Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tenkelig intermediære filamenter og piskehale som henger med 2-dimensjonal direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi

Published: March 6, 2018 doi: 10.3791/57087
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, UMR 3691, CNRS, Institut Pasteur, 2UTechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech, Institut Pasteur

Summary

Det overordnede målet med denne metoden er å gi optimal eksperimentelle forhold fra prøven forberedelse til bildeopptak og gjenoppbygging for å utføre 2D to farger dSTORM bilder av piskehale som henger og intermediære filamenter i fast celler

Abstract

Cytoskjelett, består av utgangen microfilaments og piskehale som henger intermediære filamenter (hvis), spiller en nøkkelrolle i kontroll av cellen form, polaritet og motilitet. Organisasjonen av utgangen og microtubule nettverk har vært grundig studert, men som IFS er ikke ennå fullt preget. IFs har en gjennomsnittlig diameter på 10 nm og skjemaet et nettverk utvide hele cellen cytoplasma. De er fysisk knyttet til utgangen og piskehale som henger gjennom molekylær motorer og cellen cytoskjelett linkers. Denne stramt foreningen er i hjertet av regulatoriske mekanismer som sikrer koordinert regulering av de tre cellen cytoskjelett nettverkene kreves for de fleste celle-funksjoner. Det er derfor avgjørende å visualisere IFs alene og sammen med hvert andre cellen cytoskjelett nettverk. Men hvis nettverk er svært tett i de fleste celletyper, spesielt i gliacellene, som gjør det svært vanskelig å oppnå med standard fluorescens mikroskopi oppløsningen (lateral oppløsning ~ 250 nm). Direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (dSTORM) er en teknikk som gir en gevinst i laterale oppløsning på en størrelsesorden. Her viser vi at lateral dSTORM oppløsning er nok til å løse tett organisasjonen hvis nettverk, og spesielt av hvis bunter rundt piskehale som henger. Slik stramt forening er sannsynlig å delta i koordinert regulering av disse to nettverk og kan forklare hvordan vimentin IFs mal og stabilisere microtubule organisasjon som kan påvirke microtubule avhengige vesicula menneskehandel. Mer generelt, viser vi hvordan observasjon av to cellen cytoskjelett komponenter med to-farge dSTORM teknikken gir ny innsikt i deres gjensidig samspill.

Introduction

Cytoplasmatiske intermediære filamenter (IFs) er 10 nm-diameter homo- eller heteropolymers til en celle type bestemt undergruppe av IF proteiner. IFs delta i en rekke cellular funksjonene som cellen motilitet, spredning og stress svar. Sin nøkkelrolle er markert ved at mer enn 90 menneskelige sykdommer er direkte forårsaket av mutasjoner i hvis proteiner; for eksempel endringer i hvis sammensetning følger tumor vekst og spre1,2,3. Det er økende bevis for at tre cytoskjelett systemene fungerer i samarbeid å kontroll cellular funksjonene som cellen polarisasjon, divisjon og migrasjon2,3. Siden det er en tett kopling mellom romlige arkitektur og funksjoner, er det avgjørende å få innsikt i strukturelle organiseringen av hvis med andre filamenter og bedre forstå den cellen cytoskjelett kryss-snakk. Denne artikkelen inneholder en protokoll for å utføre den super-oppløsning teknikk dobbelt-farge dSTORM (direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi)4 og hvordan den brukes til å undersøke samspillet mellom om og piskehale som henger i fast, kultivert cellene i 2 størrelse (2D).

