한 및 120-180 nm PSF.
- 1 PSF. 렌더링 선택 자동 동적 범위 값이 95 %HR 렌더링 자동 동적 SWF 90% 값의 확장 요소와 가우스 디스플레이 모드 뿐만 아니라 PAL 렌더링 도구 5 또는 10 nm의 픽셀 해상도 사용 합니다. 최고 품질의 렌더링을 선택 합니다.
- 처리 탭 (후 처리 모드)의 팜 메뉴에서 팜 변환을 선택 합니다. 선택 하 고 다음 적용을 누릅니다. 형식으로 만든된 이미지를 저장 합니다. LSM (그리고 하지.czi, 매우 중요 한).
참고: 이미지 재구성 수집 또는 수집 소프트웨어의 이미지 처리 모드를 사용 하 여 저장 후 즉시 수행할 수 있습니다. 오프 라인 모드를 후 처리에서 매개 변수 (피크 마스크 크기, 잡음에 피크 강도)의 값이 다른 스택 분석 가능 하다. 항상 "겹치는 분자 취소" 하지 "평균 지역화 하기 전에"를 선택 합니다.
8. 폭풍 이미지 (10 분)의 지역화 정밀 추정
- 폭풍 원시 데이터를 열고 탭 팜 방법 선택 하 고 손바닥 을 다시 처리 하는 이미지를 사용 합니다. 선택키를 누릅니다.
- 9와 6 (또는 이미지에 대 한 선택 매개 변수)의 소음에 피크 강도 피크 마스크 크기를 사용 하 여 재구성을 시작 하려면 적용 을 누릅니다.
- 사각형 그래픽 도구를 선택 하 고 단일 분자를 유리 표면에 주위 raw 이미지에 사각형을 그립니다. 일반적으로 몇 가지 단일 분자 거기 있다.
- 프레스 적용 다시, 그리고 사각형 영역 내에 있는 분자 분석.
- PAL-통계 도구에서 플롯 유형 선택: 막대 그래프 및 히스토그램 소스: 위치 또는 Y 위치, 위치 막대 그래프를 시각화.
- 이미지 아래 왼쪽에 있어 목록으로 테이블을 저장 합니다.
- 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 만들 히스토그램의 X 및 Y 위치 (그림 1D).
- 가우스에 의해 배포판에 맞게 하 고는 σX , σY 값을 저장 합니다. 지역화 정밀 σSMLM (σX *σY)에 의해 추정 된다 ^0.5.
- 가능한 많은 분자에 8.3-8.8 단계를 반복 하 고 평균 σSMLM
9. 채널 등록 (5 분)
- 피지 (이미지 J) 소프트웨어를 사용 하 여 각 색상의 폭풍 이미지를 엽니다.
- 각 tetraspeck 구슬의 위치를 측정 하기 위해 자동 선택 도구 선택 합니다.
- 각 구슬에 대 한 X 및 Y 변화를 계산 하 고 그들을 평균.
- "변환" 명령을 사용 하 여 계산으로 두 번째 이미지 번역 X 및 Y 교대.
- 병합 채널 명령을 사용 하 여 두 이미지를 병합 합니다.
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Representative Results
현미경 50 mW 405 nm 및 장비 100 mW 488, 561와 642 nm 고체 레이저, 한 EMCCD 512 x 512 카메라, 알파 계획 apo는 100 X / 1.46 객관적이 고 밴드 통과 570-650 / 긴 655 방출 필터를 통과 아래 제시 하는 대표적인 결과 위해 사용 되었다.
그림 1A raw 이미지 수집 하는 동안 사용 해야 하는 잡음 비율 분자 밀도 신호의 예를 제공 합니다. 좋은 품질의 이미지 이웃 분자 사이 ~ 1 µ m의 최소와 함께 얻을 수 있습니다. 좋은 깜박이 조건에 fluorophores 하나의 프레임에 존재 해야 합니다. 이미지 버퍼 조건 (pH, 감소 요원, 산소 시스템 청소)를 조정 하는 데 필요한 좋은 점멸 및 영향에-및 오프-요금 fluorophores, 따라서 의무의 레이저 힘 주기 (시간에는 fluorophore의 분수 에 상태)9,11. 그림 1B, 그와 반대로, 분자 밀도가 너무 높은 하 고 단일 분자를 확인할 수 없습니다 원시 이미지의 예를 제공 합니다.
