Summary
O objetivo geral desta metodologia é dar as condições experimentais ideais de preparação da amostra para aquisição de imagem e reconstrução para realizar imagens de dSTORM 2D cor dupla de microtúbulos e filamentos intermediários em células fixas
Abstract
O citoesqueleto, composto de microfilamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários (se), desempenha um papel fundamental no controle da forma da célula, polaridade e motilidade. A organização das redes de actina e microtúbulos tem sido extensivamente estudada, mas da IFs não é ainda totalmente caracterizada. O iFs tem um diâmetro médio de 10 nm e forma uma rede estendendo-se por todo o citoplasma da célula. Eles estão fisicamente associados com actina e microtúbulos através de motores moleculares e linkers do citoesqueleto. Esta associação apertada é o cerne dos mecanismos de regulação que asseguram o Regulamento coordenado das três redes cytoskeletal requeridas para a maioria das funções celulares. É, portanto, crucial Visualizar IFs sozinho e, também, juntamente com cada uma das outras redes do citoesqueleto. No entanto, as redes se são extremamente densas na maioria dos tipos de células, especialmente nas células gliais, que faz com que sua resolução muito difícil de conseguir com microscopia de fluorescência padrão (lateral resolução de ~ 250 nm). Direto estocástico microscopia óptica de reconstrução (dSTORM) é uma técnica que permite um ganho na resolução lateral de uma ordem de magnitude. Aqui, nós mostramos que a resolução lateral dSTORM é suficiente para resolver a densa organização das redes se e, em particular, dos feixes se cercam os microtúbulos. Tal associação apertada é provável que participam na regulação coordenada dessas duas redes e maio, explicar como modelo de IFs vimentina e estabilizar a organização microtubule também poderia influenciar microtubule dependente tráfico vesicular. Mais geralmente, mostramos como a observação de dois componentes do citoesqueleto, com técnica de duplo-cor dSTORM traz a introspecção nova sua interação mútua.
Introduction
Filamentos intermediários citoplasmáticos (IFs) são 10 nm de diâmetro, homo ou heteropolímeros de um subconjunto específico de tipo de célula de proteínas se. O iFs participam em uma grande variedade de funções celulares, tais como respostas de estresse, a proliferação e a motilidade celular. Seu papel-chave é realçado pelo fato de que mais de 90 doenças humanas são diretamente causadas por mutações em proteínas se; por exemplo, alterações na composição se acompanha o crescimento do tumor e espalhar1,2,3. Existe uma crescente evidência de que os três sistemas de citoesqueleto trabalham em colaboração para controle de funções celulares como a polarização celular, divisão e migração2,3. Uma vez que existe um acoplamento forte entre funções e arquitetura espacial, é crucial obter insights sobre a organização estrutural do que com os outros filamentos e entender melhor o cross-talk do citoesqueleto. Este artigo fornece um protocolo para realizar a técnica de super-resolução duplo-cor dSTORM (direct estocástico reconstrução microscopia óptica)4 e como ele é usado para investigar a interação entre se e microtúbulos em fixo, culta células em 2 dimensões (2D).
Várias técnicas de super-resolução foram desenvolvidas ao longo dos últimos década e descobertas lá estavam na origem do Prêmio Nobel de química em 20145. Entre todas estas técnicas, encontra-se a métodos baseados em localização única molécula como PALM6 (microscopia de localização Photo-Activated) que usa photoswitchable proteínas fluorescentes, STORM7 com pares de fluorophores ou dSTORM4 com fluorophores convencional. Todos estes métodos são baseados no mesmo princípio que consiste em (i) o interruptor da maioria dos repórteres fluorescentes em um estado "desligado" "o estado de (não-fluorescente), (ii) a ativação estocástica de um subconjunto deles em um fluorescente para localizar suas posição espacial com precisão de nanômetros e (iii) a repetição deste processo a fim de ativar como muitos subconjuntos de fluorophores quanto possível. Uma imagem final é reconstruída usando todas as localizações das moléculas ativadas, fornecendo uma resolução lateral até ~ 20-40 nm. Diversos sistemas ópticos comercializados permitindo PALM/tempestade estão agora disponíveis para biólogos para experimentos de rotina. Aqui, um tal sistema foi usado para estudar a associação estrutural de microtúbulos e IFs. Entre todos os single-molécula localização com base em métodos, a técnica de duplo-cor dSTORM foi seleccionada, pois é bem adequado para observar regiões lamelares muito finas (< 1 µm) de células aderentes e pode proporcionar melhoria significativa de resolução de imagem com investimento mínimo de tempo e dinheiro. Com efeito, a dSTORM é uma técnica muito conveniente e versátil que é compatível com os padrão corantes orgânicos rotineiramente utilizados para coloração celular e imunofluorescência.
Enquanto uma cor dSTORM imagens são relativamente simples de obter usando o fluoróforo Alexa6478, dSTORM de cor dupla requer para otimizar as condições experimentais para que dois corantes podem piscar adequadamente no buffer escolhido, especialmente quando há limitado poder do laser. Excelentes trabalhos já estão disponíveis os métodos para definir as imagens de multi-color com dSTORM9,10,11,12,13, e esses papéis explicam em detalhe as possíveis fontes de artefatos e resolução de imagem degradada e também como superá-los. No presente artigo, as condições experimentais ideais em termos de fixação de células, imunocoloração, preparação da amostra, aquisição de imagem e reconstrução de imagem são descritos para adquirir imagens de citoplasma denso se redes e microtúbulos em células gliais com duplo-cor dSTORM. Resumidamente, o método de extração/fixação descrito no Chazeau et al.12 foi adaptado às células gliais e usado com uma etapa pós-fixação, concentração de anticorpos otimizado, um buffer de tempestade com 10mm MEA descrito em Dempsey9 et al, que foi encontrado para ser o ideal para a instalação experimental e tipo de amostra.