Flere super-oppløsning teknikker har blitt utviklet over siste tiår, og funnene var på opprinnelsen til Nobelprisen i kjemi i 20145. Blant alle disse teknikker ligger ett molekyl lokalisering-baserte metoder som PALM6 (Photo-Activated lokalisering mikroskopi) som bruker photoswitchable fluorescerende proteiner, STORM7 med par fluorophores eller dSTORM4 med konvensjonelle fluorophores. Alle disse metodene er basert på samme prinsipp som består av (i) de fleste av fluorescerende journalistene bryteren i en "off" tilstand"(ikke-lysrør), (ii) Stokastisk aktivering av et delsett av dem i en fluorescerende staten for å lokalisere deres romlig posisjon med nanometer nøyaktighet og (iii) repetisjon av denne prosessen for å aktivere så mange delsett av fluorophores som mulig. Et siste bilde er rekonstruert med alle steder av aktivert molekyler, gir en lateral oppløsning ned ~ 20-40 nm. Flere kommersialiserte optiske systemer slik at PALM/STORM er nå tilgjengelig for biologer for rutinemessig eksperimenter. Her ble et slikt system brukt til å studere strukturelle association of piskehale som henger og IFs. Blant alle de single-molekyl lokalisering-baserte metodene, to-farge dSTORM teknikken ble valgt, fordi det er godt egnet til å observere veldig tynn lamellær regioner (< 1 µm) tilhenger celler og kan gi betydelig forbedring av bildeoppløsning med minimal tid og penger investering. DSTORM er faktisk en veldig praktisk og allsidig teknikk som er kompatibel med standard organisk fargestoffer rutinemessig brukes for mobilnettet flekk og immunofluorescence.

Mens én farge dSTORM bildene er relativt enkelt å få bruke fluorophore Alexa6478, krever to farger dSTORM for å optimalisere eksperimentelle forhold slik at to fargestoffer kan blinke riktig i valgte buffer, spesielt når det er begrenset laser makt. Utmerket papir er allerede tilgjengelig på metoder for å sette opp multi-farge bildebehandling med dSTORM,9,,10,,11,,12,,13og disse papirene forklare i detalj de mulige feilkildene for gjenstander og degradert bildeoppløsning og hvor å overvinne dem. I denne artikkelen, optimal eksperimentelle forhold celler fiksering, immunostai-, prøve forberedelse er tenkelig oppkjøp og bildet gjenoppbygging beskrevet for å skaffe bilder av tett cytoplasmatiske hvis nettverk og piskehale som henger i gliacellene med to farger dSTORM. Kort, utvinning/fiksering metoden beskrevet i Chazeau et al12 ble tilpasset gliacellene og brukes med litt etter fiksering, optimalisert antistoffer konsentrasjon, en STORM buffer med 10 mM MEA beskrevet i Dempsey9 et al. som var funnet for å være optimalt for eksperimentelle oppsett og utvalg.

Gliacellene uttrykke hovedsakelig tre typer hvis proteiner: vimentin, nestin og GFAP (glial sur fibrillary protein). Disse tre proteiner ble vist å co danner i astrocyttene14. Vi viste tidligere bruker super-oppløsning strukturert belysning mikroskopi (SR SIM) at disse tre hvis proteinene kan bli funnet i den samme enkelt hvis filament og at de viser lignende distribusjon og dynamikk i gliacellene 15. På grunn av likheter mellom tre hvis proteiner, ble vimentin flekker brukt som reporter for hele hvis nettverket. Bruker dSTORM, klarte vi å løse hvordan hvis skjemaet bunter langs piskehale som henger, som ikke var mulig med Diffraksjon begrenset mikroskopi teknikker15. Disse observasjonene kan bidra til å forstå hvordan vimentin IFs kan malen piskehale som henger og regulere deres vekst bane, fremme vedlikehold av en polaritet akse under celle migrasjon16. Super-oppløsning gitt nøkkelinformasjon på gjensidig samspillet av de to cellen cytoskjelett delsystemene og brakt innsikt i koblingen mellom romlige association og lokale funksjon som kunne celle-type bestemt17. Generelt, kan to-farge dSTORM brukes til å studere crosstalk mellom cellen cytoskjelett elementer eller andre typer organeller, forutsatt at god immunostai-forhold er nådd tetthet og spesifisitet. Denne teknikken vil være nyttig å bedre karakterisere cytoskjelett endringer observert under astrogliosis og i glioblastom, den vanligste og mest ondartet svulsten i sentralnervesystemet, der uttrykket hvis proteiner er endret 18 ,19,20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coverslips forberedelse (dag 1, 30 min)