그림 1C 감지 및 20 000 프레임의 스택 으로부터 제조 업체 소프트웨어에 의해 분석 하는 모든 분자에 대 한 지역화 정밀도의 전형적인 히스토그램을 보여 줍니다. 이 히스토그램은 그림 3B에서 microtubule 네트워크의 dSTORM 이미지에 해당 합니다. 지역화 정밀 제조 업체 소프트웨어에 의해 제공의 값 값 예상된 다음 8 단계, 다른 시간 포인트22 (그림 1D) 지역화 된 단일 분자의 포인팅 정밀도 사용 하 여와 좋은 계약에 있습니다.
그림 2A vimentin 필 라 멘 트 immunolabeled와 Alexa647의 dSTORM 이미지의 전형적인 예를 보여 줍니다. 해상도 증가 명확 하 게 표준 넓은 필드 현미경 (그림 2B-C)으로 인수 하는 이미지와 비교에 관찰할 수 있습니다. 그림 2D 에서 형광 강도 프로필 표시 슈퍼 해상도 현미경 이미징 vimentin 번들을 확인할 수 있습니다. DSTORM 해상도 번들에 필 라 멘 트의 수를 계산 하 게 충분 하다.
그림 3 은 각각 Alexa647와 Alexa555 vimentin 및 tubulin 네트워크 immunolabeled의 듀얼 컬러 dSTORM 이미지의 전형적인 예를 보여 줍니다. 두 네트워크의 오버레이 vimentin 번들 종종 두 골격 하위 시스템 간의 결합에 주요 구조 정보를 제공 하는 microtubules 따라 지역화를 보여 줍니다.
그림 4 는 비-최적의 조건에서 얻은 microtubules의 dSTORM 이미지의 다양 한 예제를 보여 줍니다. 첫째, 143 m m 베타-mercaptoethanol (다른 reductive 에이전트 MEA9,,1011대신 사용) 및 산소 청소 시스템 (0.5 mg/mL 포도 당 산화 효소와 40 µ g/mL의 구성 사용 하 여 Alexa488 및 버퍼 카 탈 라 제)에 fluorophores 깜박 했다 하지만 정확 하 게 지역화 된 (너무 낮은 광자 수)를 충분히 밝은 했다 (그림 4A). 둘째, Alexa555를 사용 하 여 베타-mercaptoethanol 143 m m, 50mm MEA와 시스템을 청소 하는 산소에 fluorophores 어두운 상태로 펌핑 하지 수 고 따라서 않을 공간 잘 분리 (너무 높은 듀티 사이클, 즉 "on" 상태에 있는 시간의 비율 너무 깁니다) (그림 4B). 마지막으로, Alexa568를 사용 하 여 베타-mercaptoethanol 143 m m, 50mm MEA와 시스템을 청소 하는 산소는 fluorophores 밝은 되었고 했다 깜박이 천천히 함께 아주 긴 "에" 및 "off" 상태 (낮은 광자 숫자와 너무 높은 듀티 사이클) (그림 4C). 모든 비-최적의 조건에서 microtubule 네트워크 슈퍼 해상도 이미지에 제대로 렌더링 되었습니다. 결론적으로, 최적의 조건 높은 광자 수 fluorophores 하며 낮은 듀티 사이클 해당 이미지 버퍼에9,10 . 최적화 밀도 라벨 및 이미징 버퍼 조건 좋은 점멸 상태를 듀얼 컬러 dSTORM에 대 한 표준 절차 이며이 경우 microtubule 이미징 특정는 note.