Células gliais expressam principalmente três tipos de proteínas se: vimentina, nestin e GFAP (proteína fibrilar ácida glia). Estes três proteínas foram mostradas para polimerizar co em astrócitos14. Mostramos anteriormente usando microscopia de iluminação Super-resolução estruturada (SIM SR) que estes três proteínas se encontram no mesmo filamento único se e que eles exibem semelhante distribuição e dinâmica em células gliais 15. Devido as semelhanças entre as três proteínas se, vimentina coloração foi usada como um repórter para toda a rede se. Usando dSTORM, conseguimos resolver como feixes de se forma ao longo dos microtúbulos, que não era possível com difração limitada de técnicas de microscopia15. Estas observações podem ajudar a entender como vimentina IFs pode microtúbulos modelo e regular a sua trajetória de crescimento, promovendo a manutenção de um eixo de polaridade durante a migração de células16. Imagens de super-resolução forneceram informações chaves sobre a interação mútua dos dois subsistemas do citoesqueleto e trouxeram o insight sobre a ligação entre a associação espacial e a função local que poderia ser o tipo de célula específica17. Em geral, duplo-cor dSTORM pode ser usado para estudar o crosstalk entre elementos do citoesqueleto ou outros tipos de organelas, desde que immunostaining boas condições são alcançadas em termos de densidade e especificidade. Esta técnica será útil para melhor caracterizar as alterações do citoesqueleto observadas durante astrogliosis e no glioblastoma, o tumor mais comum e mais malignos do sistema nervoso central, onde é a expressão de proteínas se alterou 18 ,19,20,21.
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Protocol
1. preparação lamelas (1 dia, 30 min)
- Coloque as nº1.5H 18mm (170 µm + /-5µm) as lamelas de vidro em uma cremalheira de plástico.
- Colocar o cesto cheio de acetona e molho por 5 min num copo de 100 mL.
- Transferi o rack para um copo de 100 mL com etanol absoluto e molho por 5 min.
- O rack de transferência para um novo copo de 100 mL cheio de etanol absoluto e colocar o copo em um dispositivo de limpeza ultra-sônico (ver tabela de materiais) à temperatura ambiente. Pressione "na" e aguarde 10 min.
- Coloque a grelha sob uma capa de fluxo laminar e deixe as lamelas secar ou secar as lamelas com fluxo de ar filtrado.
- Coloque a grelha com lamelas em um dispositivo de limpeza de plasma. Ligue a bomba de vácuo, feche a porta, esperar por 3 min fazer o vácuo e o plasma de 1 min. uso as lamelas, ligue logo após a limpeza. Não armazená-los.
2. célula chapeamento (1 dia, 20 min)
- Cresce a célula glial linha U373 em meio essencial mínimo (MEM) com 10% de soro Fetal bovino, 1% penicilina-estreptomicina e 1% não-essenciais aminoácidos no prato de petri plástico 10 cm de diâmetro.
- Coloque as lamelas de vidro limpo em placas de 12 poços sob o capô de fluxo laminar e adicionar 1 mL de meio de célula pré-aquecido por bem.
- Pegue um prato contendo células a partir da incubadora de célula (37 ° C, 5% CO2).
- Remover o meio e adicionar 10 mL de PBS.
- Remover a PBS e adicione 1 mL de 0.05% Trypsin-EDTA.
- Coloque o prato de volta na incubadora para 2-3 min.
- Adicionar 10 mL de meio quente pré-aquecido a 37 ° C, sobre o prato e ressuspender as células.
- Células de cerca de 100 000 sementes por alvéolo (~ 150 µ l de células) nas placas de 12 poços que contêm as lamelas.
- Aguardar pelo menos 6 h (ou durante a noite) permitir que a célula se espalhando.
3. fixação da pilha (dia 2, 2h)
- Preparar o buffer do citoesqueleto com tubos de 80 mM, 7 mM MgCl2, 1mm EGTA, 150 mM de NaCl e ajustar o pH a 6,9.
- Lave as células uma vez com PBS.
- Remover a PBS e suavemente, adicionar 1 mL por poço da solução de extração/fixação (0,25% glutaraldeído, 0,3% Triton X-100 no buffer de citoesqueleto) pré-aquecido a 37 ° C.
- Incubar durante 60 s à temperatura ambiente.
- Remover a solução e delicadamente, adicione 1 mL por alvéolo de pré-aquecido e recentemente preparada solução PFA (paraformaldeído) de 4% diluída no buffer de citoesqueleto.
Atenção: Usar luvas e trabalhar sob a capa de química. - Coloque a placa de 12 volta na incubadora a 37° C por 10 min.
- Remover o PFA e adicionar 3 mL de PBS por bem.
Nota: Trabalhar sob o capô químico com luvas e colocar o PFA reciclado em um escaninho específico. - Lave duas vezes com PBS.
- Remover a PBS e adicionar solução recentemente preparada de 10mm NaBH4 diluída em PBS, a fim de saciar a autofluorescência vindo de glutaraldeído.
- Incube durante 7 min à temperatura ambiente.
- Colocar o reciclado NaBH4 em uma posição específica.
- Lave três vezes 5 min com PBS.
- Remover a PBS e adicionar a solução de bloqueio (solução a 5% BSA em PBS).
- Encube por 1h à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 ° C).
Nota: O buffer do citoesqueleto pode ser armazenado em temperatura ambiente por alguns meses. PFA, NaBH4 e glutaraldeído devem ser manuseados com cuidado especial (capuz, luvas e latas específicas). Soluções devem ser adicionadas e removidas delicadamente a fim de preservar a integridade das células. É importante não deixar as células secas.
4. imunocoloração (dia 2, 5h)
- Prepare a solução de anticorpos primários usando antivimentina e antitubulina com uma diluição de 1: 500 na solução de bloqueio.
- Coloquei 100 gotas de µ l de anticorpos primários diluídos em uma camada de película de parafina e coloque as lamelas em cima deles com células virada para baixo.
- Incube as células com anticorpos primários por 2 h. Coloque as lamelas em uma placa de 12 preenchidas com PBS. Lavar três vezes para cada vez em PBS em temperatura ambiente em um agitador orbital de 5 min.
- Entretanto, prepare a solução de anticorpos secundários usando anti-rato Alexa647 e antirato Alexa555 a uma diluição de um 1:1, 000 na solução de bloqueio. Incube as células com anticorpos secundários por 1h à temperatura ambiente. Proceda como 4.2. protegendo as células de luz.