  1. Legg 18 mm nº1.5H (170 µm +/-5µm) glass coverslips på en plast rack.
  2. Sette brettet i et 100-mL beaker fylt med aceton og nyte 5 min.
  3. Overføre stativet til et 100-mL beaker fylt med absolutt etanol og nyte 5 min.
  4. Overføre stativet til en ny 100 mL kanne fylt med absolutt etanol og plassere begeret i en ultrasonisk renere enhet (se tabell av materialer) i romtemperatur. Trykk "på" og vent 10 min.
  5. Sett stativet under laminær strømning hette og la coverslips tørr eller tørr coverslips med filtrerte luftstrøm.
  6. Sette brettet med coverslips i en plasma renere enhet. Slå på vakuumpumpe, lukke døren, vente på 3 minutter å gjøre vakuum og slå på plasma i 1 bruk av coverslips etter rengjøring. Ikke Oppbevar dem.

2. celle plating (dag 1, 20 min)

  1. Vokse glial celle linjen U373 i Minimum viktig Medium (MEM) med 10% fosterets Bovine Serum, 1% Penicillin-Streptomycin og 1% ikke-essensielle aminosyren i 10 cm diameter plast Petriskål.
  2. Plasser rent glass coverslips i 12-vel plater under laminær strømning panseret og legge 1 mL av forvarmet celle medium per brønn.
  3. Ta en rett som inneholder celler fra cellen inkubator (37 ° C, 5% CO2).
  4. Fjern mediet og tilsett 10 mL PBS.
  5. Fjern PBS og tilsett 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA.
  6. Plass rett tilbake i inkubator for 2-3 minutter.
  7. Tilsett 10 mL av varm medium forvarmet til 37 ° C på fatet og resuspend celler.
  8. Frø om lag 100 000 celler per brønn (~ 150 µL av celler) i 12-vel platene som inneholder coverslips.
  9. Vent minst 6 h (eller overnatting) å tillate celle spredning.

3. celle fiksering (dag 2, 2h)

  1. Forberede cytoskjelett buffer med 80 mM rør, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, og justere pH til 6,9.
  2. Vask cellene gang med PBS.
  3. Fjerne PBS og forsiktig legge 1 mL per brønn utvinning/fiksering løsning (0,25% glutaraldehyde, 0,3% Triton X-100 i cytoskeleton buffer) forvarmet på 37 ° C.
  4. Inkuber for 60 s ved romtemperatur.
  5. Fjern løsningen og forsiktig legge 1 mL per brønn forvarmet og ferskt tilberedte 4% PFA (paraformaldehyde) løsning fortynnet i cytoskeleton bufferen.
    Forsiktig: Bruk hansker og arbeide under kjemiske panseret.
  6. Plass platen 12-vel tilbake i inkubator på 37° C i 10 min.
  7. Fjern PFA og legge 3 mL PBS per brønn.
    Merk: Arbeid under kjemiske panseret med hansker og sette resirkulert PFA i en bestemt hylle.
  8. Vask to ganger med PBS.
  9. Fjern PBS og legge ferskt tilberedte 10 mM NaBH4 løsning fortynnet i PBS for å slukke autofluorescence kommer fra glutaraldehyde.
  10. Inkuber i 7 min ved romtemperatur.
  11. Sette resirkulert NaBH4 i en bestemt hylle.
  12. Vask tre ganger 5 min med PBS.
  13. Fjern PBS og legge blokkerer løsningen (5% BSA løsning i PBS).
  14. Inkuber 1t ved romtemperatur (eller overnatter 4 ° C).
    Merk: Cytoskeleton bufferen kan lagres ved romtemperatur for et par måneder. PFA, NaBH4 og glutaraldehyde skal behandles med forsiktighet (hette, hansker og spesielle gjenvinning). Løsninger bør være lagt til og fjernet forsiktig for å opprettholde dataintegriteten cellene. Det er viktig å ikke la cellene tørr.