퀴 논 정리에 따르면 그것은 필요가 fluorophores 매 10 20의 해상도 nm nm. 2D 구조를 확장, 뎀시 외 ~ 10 µ m2 당4 fluorophores의 라벨은 필요 추정. IF 네트워크는 밀도가 고 그것의 필 라 멘 트 얇은 (10 nm 대 25 nm 직경 1 차 및 이차 항 체 없이) 비교 microtubule 네트워크, 두 번 더 있어는 경우 네트워크를 설명 하는 데 필요한 관찰 합니다. 우리는 5 000 지역화 / µ m2 면 및 2500 지역화/µm² 각각 40 000 프레임 및 20 000 프레임으로 얻은 microtubules에 대 한 좋은 이미지를 얻을. 높은 해상도 이미지 σSMLM 의 지역화 정밀도로 얻은 ~ 8-12 nm (서로 다른 시간에 지역화 단일 분자의 포인팅 정밀 점22) 프로토콜의 8 단계 추정. 지역화 정밀도의이 추정 원시 데이터 (예를 들어 그림 1 c에 표시)에서 모든 검색 된 분자에서 추출한 지역화 정밀도의 히스토그램에 표시 된 제조 업체 소프트웨어에 의해 제공 되는 값으로 좋은 계약에 이었다. 이러한 지역화 정밀 ~ 30의 해상도 가진 이미지를 제공할 수 nm (2.35 * 정밀) 라벨 밀도 충분히 높은 경우. 우리가 정기적으로 관찰 vimentin 필 라 멘 트에 절반 최대 (FWMH) ~ 40 nm의 전체 폭 폭 ~ 55의 FWMH microtubules nm. 이미지 해상도 지역화 정밀도 지역화 밀도에 따라, 이후 우리 두 조건을 고려 하는 최상의 결과 수 있는 실험 조건을 제공 합니다.
그림 1 : 수집 및 지역화 정밀 예측 중 단일 분자의 최적의 밀도.
(A-B) 왼쪽: 단일 분자 (A) 밝은 상태에서의 최적의 조밀도 너무 높은 밀도와 단일 프레임에서 대표적인 raw 이미지 (B) 중 폭풍 (단계 6.12.) 고정된 U373 셀의 스테인드 안티 vimentin와 반대로 마우스 Alexa647입니다. 오른쪽: Raw 이미지 피크 강도 노이즈 임계값 (6으로 설정) 위의 형광 수준으로 단일 분자 (흰색 또는 빨간색) 동그라미에 의해 둘러싸여 있다. 원 지름 피크 마스크 크기 (9 픽셀으로 설정)에 의해 설정 되 고 분자 또는 하지 (레드)를 중복 여부를 결정 하는 색 (흰색). 중복 하지 고려 폭풍 이미지 재건에 대 한 분자의 높은 금액을 ((B))에 단일 분자의 높은 밀도 note A 삽입: 빨간색에서 단일 분자의 가우스의 전형적인 형광 강도 프로필을 보여주는 그래프 블랙에 적합. 이 예제에서는 지역화 정밀도 σx 6.7 = nm. 눈금 막대, 1 µ m입니다. 모든 분자에 대 한 지역화 정밀도의 히스토그램 (C) 전형적인 감지 하 고 제조 업체 소프트웨어에 의해 분석. 그것은 구상 될 수 있다 고 온라인 처리 덕분에 원시 데이터의 수집 기간 동안 정기적으로 업데이트 됩니다. 이 히스토그램은 그림 3B에서 microtubule 네트워크의 dSTORM 이미지에 해당 합니다. (D) 왼쪽: 단일 분자의 폭풍 이미지 재건 후 유리 표면에 선물 한다. 오른쪽: X 및 Y 위치 가우스 피팅 후 얻은 히스토그램 X 및 Y 배포판을 피팅 하는 가우스 지역화 정밀도의 견적을 제공 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Vimentin 네트워크의 대표 dSTORM 이미지. dSTORM 이미지 (A), 해당 표준 넓은 필드 이미지 (B) (C) U373 glial 세포 프로토콜에 설명 된 대로 고정 하 고 Alexa647와 vimentin 위한 스테인드의 첨단을 보여주는 오버레이 및. 강조 표시 된 영역의 하단: 확대/축소입니다. (D) 가로 강도 프로 파일 A에 확대 된 이미지에 노란색 선 따라 B. 눈금 막대, 2 µ m 및 500 nm에서 확대/축소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Vimentin microtubule 네트워크의 대표적인 듀얼 컬러 dSTORM 이미지. (A) Alexa647 Vimentin 네트워크 물 ( 그림 2A와 같이 같은). (B) Microtubule 네트워크 Alexa555로 표시. (C) 오버레이 vimentin (빨간색)와 오른쪽에 확대/축소 영역이 microtubule (녹청) 네트워크의. Vimentin의 dSTORM 이미지 ~1.5 백만의 40 000 프레임에서 지역화와 함께 얻은 것입니다. Microtubules의 dSTORM 이미지 ~ 850 000 20 000 프레임에서 지역화와 함께 얻은 것입니다. 