- Colocar a lamela em uma placa de 12 preenchida com PBS. Lavar três vezes para cada vez em PBS em temperatura ambiente em um agitador orbital de 5 min. Remover a PBS e adicionar 0,5 mL de PBS misturado com 1 µ l de 0,1 µm tetraspeck grânulos.
- Colocar os poços em um agitador orbital de 30 min. enxaguar com PBS. Remover a PBS e incube as celulas por 5 min com uma solução PFA 4% em PBS. Lave três vezes em PBS.
Nota: Células fixas podem ser armazenadas por um par de semanas em PBS a 4° C. Immunostaining deve ser feito no último minuto.
5. preparação da amostra (dia 3, 5 min)
- Colocar alíquotas de MEA (cisteamina, 1 M, pH 8,3), glicose oxidase (100 x, 50 mg/mL), catalase (500 x, 20 mg/mL) em uma cesta de gelo.
- Prepare-se 50 mL de tampão Tris-NaCl (50 mM Tris, 10 mM de NaCl, pH = 8) suplementado com 10% de glicose (100 mg/mL).
- Prepare 1,2 mL de tampão antes de imagem com 10mm MEA, glicose oxidase de 0,5 mg/mL (75 U/mL), 40 catalase µ g/mL (80-200 U/mL) de imagem no buffer Tris-NaCl com 10% de glicose.
- Montar a lamela contendo as pilhas etiquetadas no porta-amostra magnética (por exemplo, câmara de chamlide) e adicionar o buffer de imagem para preencher completamente a câmara. Coloque a tampa e certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar entre a tampa e o buffer de imagem.
- Limpar a parte inferior da amostra com etanol absoluto e verifique se não há vazamento. Use graxa de vedação do porta-amostras adequadamente, se necessário.
Nota: Preparar o estoque de 1 M de solução MEA (pH 8.3 ajustado usando HCl), estoque de glicose oxidase em 50 mg/mL e estoque de catalase em 20 mg/mL em água, fazer alíquotas e armazená-los em-20 ° C por até um mês para MEA e um ano para glicose oxidase e catalase. Não volte a congelar alíquotas. Preparar o tampão Tris-NaCl com antecedência e armazená-lo em temperatura ambiente por vários meses. Adicione glicose no dia do experimento (passo 5.3).
6. aquisição de imagem (dia 3, ~ 1h por célula)
- Ligue o microscópio. Ligue o software de aquisição e pressione iniciar o sistema.
- Selecione o Tab de aquisição Expand a ferramenta de Configuração de imagem no grupo de ferramenta Gerenciador de instalação. Selecione o modo laser WF (campo largo) de aquisição. Selecione o objetivo 100 X at 1.46 . Selecione o modo TIRF u-HP que usa um colimador para reduzir o campo de visão sendo iluminado e concentrar a energia do laser em uma área menor. Use o optovar 1,6 x da lente que dá um tamanho de pixel de 100nm.
- Selecione a ferramenta de séries temporais e configurar o lapso de tempo com 50 000 quadros e 0.0 ms entre os quadros. Expandir a ferramenta canais do grupo de ferramenta de parâmetro de aquisição e selecione "Mostrar tudo".
- Defina a faixa de Alexa647: Verifique se a 642 e 405 linhas para a excitação de laser e aceitar para ativá-los. Selecione o filtro de emissão "655 LP" na Configuração de imagem. Renomear "647".
- Clique no '+' na ferramenta de canais para adicionar outra passagem de luz e selecione o modo "agulha cada: moldura" na ferramenta de Configuração de imagem . Verifique a 561, 488 e linhas de laser 405 e aceitar para ativá-los. Selecione o "BP 570-650 + LP750" emissão de filtrar e usar a lente optovar 1.6 x. Verifique que o modo TIRF-uHP é selecionado. Renomear a faixa "555".
- Selecione a ferramenta de modo de aquisição e definir o tamanho do quadro para 200 x 200 pixels. Selecione a ferramenta de estratégia e dispositivos de foco e definir o foco definido para 1 000 quadros, (se houver um sistema de trava de foco).
- Coloque óleo no objectivo e coloque a amostra. Selecione a guia Localizar e abrir o obturador da lâmpada da fluorescência. Encontrar o foco e olhar para a célula a imagem usando a ocular. Colocá-lo no centro do campo de visão usando o joystick.
- Selecione a guia de aquisição para voltar ao modo de aquisição. Selecione a faixa "647" definir a potência do laser-642 a 0,2%, como a potência do laser-405 0, definir o tempo de exposição a 50 ms e o ganho de 50. Escolha o modo de aquisição contínua de observar o celular na tela. Ajuste o foco. Verifique se há pelo menos um grânulo de tetraspeck no campo de visão, aumentar o contraste para vê-los se necessário. Use um modo de dimensionar automaticamente para a exibição. Pegue uma imagem de epifluorescência campo amplo da vimentina rede clicando no encaixe e salvá-lo. Para verificar a iluminação TIRF, clique em TIRF, ajustar o ângulo de iluminação e/ou colimador, se necessário, para ter um campo homogêneo da iluminação e salvá-lo.
Nota: É importante que as imagens TIRF e epifluorescente são de alta qualidade, antes de iniciar a aquisição de dados brutos. Descontínuos, não uniformemente etiquetados filamentos dará origem a imagens de dSTORM de má qualidade. - A faixa "647" desmarque a opção e selecione e verificar se a faixa "555". Pegue uma imagem de epifluorescência da rede microtubule e salvá-lo. Pegue uma imagem TIRF e salvá-lo também.
- Desmarque a faixa "555", selecionar e verificar a faixa "647", então pressione contínuo. Coloque o ganho de 0 e tempo de exposição de 10 ms. definir a potência do laser 642-nm para 100% para bombear a maioria dos corantes Alexa647 ao estado escuro (~ 2 kW/cm2). Uma vez que o fluorophores começam a piscar, colocar a exposição a 15 ms e ganhar a 300. Selecione o modo TIRF da iluminação. Use o modo de indicador de intervalo sem escala automática para verificar que os sinais da molécula não saturar a câmera (indicada pela cor vermelha). Nesse caso, diminua o ganho até que desapareça a saturação. Tetraspeck grânulos permanecerá saturados no início da aquisição. Pressione parar para parar a observação contínua da célula.