4. Immunostaining (dag 2, 5h)

  1. Forberede løsning av primære antistoffer med anti-vimentin og anti-tubulin med en 1:500 fortynning av blokkering løsningen.
  2. Putte 100 µL dråper utvannet primære antistoffer på en parafin filmen lag og sted coverslips oppå cellene vender nedover.
  3. Inkuber celler med primære antistoffer for 2 h. sett coverslips tilbake i en 12-vel plate fylt med PBS. Skyll tre ganger i 5 min hver gang på PBS ved romtemperatur på en orbital shaker.
  4. I mellomtiden Forbered den sekundære antistoffer løsningen å bruke anti-mus Alexa647 og anti-rotte Alexa555 på en fortynning av en 1:1, 000 i blokkering løsningen. Inkuber celler med sekundær antistoffer 1t ved romtemperatur. Fortsette som 4.2. beskytte cellene fra lys.
  5. Sett dekkglassvæske tilbake i en 12-vel plate fylt med PBS. Skyll tre ganger i 5 min hver gang på PBS ved romtemperatur på en orbital shaker. Fjern PBS og legge 0,5 mL PBS blandet med 1 µL av 0,1 µm tetraspeck perler.
  6. Sette brønnene på en orbital shaker i 30 min. skyll med PBS. Fjern PBS og ruge celler for 5 min med en 4% PFA løsning i PBS. Skyll tre ganger i PBS.
    Merk: Fast celler kan lagres i et par uker i PBS på 4° C. Immunostaining bør gjøres i siste minutt.

5. eksempel forberedelse (dag 3, 5 min)

  1. Legge dele MEA (cysteamine, 1 M, pH 8.3), gluko (100 x, 50 mg/mL), catalase (500 x, 20 mg/mL) i en isen kurv.
  2. Forberede 50 mL av Tris-NaCl buffer (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) med 10% av glukose (100 mg/mL).
  3. Forberede 1,2 mL Imaging buffer like før bildebehandling med 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) gluko, 40 µg/mL catalase (80-200 U/mL) i Tris-NaCl bufferen med 10% glukose.
  4. Montere dekkglassvæske som inneholder de merkede cellene på magnetiske eksempel holderen (f.eks chamlide kammer) og legge tenkelig bufferen for å fylle helt kammeret. Sett lokket og kontroller at det er ingen luftboble mellom tenkelig bufferen og lokket.
  5. Rengjør undersiden av prøven med absolutt etanol og kontroller at det ikke er lekkasje. Bruk fett for å forsegle sample innehaveren skal om nødvendig.
    Merk: Forberede 1 M lager av MEA løsning (pH 8.3 justert bruker HCl), lager av gluko på 50 mg/mL og lager av catalase på 20 mg/mL i vann, gjør dele og lagre dem på 20 ° C i opptil en måned for MEA og et år for gluko og catalase. Ikke refreeze dele. Forberede Tris-NaCl bufferen på forhånd og lagre den i romtemperatur i flere måneder. Legge til glukose på dagen for eksperimentet (trinn 5.3).

6. image vinningen (dag 3 ~ 1h per celle)