눈금 막대, 2 µ m 및 500 nm에서 확대/축소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Microtubules의 비-최적의 이미징 조건의 예. 때에 fluorophores 깜박 하지만 충분히 밝은 Alexa488의 라벨 tubulin U373 glial 세포와 143 mM BetaMercaptoethanol 및 이미징 버퍼 (A) 에서 산소 청소는 fluorophores 충분히 밝은 있지만 제대로 될 수 없습니다 고갈 (최대 레이저 전원 사용 가능)에서 어두운 상태, 블 링크 천천히 143 m m BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA tubulin 그리고 산소 폐품 버퍼 (B) Alexa555와 fluorophores 천천히 점멸 되지 않을 때 Alexa568를 사용 하 여 밝은 tubulin 143 m m BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA와 산소 청소를 포함 하는 폭풍 버퍼에 표시 (C). 이러한 모든 경우에, dSTORM 이미지 해상도 저하는. 눈금 막대, 2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : U373 셀의 vimentin microtubule 네트워크의 대표적인 듀얼 컬러 dSTORM 이미지 고정 5 분에 대 한 차가운 메탄올 (A) Vimentin 및 (B) microtubules 네트워크 Alexa647와 Alexa555 각각으로 표시 강조 표시 된 줌. 필 라 멘 트 네트워크의 글로벌 해상도 감소 하는 세포질에는 세포의 앞에 단일 분자의 존재 note 눈금 막대, 2 µ m 및 500 nm에서 확대/축소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : DSTORM의 비교 이미지 재구성
제조 업체 소프트웨어 (A) 및 뇌우 (피지 플러그인) (B)에 의해 재건된 dSTORM 이미지. (C) 오버레이의 자홍색으로 (A)와 (B) 녹색. 눈금 막대, 2 µ m 및 500 nm에서 확대/축소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
프로토콜의 중요 한 단계
선물이 여기 microtubules의 dSTORM 이미지에 유물과 glial 세포에서 IFs를 최소화 하는 프로토콜. 샘플 준비 및 이미징의 모든 단계에서 아티팩트를 만들 수 있습니다: 고정, 차단, immunolabeling, 드리프트, 비-최적의 깜박이 조건23중. 우리는 가장 중요 한 단계 아래 목록.
표면에 fluorophores의 비 특정 바인딩 제한 하는 중요 한 단계는 청소는 coverslips 및 따라서 dSTORM 이미지에 배경 잡음을 제한.
PFA (paraformaldehyde) (n ° 3 단계)와 트리톤, 그리고 정착의 혼합을 사용 하 여 추출 및 고정 솔루션의 단계 샘플을 수정 하는 것이 좋습니다. 기정 프로토콜 Chazeau 외12에서 적응 시켰다: 우리는 60 추출/고정 단계 보육 시간 감소 s (3.4 단계), 골격 버퍼에서 포도 당을 제거 하 고 permeabilization의 추가 단계를 생략. 이 방법의 장점은 자유롭게 움직이는 cytoskeletal 소 단위는 멀리 배수, 적은 배경12슈퍼 해상도 이미징 수 있도록. 더 일반적으로 정착 단계는 중요 한 때문에 필 라 멘 트 네트워크의 부분 파괴에 나쁜 고정 (를 사용 하 여 오래 된 PFA, 차가운 솔루션, 너무 긴/짧은 인큐베이션 단계) 리드 (깨진된 microtubules, 셀 앞에 도달 하지 않습니다 microtubules /에 낮은 밀도). 그것은 또한 메탄올 고정을 사용 하 여 특히만 덕 외15에 설명 된 대로 vimentin 네트워크 몇 군데 note. 그러나, 배경 잡음 (그림 5) 셀 내부 관찰할 수 있습니다. DSTORM 이미지 얻은 메탄올 고정 있지만 셀의 가난한 품질, 그들은 여전히 제공 정보에 어떤 경우 고 microtubule 네트워크 처럼 보여야 예: 필 라 멘 트 밀도의 기간에서. 비록 그것이 microtubule 고정23에 대 한 최상의 프로토콜만도 함께 고정 IFs에 대 한 매우 가난한 결과 주었다.