- Expandir a ferramenta de processamento on-line e verificar Online processamento PALM para visualizar a imagem da tempestade durante a aquisição. Use os seguintes parâmetros: 9 para o tamanho da máscara de pico (diâmetro de 9 pixéis) e 6 para o pico de intensidade de ruído. Parâmetros de teses definirá as moléculas que são tidos em conta no processamento (brilhante o suficiente e não se sobrepõem). A ferramenta de Estatísticas-PAL , selecione o tipo de trama: histogramae histograma fonte: precisão. Pressione Iniciar aquisição.
- Durante a aquisição, recentrar se necessário (se não houver nenhum dispositivo de trava de foco). Ajustar os parâmetros (exposição, poderes do laser) e eventualmente ligar a linha de laser 405 nm (a partir de 0,001%) manter uma densidade média de fluorophores com uma distância mínima de 1 µm entre moléculas simples (> 9 pixels de 100 nm, o tamanho da máscara de pico) ( Figura 1A-B). Se a densidade da molécula é um pouco alta demais, use o modo de HILO (folha altamente inclinados e laminado ópticos) de iluminação em vez de TIRF. Isto irá aumentar a potência do laser em 20%. Certifique-se que o pico de precisão de localização no histograma abaixo da imagem reconstruída é centrado em torno ou abaixo de 10 nm.
Nota: Geralmente o número de moléculas diminui com o tempo e a potência do laser 405 nm é aumentada lentamente em conformidade. O objetivo é diminuir a precisão de localização (histograma exibida abaixo da imagem de super-resolução), tanto quanto possível, com um pico inferior a 10 nm (Figura 1). Aumente o contraste da imagem a PALM, se necessário, se muitos grânulos brilhantes estão presentes no campo. - Pressione parar para parar o filme, quando se chegou a mais de 10 localizações6 (normalmente depois de 40 000 frames). Colocar os lasers para 0,2% (642 nm) e 0 (405 nm). Salve os dados brutos da aquisição tempestade com o formato de .czi. Desmarque a faixa "647" na ferramenta de canais, selecione e verificar a faixa "555".
- Definir o tempo de exposição para 25 ms e ganhar como 0. Pressione o botão de contínuo e conjunto de lasers de 488 e 561 a 100% para bomba Alexa555 corantes ao estado escuro (~ 2 kW/cm2 cada). Uma vez que o fluorophores começam a piscar, colocar o ganho para 250, use o modo de iluminação de HILO e verificar que moléculas simples não saturar a câmera com o modo de indicador de intervalo. Se for esse o caso, diminua o ganho. Pressione parar. Diminua o poder de 488-laser de 50%.
- Pressione Iniciar aquisição. Durante a aquisição, aumente progressivamente o ganho para estar sempre no limite de saturação. Aumente o passo a passo o poder do laser 405 nm para manter uma densidade média de uma única molécula no campo de visão (ver passo 6.18). Diminua o poder do 488 laser de 20-30%, quando o laser 405 é superior a 15%. Em seguida diminua gradualmente a 488 aumentando a linha de 405 laser a fim de manter o piscar das moléculas mais rápido possível. A linha de 488 laser juntamente com o laser de 561 excitação em máxima intensidade aumenta tanto a ligar e desligar taxas do fluorophores, Considerando que a linha de 405 laser só aumenta a taxa de no.
- Pare a aquisição quando se chegou a mais de 500 000 localizações (depois de cerca de 20 000 frames) ou mais, quando não há mais moléculas estão piscando. Salve os dados brutos da aquisição tempestade com o formato de .czi.
Nota: Comece sempre com o maior comprimento de onda para evitar o branqueamento (ou ativação) de outras cores. Desde que a câmara de chamlide não é selada, é possível alterar o buffer de imagem regularmente, por exemplo, para testar as condições de reserva diferentes. Usando a linha de 488 laser para esgotar as tinturas de Alexa 555 é necessária apenas quando a potência do 561 laser é limitada (com lasers de 100 mW).
7. reconstrução de imagem (5 min)
- A ferramenta PAL-Drift , use o tipo de correção baseados no modelo com segmentos automáticos com um tamanho máximo de 8. Pressione aplicar várias vezes seguidas até que o desvio seja corrigido. Esta correção baseado no modelo se aplica um algoritmo baseado na análise de correlação cruzada que corrige a deriva.
- Usando as ferramentas de Filtro de PAL , melhorar a aparência da imagem tempestade, selecionando apenas as moléculas que foram melhor localizadas. Por exemplo, limitar a precisão da localização , a 30 nm e o PSF a 120-180 nm.
- Use uma resolução de pixel de 5 ou 10 nm na ferramenta PAL-render , bem como um modo de exibição gaussiana, com um factor de expansão de 1 PSF. Selecione processar auto gama dinâmica HR com um valor de 95% e Render auto escala dinâmica SWF com um valor de 90%. Selecione a melhor qualidade de Render.
- Selecione converter PALM, no menu de Palma da guia de processamento (modo de pós-processamento). Pressione selecionar e aplicar. Salve a imagem criada com um formato. LSM (e não .czi, muito importante).
Nota: A reconstrução da imagem pode ser realizada imediatamente após a aquisição ou posterior usando o modo de processamento de imagem de software a aquisição. Na linha fora de pós-processamento modo, é possível analisar novamente as pilhas com diferentes valores de parâmetros (tamanho da máscara de pico, pico de intensidade de ruído). Sempre optar por "descartar moléculas sobrepostas" e não "média antes de localização".
8. estimativa da precisão de localização de uma imagem de tempestade (10 min)
- Abra seus dados brutos de tempestade e uso o guia de processamento de imagem selecione o método de Palma e então Palma novamente. Pressione selecionar.