  1. Slå på mikroskopet. Slå på programmet oppkjøp og trykk Start systemet.
  2. Velg oppkjøpet kategorien Vis verktøyet Imaging oppsett i gruppen Installasjonsbehandling verktøyet. Velg den laser WF (bredt felt) oppkjøpet. Velg 100 X NA 1,46 målsettingen. TIRF u-HP modus som bruker en collimator for å redusere synsvinkelen blir opplyst og konsentrere på laseren energi til et mindre område. Bruk det optovar linsen 1.6 x som gir en pikselstørrelse på 100nm.
  3. Velg verktøyet tidsserier og Definer tidsforløp med 50 000 rammer og 0.0 ms mellom rammer. Utvid verktøyet kanaler i gruppen oppkjøpet parameteren verktøyet og velg "Vis alle".
  4. Angi Alexa647 sporet: Sjekk 642 og 405 laser linjer for eksitasjon godta for å slå dem. Velg "655 LP" utslipp filteret i Imaging oppsett. Endre "647".
  5. Klikk på '+' i verktøyet kanaler legge en annen lett pass og velg modus "bytte spor hver: ramme" i verktøyet Imaging oppsett . Sjekk 561, 488 og 405 laser linjer og godta for å slå dem. Velg den "BP 570-650 + LP750" utslipp filtrere og bruke optovar linsen 1.6 x. Kontroller at TIRF-uHP-modus er valgt. Endre banen "555".
  6. Velg verktøyet vinningen måte og sette bildestørrelsen til 200 x 200 piksler. Velg verktøyet fokus enheter og strategi og angi klart fokus på lag 1 000 rammer (hvis det er et fokus-lock systemet).
  7. Sette olje på målet og oppføre prøven. Velg kategorien Søk , og åpne skodde lyselementet fluorescens. Finn fokus og se etter cellen til bilde ved hjelp av okularet. Legg den i midten av synsfeltet bruk joysticken.
  8. Velg kategorien oppkjøpet å gå tilbake til kjøp. Velg "647" sporet, sette 642-laser makt 0,2%, sette 405-laser makt til 0, angitt eksponeringstid til 50 ms og gevinst på 50. Velg Fortløpende vinningen måte å observere cellen på skjermen. Justere fokus. Kontroller at det er minst en tetraspeck perle i synsfelt, øker kontrasten å se dem om nødvendig. Bruk en Autoskaler modus for visning. Ta en bred-feltet epifluorescence bilde av vimentin nettverket ved å klikke på Fest , og lagre den. For å sjekke TIRF belysning, klikk på TIRF, justere vinkelen på belysning og/eller collimator hvis det er nødvendig å ha en homogen felt av belysning og lagre den.
    Merk: Det er viktig at TIRF og epifluorescent bildene er av høy kvalitet før du starter rådata oppkjøpet. Usammenhengende, ikke-enhetlig merket filamenter vil gi opphav til dårlig kvalitet dSTORM bilder.
  9. Uncheck "647" sporet og velg og sjekk "555" sporet. Ta en epifluorescence bilde av microtubule nettverk, og lagre den. Ta en TIRF bilde og lagre den for.
  10. Uncheck "555" sporet, Velg og sjekk "647" sporet, og trykk deretter Fortløpende. Sett gevinsten til 0 og eksponeringstid til 10 ms. sette 642-nm laser makt til 100% for å pumpe mesteparten av Alexa647 fargestoffer mørke tilstanden (~ 2 kW/cm2). Når fluorophores begynner å blinke, sette eksponering 15 ms, og få til 300. Velg den TIRF belysning. Brukes området indikator uten Autoskaler bekrefte at ett molekyl signaler ikke mette kameraet (angitt av den røde fargen). I så fall redusere gevinsten til metning forsvinner. Tetraspeck perler blir mettet i begynnelsen av oppkjøpet. Trykk Stop stoppe kontinuerlig observasjon av cellen.
  11. Utvid verktøyet Online behandling og sjekk Online behandling PALM å visualisere STORM bildet under oppkjøpet. Bruk følgende parametere: 9 for topp maske størrelse (9 piksler diameter) og 6 for Peak intensiteten til lyden. Disse parameterne definerer molekyler som er tatt hensyn til i behandling (lyse nok og ikke overlappende). Velg handlingen i verktøyet PAL-statistikk : histogramog histogrammet kilde: presisjon. Trykk Start oppkjøpet.
  12. Refokusere om nødvendig (Hvis ingen fokus-lock enheter er) under oppkjøpet. Justere parametere (eksponering, laser makt) og til slutt slå på 405-nm laser linjen (begynner ved 0,001%) å holde en middels tetthet av fluorophores med en minimumsavstand på 1 µm mellom enkelt molekyler (> 9 piksler 100 nm, topp maske størrelse) ( Figur 1A-B). Hvis molekyl tetthet er litt for høy, bruke HILO (svært lyst og laminert optisk ark) modus for belysning i stedet for TIRF. Dette vil øke laser makt med 20%. Kontroller at toppen av lokalisering presisjon i histogrammet under rekonstruert bildet er sentrert rundt eller under 10 nm.
    Merk: Vanligvis reduserer antallet molekyler med tid og 405-nm laser makt er økt sakte tilsvarende. Målet er å redusere lokalisering presisjon (histogram vises under Super-oppløsning bildet) så mye som mulig med en topp under 10 nm (figur 1 c). Øke kontrasten i PALM bildet om nødvendig hvis for mange lyse perler finnes i feltet.
  13. Trykk Stopp å stoppe filmen når mer enn 106 steder er nådd (vanligvis etter 40 000 rammer). Sette lasere tilbake til 0,2% (642 nm) og 0 (405 nm). Lagre rådata om STORM oppkjøpet med .czi format. Fjern spor "647" i verktøyet kanaler og velge og sjekk sporet "555".
  14. Angi eksponeringstid til 25 ms og få til 0. Trykk på kontinuerlig og angi både 488 og 561 lasere 100% pumpe Alexa555 fargestoffer mørke tilstanden (~ 2 kW/cm2 hver). Når fluorophores begynner å blinke, legge gevinsten til 250, bruke HILO lys modus og kontroller at enkelt molekyler ikke Metter kameraet med området indikator modus. Hvis det er tilfelle, redusere gevinsten. Trykk Stopp. Redusere 488-laser makt til 50%.
  15. Trykk Start oppkjøpet. Under oppkjøpet, øke gradvis forsterkningen å alltid være på grensen av metning. Øke trinnvis 405-nm laser makt til å holde en middels tetthet av ett molekyl i synsfeltet (se trinn 6.18). Redusere 488 laser makt til 20-30% når 405 laser er høyere enn 15%. Deretter Reduser gradvis 488 mens økende 405 laser linjen for å holde blinkingen av molekyler så fort som mulig. 488 laser linjen kombinert med 561 excitation laser med maksimal intensitet øker både på og av av fluorophores, mens 405 laser linjen bare øker på hastigheten.
  16. Stopp oppkjøpet når mer enn 500 000 steder er nådd (etter om lag 20 000 bilder) eller mer når ingen flere molekyler blinker. Lagre rådata om STORM oppkjøpet med .czi format.
    Merk: Alltid starte med høyere bølgelengden å unngå bleking (eller aktivisering) av andre farger. Siden chamlide kammeret ikke er lukket, er det mulig å endre tenkelig bufferen regelmessig, f.eks å teste ulike buffer forhold. Bruke 488 laser linjen til deplete Alexa 555 fargestoffer er nødvendig når 561 laser makt er begrenset (med 100 mW lasere).