Immunostaining 부분에서 쥐에서 개발 된 항 체와 cross-reaction 최소화는 반대로 마우스 항 체를 사용 하 여 중요 하다. 우리 때문에 그들은 비-로 마우스 안티 vimentin 뿐만 아니라 쥐 안티 tubulin cross-react 이런 이유로 Fab 조각 (반대로 마우스) 사용할 수 없습니다.
때문에 제한 된 레이저 전원 사용 가능, 561와 488 nm 레이저 라인 Alexa555 염료 어두운 상태로 펌프를 사용 하 여 필요가 있다. 높은 488 레이저 전원 (~ 50%)은 또한 좋은 깜박 하 고 낮은 듀티 사이클 (fluorophore는 시간의 틈새에 주에서 보낸다), 비록 그것 뿐만 아니라 배경 잡음을 증가 관찰 중 필요. TIRF 조명 모드 제한 얇은 층에 fluorophores의 여기 (~ 200 nm 유리 coverslip 위에). 그것은 배경 빛을 감소 하 여 신호 대 잡음 비율을 증가 하지만 또한 여기 파워를 감소 시킵니다. 힐로 모드 축 단면 있으며 신호 대 잡음 비율을 최적화 하려면 더 효율적일 수 있습니다. 따라서 피 고 TIRF 사이 좋은 중간 이다. 힐로 모드를 사용 하 여 효율적으로 제대로 깜박 하 고 레이저 파워를 필요로 하는 Alexa555 fluorophores 자극 필수적 이다.
또 다른 중요 한 단계는 원시 데이터 (6 단계)의 인수입니다. (노출, 이득, TIRF와 심지어 초점 초점 블록 장치가 없어도 사용할 수 있는 경우) 인수 매개 변수를 조정 해야 하는 영화를 인수 하는 동안. 밝은 fluorophores의 최적의 밀도 유지 하는 것은 중요 하다 (그림 1A): 그것은 충분히 낮은 공간 40 000 프레임 후 전체 구조를 시각화 하기 위해 충분히 높은 각 염료를 구분 되어야 합니다. 활성화 된 분자 수가 너무 낮은 경우, 더 이상 스택은 인수 한다. 우리 함께 좋은 이미지를 획득 ~ IFs 위한 µm² 당 5000 지역화 및 microtubules에 ² 당 2 500 있어.
수정 및 방법의 문제 해결
그것은 신선한 샘플을 사용 하는 것이 중요 하 고 최적화 된 버퍼 이미징입니다. pH 조정 되어야 한다 정확 하 게, 특히는 MEA에 대 한.
Vimentin 및 microtubules 보여야 균일 하 게 레이블이 지정 된 표준 넓은 필드 현미경 기술 (WF) 군데. 필 라 멘 트/클래식 현미경 점선 첨부 터 보고,이 슈퍼 해상도 사용 하 여 때를 증폭 될 것 이다. 이 경우에, 그것은 새로운 샘플을 준비 하기 좋습니다. 비 최적화 된 고정 조건 (오래 된 PFA 등) microtubules 조각난 찾고 발생할 수 있습니다. 유리 표면에 높은 백그라운드는 차단 하는 효과 없는에서 발생할 수 있습니다. 이 경우, BSA (소 혈 청 알 부 민) FBS (태아 둔감 한 혈 청), 대체 하 고 각 인큐베이션 단계에서 사용 될 수 있습니다.
라벨 밀도가 너무 높은 경우 (그림 1B) 수 없습니다 충분히 밀릴 어두운 오프-도로 상태의 높은 레이저 전원, 보조 금액 및 항 체 (1 차적인 항 체의 양을 감소 보다는 더 나은) 인하 한다. 그러나,이 새로운 샘플의 준비를 해야합니다. 일반적으로, 그것은 경험적으로 사용 하 여 보조 항 체의 양을 평가 하는 데 필요한입니다.