- Pressione aplicar para começar a reconstrução usando um tamanho de máscara de pico de 9 e o pico de intensidade de ruído de 6 (ou os parâmetros que você escolher para a imagem).
- Selecione a ferramenta gráfica do retângulo e desenhe um retângulo na imagem crua em torno de uma única molécula presente na superfície de vidro. Normalmente existem algumas moléculas simples lá.
- Pressione aplicar novamente e só as moléculas presentes no interior da região do retângulo serão analisados.
- A ferramenta de Estatísticas-PAL , selecione o tipo de trama: histograma e histograma fonte: X posição ou Y, para visualizar os histogramas de posição.
- Salve a tabela com a lista de localizações em seguida as imagens à esquerda.
- Usando um software de análise de dados, criar histogramas de X e Y posições (Figura 1).
- Encaixe as distribuições por um Gaussian e salvar o σX e σY valores. A precisão de localização σSMLM é estimado pelo (σX *σY) ^ 0.5.
- Repita a etapa 8.3-8,8 em moléculas como muitos como possível e média a σSMLM
9. canal registro (5 min)
- Abra a imagem de tempestade de cada cor, usando o software de Fiji (Image J).
- Selecione a ferramenta varinha para medir as posições de cada grânulos de tetraspeck.
- Calcular os deslocamentos X e Y para cada grânulo e média-los.
- Use o comando "Traduzir" para traduzir a segunda imagem com o calculado deslocamentos X e Y.
- Fundir as duas imagens usando o comando mesclar canais.
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Representative Results
Um microscópio equipado com 50 mW 405 nm e 100 mW, 488, 561 e 642 nm Solid-State lasers, um EMCCD câmera de 512 x 512, um alfa Apo plano 100 X / 1,46 objectivo e banda passam 570-650 / 655 emissões de filtros passam-tempo foi usado para os resultados representativos apresentados abaixo.
Figura 1A dá um exemplo de molécula densidade e sinal à relação de ruído que deve ser usada durante a aquisição de imagem raw. Imagens de boa qualidade são obtidas com um mínimo de ~ 1 µm entre moléculas vizinhas. Em boas condições pisca, fluorophores deve estar presente em apenas um quadro. Bom piscando requer para ajustar as condições da imagem latente do tampão (pH, agente redutor, sistema de eliminação de oxigênio) e poderes do laser, que influenciam a sobre e fora-as taxas do fluorophores e, portanto, o dever do ciclo (a fração de tempo que um fluoróforo passa no no estado)9,11. Figura 1B, pelo contrário, dá um exemplo de imagem raw, onde a densidade de molécula é muito alta e única molécula não pode ser resolvida.
A Figura 1 mostra um histograma típico de precisões de localização para todas as moléculas detectados e analisados pelo software do fabricante de uma pilha de 20 000 quadros. Este histograma corresponde à imagem dSTORM da rede microtubule mostrada na Figura 3B. Valores de precisões de localização fornecidas pelo software do fabricante estão em boa concordância com valores estimados seguir passo 8, usando a apontador precisão de uma única molécula localizada no tempo diferente pontos22 (Figura 1).
Figura 2A mostra um exemplo típico de imagem dSTORM de immunolabeled de filamentos de vimentina com Alexa647. O aumento da resolução pode ser claramente observado em comparação com a imagem adquirida com um microscópio de campo amplo padrão (Fig. 2B-C). Os perfis de intensidade de fluorescência representados na Figura 2D mostram que imagem de microscopia de super-resolução permite resolver vimentina bundles. A resolução de dSTORM é suficiente para contar o número de filamentos presentes nos pacotes.
A Figura 3 mostra um exemplo típico de imagem dual-cor dSTORM de immunolabeled de redes a vimentina e tubulina com Alexa647 e Alexa555 respectivamente. A sobreposição das duas redes mostra que os pacotes de vimentina, muitas vezes são localizados ao longo de microtúbulos, com chaves informações estruturais sobre o acoplamento entre os dois subsistemas do citoesqueleto.
A Figura 4 ilustra vários exemplos de imagens dSTORM de microtúbulos obtidos em condições não-ideais. Primeiro, usando o Alexa488 e um buffer com 143 mM beta-mercaptoetanol (outro agente redutor usado em vez de10,9,MEA11) e um sistema de eliminação de oxigênio (composto de 0,5 mg/mL glicose oxidase e 40 µ g/mL catalase), os fluorophores estavam piscando mas não fosse brilhantes o suficiente para ser precisamente localizadas (número de fótons muito baixo) (Figura 4A). Em segundo lugar, usando o Alexa555 com 143 mM beta-Mercaptoetanol, 50mm MEA e um sistema de eliminação de oxigênio, o fluorophores não poderia ser bombeado para seu estado escuro e, portanto, não ser bem espacialmente separados (ciclo de dever muito elevado, ou seja, a fração de tempo no estado "on" é muito longo) (Figura 4B). Finalmente, usando o Alexa568, com 143 mM beta-Mercaptoetanol, 50mm MEA e um sistema de eliminação de oxigênio, os fluorophores não eram brilhantes e estavam piscando lentamente com muito tempo "no" e "off" Estados (ciclo de trabalho muito alta e número de fótons de baixa) (Figura 4). Em todas essas condições não ideal, a rede de microtúbulos mal foi processada nas imagens de super-resolução. Em conclusão, óptimas condições requerem fluorophores com número de fotões de alta e baixa dever ciclo9,10 no buffer de imagem correspondente. Observe que otimizando densidade de rotulagem e condições de reserva para obter boas condições pisca de imagem é um procedimento padrão da duplo-cor dSTORM e não são específico para a imagem latente do microtubule-se.