7. bildet gjenoppbygging (5 min)

  1. Bruk modellbasert korreksjon typen med automatisk segmenter med en maksimal størrelse på 8 i verktøyet PAL-Drift . Trykk Bruk flere ganger på rad før drift er rettet. Tekstendring modellbasert bruker en algoritme basert på tvers-korrelasjon analyse som korrigerer drift.
  2. Bruker PAL-Filter forbedre verktøy, utseendet av STORM bildet ved å velge bare molekylene som ble best lokalisert. For eksempel begrense lokalisering presisjon til 30 nm og PSF til 120-180 nm.
  3. Bruk en pixel oppløsning på 5 eller 10 nm i verktøyet PAL-render , samt en Gaussian visningsmodus, med en utvidelse faktoren av 1 PSF. Velg gjengi auto dynamisk område t med en 95% verdi og Render auto dynamisk område SWF med en 90% verdi. Velg Render beste kvalitet.
  4. Velg PALM konvertere, i PALM -menyen i kategorien behandler (etterbehandling modus). Trykk Velg og deretter bruke. Lagre opprettet bildet med et format. LSM (og ikke .czi, veldig viktig).
    Merk: Bildet gjenoppbygging kan utføres umiddelbart etter kjøp eller senere ved hjelp av image bearbeiding modus av programvare oppkjøpet. I av linjen etterbehandling modus, er det mulig å analyser på nytt stabler med forskjellige verdier av parametre (topp maske størrelse, topp intensitet for støy). Alltid velge "kaste overlappende molekyler" og ikke "gjennomsnittlig før lokalisering".