경우는 fluorophores 일반적으로 깜박 하지 않습니다 (그들은 해야 밝은 상태에서 한 동안), 이미징 버퍼의 pH 정확한 (pH 8.3) 인지 확인. 문제가 지속 되 면 (특히 나) 새로운 솔루션을 준비 합니다. 항상 TIRF 겨냥 틀 (TIRF u_HP) 켜져 있는지 확인 하십시오. 제한 된 레이저 전원, 깜박이 적절 한 취득 될 수 있습니다 도전 (온 / 오프 속도 뿐만 아니라 염료 밝기 레이저 전원에 따라 달라 집니다에 설명 된 대로 반 드 Linde 외11). 다른 염료 처럼 여기 레이저의 더 많은 전력을 사용할 수 있는14일 경우 Alexa488 또는 Atto488를 탐험 하실 수 있습니다.
fluorophores 40 000 프레임의 끝 전에 깜박이 중지 하는 경우 산화 수는 이미지 버퍼를 변경 합니다. 버퍼 변경 후 버퍼와 뚜껑 사이 아무 공기 방울 인지 확인 합니다. 봉인 된 샘플 원시에서 몇 시간 동안 몇 군데 될 수 있습니다.
폭풍 영화는 EMCCD를 갖춘 일반 TIRF 현미경에 인수 하는 경우 뇌우24 를 사용 하 여 이미지를 재구성 가능 하다. 비슷한 옵션 드리프트 보정, 이미지 필터링, 이미지 렌더링에 사용할 수 있습니다. 뇌우 피지/imageJ 소프트웨어와 함께 사용 하는 플러그인입니다. 유사한 결과 제조 업체 소프트웨어와 뇌우 (그림 6) 획득 했다.
침대 (cyclooctatetraene) 단일 분자의 지역화 정밀도 향상 시키기 위해 이미지 버퍼에 추가할 수 있습니다. 그것은 Alexa64725주기 당 방출 된 광자의 수를 늘립니다. 더 나은 지역화 정밀 실제로 관찰 되었다 (6 nm) 때 폭풍 버퍼에 2mm 침대 추가에 설명 된 5 단계 또는 100mm MEA에 설명 된 대로 참조25. 그러나, 이러한 조건에서 밝은 분자 중의 수 감소 많은 침대, 분자 지 방화는 수집의 끝에서의 총 수를 제한 하 고 잠재적으로 IF 네트워크의 아래 샘플링을 선도 하지 않고 보다 빠른. 다른 이미징 버퍼 예 산소 청소 시스템26으로 lactase 및 oxyrase를 사용 하는 알 렉 사 염료와 함께 잘 작동 하도록 알려졌다. 이 프로토콜에서 우리 보고 샘플 및 설정, 이미징의 우리의 종류에 대 한 해결책의 기간에 최상의 결과 준 버퍼 구성 하지만 각 샘플 필요 라벨 뿐만 아니라 버퍼 최적화 및 고정 조건 최적화.
메서드의 제한 및 가능한 개선
여기에 제시 된 방법은 고정된 셀 및 2D 이미지입니다. TIRF 현미경와는 EMCCD을 설정 이미징 표준 사용 하 여, 가장 제한 요소는 레이저 힘 (100 mW 561 nm 레이저에 대 한 깜박임 Alexa555 염료를 만들기 위해 충분 하지 않았다). 532 nm 레이저 라인 이러한 염료를 흥분 시키기 위해 더 효율적일 수 있습니다. 방법의 가능한 개선 3D dSTORM 광학 난시27을 사용 하 여 수행 하는 것입니다. 이 프로토콜 라벨 저밀도 및 증가 프레임 번호를 제외한 최소한의 수정 필요 합니다. 3D 듀얼 컬러 폭풍 이미지 번들에 특히 microtubules 감싸 IFs의 더 나은 보기를 제공할 것 이다. Note는 걸 필 라 멘 트 또한 관찰 될 수 있었다 동일한 고정 방법 및 형광 phalloidin8의 최적화 된 금액을 사용 하 여. 3 색 폭풍 3 cytoskeletal 서브 시스템의 조직 관찰에 사용 될 수 있습니다.
이차 항 체 20까지 지역화 되므로 관심의 개체의 크기를 증가 차 및 2 차 항 체를 사용 하 여 대상에서 nm. 일반적으로, 25 nm 직경 microtubule의 폭 해야한다 ~ 50 nm 라벨 후. 개선 목표와 염료 사이의 거리를 1 개의 가능성 직접 레이블을 적절 한 염료와 기본 항 체입니다. 이상적으로 유기 염료와 함께 표시 하는 nanobodies 사용된28이어야 한다.