De acordo com o teorema de Nyquist-Shannon, é necessário ter fluorophores pelo menos a cada 10 nm para ter uma resolução de 20 nm. Estendido para estruturas 2D, Dempsey et al estima-se que uma rotulagem de ~ 104 fluorophores por µm2 é necessário. Como a rede se é mais densa e seus filamentos são mais fino comparar (10 nm vs 25 nm de diâmetro sem os anticorpos primários e secundários) para a rede de microtúbulos, observamos que duas vezes mais localizações são necessárias para descrever a rede se. Conseguimos boas imagens com localizações/µm 5 0002 se e 2500 localizações/µm² por microtúbulos, obtidos com de 40 000 quadros e 20 000 quadros respectivamente. A imagem com a resolução mais alta foi obtida com uma precisão de localização de σSMLM ~ 8-12 nm estimado após etapa 8 do protocolo (22pontos de apontador precisão de uma única molécula localizada em horários diferentes). Esta estimativa da precisão de localização foi em boa concordância com os valores fornecidos pelo software do fabricante, mostrado em um histograma de precisões de localização extraídos de todas as moléculas detectadas em dados brutos (exemplo mostrado na Figura 1). Tal precisão de localização poderia fornecer uma imagem com uma resolução de ~ 30 nm (2,35 * precisão) se a densidade de rotulagem é alta o suficiente. Observamos rotineiramente filamentos de vimentina, com uma largura total no meio máximo (FWMH) de ~ 40 nm e microtúbulos com uma largura FWMH de ~ 55 nm. Uma vez que a resolução da imagem depende a precisão de localização e a densidade de localização, nós fornecemos condições experimentais que permitem os melhores resultados, tendo em conta os dois critérios.
Figura 1 : Densidade ideal de moléculas simples durante a aquisição e localização da estimativa de precisão.
(A-B) Esquerda: Imagens raw representativas de um único quadro, com uma densidade ideal de moléculas simples no estado brilhante (A) e com uma densidade muito alta (B) durante a aquisição de tempestade (etapa 6.12.) das células de U373 fixas manchado com antivimentina e antirato Alexa647. Direito: Imagens RAW onde as moléculas simples com nível de fluorescência acima o pico de intensidade de limiar de ruído (definido como 6) estão rodeadas por círculos (branco ou vermelho). O diâmetro do círculo é definido pelo tamanho da máscara pico (conjunto de 9 pixel) e a cor determina se as moléculas se sobrepõem (vermelho) ou não (branco). Observe essa alta densidade de moléculas simples (em B) levam a uma elevada quantidade de sobreposição de moléculas que não são tidos em conta para a reconstrução de imagem de tempestade. A Inset: gráfico mostrando um perfil de intensidade de fluorescência de uma única molécula de vermelho e seu gaussiano cabe em preto. Neste exemplo, a precisão da localização é σx = 6,7 nm. Barra de escala, 1 µm. (C) típico histograma de precisões de localização para todas as moléculas detectados e analisados pelo software do fabricante. Ele pode ser visualizado e é atualizado regularmente durante a aquisição dos dados brutos graças ao processamento on-line. Este histograma corresponde à imagem dSTORM da rede microtubule mostrada na Figura 3B. (D) Esquerda: Imagem de tempestade de uma única molécula apresenta na superfície de vidro após a reconstrução. Direito: Histogramas das posições X e Y, obtidas após a montagem Gaussian. Encaixe as distribuições de X e Y de Gaussian dar uma estimativa da precisão da localização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Representante dSTORM imagem de uma rede de vimentina. imagem de dSTORM (A), correspondente padrão campo amplo imagem (B) e (C) mostrando a borda de uma célula glial U373 fixo conforme descrito no protocolo e manchado para vimentina com Alexa647 de sobreposição. Fundo: zoom da região realçada. Perfis de intensidade transversal (D) ao longo da linha amarela nas imagens ampliadas na e B. escala bar, 2 µm e 500 nm no zoom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imagem de dSTORM cor dupla representativa das redes vimentina e microtúbulos. (A) rede de vimentina manchado com Alexa647 (mesmo como na Figura 2A). (B) rede de microtúbulos rotulado com Alexa555. (C) sobreposição da vimentina (vermelha) e redes de microtúbulos (ciano), com uma região de zoom no lado direito. A imagem dSTORM da vimentina foi obtida com ~1.5 milhões de localizações fora de 40 000 frames. A imagem dSTORM de microtúbulos foi obtida com localizações ~ 850 000 fora 20 000 frames. Escala da barra, 2 µm e 500 nm no zoom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Exemplos de condições de imagem não-ideal de microtúbulos. Quando os fluorophores piscar, mas não são brilhantes o suficiente com uma rotulagem de Alexa488 de tubulina em células gliais U373 e 143 mM BetaMercaptoethanol e ao tesouro de oxigênio no buffer de imagem (A), quando os fluorophores são brilhantes o suficiente, mas não pode ser adequadamente esgotado no estado escuro (na potência máxima do laser disponível) e piscar lentamente com Alexa555 rotulado tubulina em 143 mM BetaMercaptoethanol, 50mm MEA e oxigênio ao tesouro buffer (B) e quando fluorophores piscar lentamente e não são brilhantes usando Alexa568 rotulado de tubulina em um buffer de tempestade que contém 143 mM BetaMercaptoethanol, 50mm MEA e scavenger de oxigênio (C). Em todos estes casos, as imagens de dSTORM têm degradado a resolução. Escala da barra, 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Imagem representativa duplo-cor dSTORM de vimentina e microtubule redes de uma célula de U373 fixo com metanol a frio por 5 min. (A) vimentina e (B) redes de microtúbulos rotulado com Alexa647 e Alexa555 respectivamente com zooms realçados. Observe a presença de moléculas simples na frente das células localizadas no citoplasma diminuindo a resolução global das redes de filamentos. Escala da barra, 2 µm e 500 nm no zoom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Comparação de dSTORM reconstruída imagens
Imagem de dSTORM reconstruída pelo fabricante software (A) e tempestade (FiJi plugin) (B). (C) sobreposição de (A) em magenta e (B) em verde. Escala da barra, 2 µm e 500 nm no zoom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Passos críticos no protocolo
Apresentamos aqui um protocolo que minimiza artefatos nas imagens dSTORM de microtúbulos e IFs em células gliais. Artefatos podem ser criados em cada etapa da preparação da amostra e imagem latente: fixação, bloqueando, immunolabeling, deriva durante a aquisição, não ideal piscando condições23. Listamos abaixo os passos mais críticos.
As lamelas de limpeza é um passo importante para limitar a ligação não específica de fluorophores na superfície e, portanto, para limitar o ruído de fundo da imagem de dSTORM.
Sugerimos que a fixação da amostra com uma etapa de extração e fixação de soluções usando uma mistura de glutaraldeído e triton e, em seguida, fixação com PFA (paraformaldeído) (etapa n ° 3). O protocolo de fixação foi adaptado de Chazeau et al12: nós diminuiu o tempo de incubação de etapa de extração/fixação para 60 s (passo 3.4), remover a glicose do buffer do citoesqueleto e faltou o passo extra de permeabilização. A vantagem deste método é que as subunidades livremente movente do citoesqueleto são drenadas, permitindo que a imagem de super-resolução com menos fundo12. Mais genericamente, a etapa de fixação é crítica porque chumbo má fixação (usando o velho PFA, soluções de frias, etapas de incubação muito longo/curto) para destruição parcial das redes de filamentos (microtúbulos quebrados, microtúbulos que não atingem a frente de célula e/ou em um baixa densidade). Note que também é possível usar a fixação de metanol, especialmente se apenas a rede de vimentina é fotografada como descrito no Leduc et al.15. No entanto, o ruído de fundo pode ser observado dentro da célula (Figura 5). Embora dSTORM imagens obtidas com metanol fixada as células são de pior qualidade, ainda fornecem informações sobre o que ambos se e redes microtubule devem olhar como, por exemplo, em termos de densidade de filamentos. Fixação com apenas glutaraldeído deu resultados muito pobres para IFs, embora seja o melhor protocolo para fixação de microtubule23.
Na parte de imunocoloração, é importante o uso de anticorpos antirato que minimizar cross-reaction com anticorpos desenvolvidos no rato. Não precisamos de fragmentos Fab (anti-rato) por esta razão, porque o BHCG não especificamente com a antirato tubulina além de rato antivimentina.
Devido ao poder do laser limitada disponível, é necessário usar linhas de laser 488 e 561 nm para bombear os corantes Alexa555 para o estado escuro. Alto poder de 488 do laser (~ 50%) é igualmente necessário durante a aquisição para observar boa piscando e ciclo de trabalho de baixa (a fração de tempo de um fluoróforo gasta no estado), embora o ruído de fundo também aumenta. O modo de iluminação TIRF limita a excitação de fluorophores em uma camada fina (~ 200 nm acima a lamela de vidro). Isso aumenta a relação sinal-ruído, diminuindo a luz de fundo, mas também diminui o poder de excitação. O modo de HILO permite corte axial e pode ser eficiente para otimizar a relação sinal-ruído. É, portanto, um bom intermediário entre epi e TIRF. Usando o modo de HILO é essencial para excitar eficientemente o fluorophores Alexa555, que exigem do laser de alta potência a piscar adequadamente.
Outro passo crítico é a aquisição de dados brutos (etapa 6). É necessário ajustar os parâmetros de aquisição (exposição, ganho, TIRF e foco mesmo quando nenhum dispositivo de bloqueio de foco está disponível) enquanto o filme é adquirido. Manter uma densidade ideal de fluorophores brilhante é importante (figura 1A): deve ser suficientemente baixo para separar espacialmente cada tintura, mas alto o suficiente para visualizar toda a estrutura depois de 40 000 frames. Se o número de moléculas ativados for insuficiente, devem ser adquiridas mais pilhas. Conseguimos obter boas imagens com ~ 5000 localizações por µm² para IFs e 2 500 suas localizações por cm ² por microtúbulos.
Modificações e solução de problemas do método
É importante trabalhar com amostras frescas e otimizado de buffers de imagem. pH deve ser ajustado precisamente, especialmente para a MEA.
Vimentina e microtúbulos devem ser uniformemente rotulados quando imaginada com a técnica de microscopia de campo amplo padrão (WF). Se filamentos olhem pontuado/tracejada com microscopia clássica, isso vai ser amplificado quando usando super resolução. Neste caso, é melhor para preparar novas amostras. Condições de fixação não-otimizado (antigo PFA etc) podem resultar em microtúbulos olhar fragmentado. Fundo elevado na superfície do vidro pode surgir de um bloqueio ineficiente. Nesse caso, BSA (albumina de soro bovino) pode ser substituído por FBS (soro fetal bovino) e usado em cada etapas de incubação.
Se a densidade de rotulagem é muito alta (figura 1B) e não pode ser suficientemente empurrado no escuro fora-estado, mesmo com a maior potência do laser, a quantidade de secundário anticorpos devem ser diminuídos (melhor diminuindo a quantidade de anticorpos primários). No entanto, isto requer a preparação de novas amostras. Em geral, é necessário avaliar empiricamente a quantidade de anticorpos secundários para usar.
Se o fluorophores não piscar normalmente (devem ser no estado brilhante durante apenas um quadro), verifique se o pH do buffer de imagem está correta (pH 8.3). Prepare novas soluções se o problema persistir (especialmente MEA). Verifique sempre o colimador TIRF em (TIRF u_HP). Com o poder limitado do laser, obter piscando adequada pode ser desafiador (no e tarifas, bem como o brilho da tintura dependem de potência do laser, conforme descrito na van de Linde et al11). Outros corantes, como Alexa488 ou Atto488 podem ser exploradas se mais poder do laser da excitação é disponível14.
Se o fluorophores parar de piscar antes do fim dos quadros de 40 000, altere o buffer de imagem que pode ter sido oxidado. Verificar que não há nenhuma bolha de ar entre a tampa e a reserva após a alteração de reserva. As amostras seladas poderiam ser fotografadas por algumas horas em uma matéria-prima.
Se filmes de tempestade são adquiridos em um microscópio TIRF regular, equipado com um EMCCD, é possível usar ThunderSTORM24 para reconstruir as imagens. Opções similares estão disponíveis para a correção de deriva, filtragem de imagem e processamento de imagem. Tempestade é um plugin usado com o software de Fiji/imageJ. Resultados semelhantes foram obtidos com o software do fabricante e a trovoada (Figura 6).