우리 여기 Endesfelder 외22다음 단일 분자의 평균 지역화 정밀도 추정 하는 간단한 방법을 제공 합니다. 이미지의 전체 해상도 모두 지역화 정밀도 고려 하 고 밀도, 라벨 또한 측정 될 수 있다 푸리에 반지 상관 관계 접근29를 사용 하 여.
채널 등록에 관한 오버레이 보기의 필드에 완벽 하 게 모든 구슬에 어렵습니다. 더 복잡 한 보정 Chazeau 외 12에서 찾을 수 있습니다.
DNA-페인트 (Nanoscale 지형에 이미징에 대 한 DNA 포인트 축적)30을 사용 하 여 fluorophores의 깜박 하 고 프로브의 표백에서 발생 하는 한계를 극복할 수 있습니다. 이 방법에서는, 점멸 하는 단 하나 분자 지역화에 필요한 그들의 상호 보완적인 목표를 짧은 염료-표시 된 oligonucleotides의 과도 바인딩에 의해 생성 됩니다.
결론
이 문서는 듀얼 컬러 dSTORM 이미징 고정된 셀에 cytoskeletal 필 라 멘 트의 2 차원에서 수행 하는 강력한 프로토콜을 제공 합니다. 우리의 샘플 유형에 대 한 고정, immunolabeling 및 이미징 버퍼에서 최적의 발견 된 실험 조건 세부 사항에 설명 되어 있습니다. 다음, 원시 데이터 수집 및 기록 하 고 있는 깜박이 이미지의 종류의 과정 (분자 밀도, 신호 대 잡음 비, fluorophore 듀티 사이클 등) dSTORM 이미지를 재구성, 드리프트와 필터 데이터를 수정 하는 방법 제시. 이 단계는 듀얼 컬러 dSTORM 이미징에 대 한 일반적인 고 하지 유형 전용. 마지막으로, 어떻게이 기술을 두 개의 결합 된 cytoskeletal 네트워크의 조밀한 조직 해결 하는 데 도움이 표시 됩니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 미카엘 Lelek, Orestis Faklaris 및 유익한 토론을 위한 니콜라스 부르, 안드레이 Aristov와 엘레나 슈퍼 해상도 기법에 대 한 Rensen 및 Shailaja Seetharaman 원고의 주의 깊은 독서에 대 한 감사합니다. 우리는 기꺼이 (ANR-10-INSB-04; 프랑스 국립 연구 기관에서 지 원하는 프랑스 BioImaging 인프라 네트워크 뿐 아니라 UtechS 광학적 BioImaging (Imagopole) Citech의 파스퇴르 (파리, 프랑스)을 인정 미래에 대 한 투자), 그리고 지구의 Ile-de-France (도메인 d 프로그램 ' Intérêt Majeur-Malinf) Elyra 현미경의 사용에 대 한. 이 작품에 의해 지원 되었다는 리그 죄수 르 암과 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-16-CE13-0019).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 41090-028 | cell culture |
| non essential amino acid | Gibco | 1140-050 | cell culture 1/100e |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | cell culture 1/100e |
| Fœtal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | cell culture 1/10e |
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cell culture |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | cell culture |
| coverslip 18 mm n°1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | coverslips |
| paraformaldehyde (PFA) solution | Sigma | F8775 | cell fixation |
| glutaraldehyde | Sigma | G5882 | cell fixation |
| triton X100 | Sigma | T9284 | non ionic surfactant. Used for cell fixation |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | cell fixation |
| BSA | Sigma | A7906 | sample passivation 3% in PBS |
| Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse | Sigma | V6630 | primary antibodies |
| Rat anti alpha tubulin | Biorad | MCA77G | primary antibodies |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | secondary antibodies |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | secondary antibodies |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Fisher scientific | T7279 | fluorescent beads |
| Chamlide magnetic chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | for the blinking buffer |
| glucose oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G0543 | for the blinking buffer |
| glucose | sigma | for the blinking buffer | |
| catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | for the blinking buffer |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | for the blinking buffer |
| Wash-N-Dry coverslip rack | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | paraffin film |
| ultrasonic cleaner | Fisher scientific | 15-335-6 | |
| plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 |
References
- Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
- Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
- Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
- Eliasson, C., et al.
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
- Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
- Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
- Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
- Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
- Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
- Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
- Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