BERÇO (ciclooctatetraeno) pode ser adicionado para o buffer de imagem para melhorar a precisão de localização de moléculas simples. Aumenta o número de fótons emitidos por ciclo para Alexa64725. Uma melhor precisão de localização de fato foi observado (até 6 nm) quando adicionar 2mm berço para o buffer de tempestade descrito no passo 5 ou com 100mm MEA, conforme descrito na referência25. No entanto, nestas condições, diminui o número de moléculas brilhantes durante a aquisição muito mais rápido do que sem berço, limitando o número total de localizações de molécula no final da aquisição e potencialmente levando a amostragem insuficiente da rede se. Outros buffers de imagem foram relatados para trabalhar bem com corantes de Alexa, usando por exemplo lactase e oxyrase como oxigênio eliminação sistema26. Neste protocolo, relatamos a composição do tampão que deu os melhores resultados em termos de resolução para o nosso tipo de amostras e de imagem, configurar, mas cada tipo de amostra requer otimização de amortecedor, além de rotulagem e otimização de condições de fixação.
Limitações do método e possíveis melhorias
O método apresentado aqui é limitado para células fixas e imagens 2D. Usando um padrão conjunto de imagem acima com um microscópio TIRF e um EMCCD, o fator mais limitante foi o poder do laser (100 mW para o laser nm 561 não foi suficiente para fazer as tinturas de Alexa555 a piscar). Uma linha de 532 nm laser pode ser mais eficiente para excitar Estas tinturas. Uma possível melhoria do método seria executar dSTORM 3D usando o astigmatismo óptico27. Isso exigiria modificações mínimas do protocolo, com exceção de uma menor densidade de rotulagem e um número de quadro de aumento. 3D cor dupla imagem de tempestade proporcionaria uma melhor visualização das IFs acondicionada em torno de microtúbulos, especialmente nos pacotes. Observe que filamentos de actina também podem ser observados usando o mesmo método de fixação e uma quantidade otimizada de fluorescente faloidina8. 3 cor tempestade poderia ser usado para observar a organização dos três subsistemas do citoesqueleto.
Usando anticorpos primários e secundários aumenta o tamanho do objeto de interesse, uma vez que o anticorpo secundário é localizado até 20 nm do destino. Normalmente, um microtubule de 25 nm de diâmetro terá uma largura de ~ 50 nm após a rotulagem. Uma possibilidade para melhorar a distância entre o alvo e a tintura é etiquetar diretamente os anticorpos primários com os corantes adequados. Idealmente, nanobodies rotulado com corantes orgânicos deve ser usado28.
Aqui oferecemos apenas um método simples para estimar a precisão de localização média de uma única molécula de Endesfelder et al22a seguir. A resolução total das imagens que leva em conta ambos precisão de localização e densidade, de rotulagem de pode também ser medida usando a abordagem de Fourier anel correlação29.
Sobre o registro de canal, é difícil sobrepor perfeitamente todos os grânulos presentes no campo de visão. Uma correção mais complexa pode ser encontrada no Chazeau et al. 12.
Limitações decorrentes da piscando de fluorophores e branqueamento das sondas podem ser superadas usando DNA-pintura (acúmulo de pontos de DNA para tratamento de imagens em escala nanométrica topografia)30. Neste método, o necessário para uma localização única molécula piscando é criado por ligação transitória dos oligonucleotides curto-tingir-etiquetados para seus destinos complementares.
Conclusão
Este artigo apresenta um protocolo robusto para executar o duplo-cor dSTORM imagem em 2 dimensões de filamentos do citoesqueleto nas células fixas. As condições experimentais que foram encontradas ideais em termos de fixação, immunolabeling e imagem latente de buffer para nosso tipo de amostra são descritas em detalhes. Então, o processo de aquisição de dados brutos e o tipo de imagens piscando que precisa ser gravado (densidade de molécula, sinal à relação de ruído, fluoróforo dever ciclo etc) é apresentado e também como reconstruir imagens dSTORM, corrigir os desvios e filtro de dados. Estas etapas são genéricas para a imagem latente de duplo-cor dSTORM e não tipo específico da amostra. Finalmente, é mostrado como esta técnica ajuda a resolver a densa organização das duas redes acopladas do citoesqueleto.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos Mickael Lelek, Orestis Faklaris e Nicolas Bourg para discussão proveitosa, Andrey Aristov e Elena Rensen para ajuda com a técnica de super-resolução e Shailaja Seetharaman para leitura cuidadosa do manuscrito. Reconhecemos, com gratidão, a Citech UtechS fotônico BioImaging (Imagopole) do Instituto Pasteur (Paris, França), bem como a rede de infra-estruturas de França-BioImaging suportados pela agência francesa de investigação nacional (ANR-10-INSB-04; Investimentos para o futuro) e a modernização de Région (programa Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) para o uso do microscópio Elyra. Este trabalho foi apoiado pela a Ligue Contre le Cancer e a agência francesa de investigação nacional (ANR-16-CE13-0019).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 41090-028 | cell culture |
| non essential amino acid | Gibco | 1140-050 | cell culture 1/100e |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | cell culture 1/100e |
| Fœtal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | cell culture 1/10e |
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cell culture |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | cell culture |
| coverslip 18 mm n°1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | coverslips |
| paraformaldehyde (PFA) solution | Sigma | F8775 | cell fixation |
| glutaraldehyde | Sigma | G5882 | cell fixation |
| triton X100 | Sigma | T9284 | non ionic surfactant. Used for cell fixation |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | cell fixation |
| BSA | Sigma | A7906 | sample passivation 3% in PBS |
| Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse | Sigma | V6630 | primary antibodies |
| Rat anti alpha tubulin | Biorad | MCA77G | primary antibodies |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | secondary antibodies |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | secondary antibodies |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Fisher scientific | T7279 | fluorescent beads |
| Chamlide magnetic chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | for the blinking buffer |
| glucose oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G0543 | for the blinking buffer |
| glucose | sigma | for the blinking buffer | |
| catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | for the blinking buffer |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | for the blinking buffer |
| Wash-N-Dry coverslip rack | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | paraffin film |
| ultrasonic cleaner | Fisher scientific | 15-335-6 | |
| plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 |
References
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