8. estimering av lokalisering presisjon av en STORM bilde (10 min)

  1. Åpne STORM rå data og bruke bildebehandlingen kategorien Velg metoden PALM og deretter PALM igjen. Trykk på Velg.
  2. Trykk Bruk starte gjenoppbygging bruker en topp maske størrelse 9 og en topp intensiteten til lyden av 6 (eller parameterne du velger for bildet).
  3. Velg rektangelverktøyet grafikk og tegne et rektangel på rå bildet rundt en enkelt molekylet på glassplaten. Det er vanligvis noen enkelt molekyler det.
  4. Trykk Bruk igjen, og bare molekylene stede inne regionen rektangelet vil bli analysert.
  5. Velg handlingen i verktøyet PAL-statistikk : histogram og histogrammet kilde: X posisjon eller Y-posisjon, visualisere posisjon histogrammer.
  6. Lagre tabellen med listen over steder til venstre under bildene.
  7. Ved hjelp av en programvare for dataanalyse, lage histogrammer for X og Y posisjoner (figur 1 d).
  8. Tilpasse distribusjonen av en Gaussian og lagre σX og σY -verdier. Lokalisering presisjon σSMLM anslås ved (σX *σY) ^ 0,5.
  9. Gjenta trinn 8.3-8,8 på så mange molekyler som mulig og gjennomsnittlig σSMLM

9. kanal-registrering (5 min)

  1. Åpne STORM bildet av hver farge ved hjelp av Fiji (bilde J) programvare.
  2. Velg verktøyet tryllestaven til å måle plasseringen av hver tetraspeck perler.
  3. Beregner X og Y Skift for hver perle og gjennomsnitt dem.
  4. Bruk kommandoen "Oversette" oversette det andre bildet med beregnet X og Y SKIFT.
  5. Flette de to bildene ved hjelp av kommandoen Slå sammen kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikroskop utstyrt med 50 mW 405 nm og 100 mW 488, 561 og 642 nm SSD lasere, en EMCCD 512 x 512 kamera, en alfa planlegger Apo 100 X / 1.46 mål og Band Pass 570-650 / lang passere 655 utslipp filtre gjelder representant resultatene nedenfor.

Figur 1A gir et eksempel molekyl tetthet og signal til støyforhold som skal brukes under raw-bilde oppkjøpet. Bilder med god kvalitet er oppnådd med et minimum av ~ 1 µm mellom nærliggende molekyler. I god blinkende forhold, må fluorophores finnes i én ramme. God blinker krever justere tenkelig buffer betingelsene (pH, reductive agent, oksygen scavenging system) og laser krefter, som påvirker den på - og av-prisen i fluorophores, og derfor plikt syklus (brøkdel av tid en fluorophore bruker i på staten)9,11. Figur 1B, tvert imot, gir et eksempel av ømt punkt image der molekylet tetthet er for høy og ett molekyl ikke kan løses.

Figur 1 c viser et typisk histogram for lokalisering presiseringer for alle molekyler oppdaget og analyseres av produsenten fra en stabel med 20 000 rammer. Dette histogrammet tilsvarer dSTORM bildet av microtubule nettverket vises i figur 3B. Verdiene for lokalisering presiseringer levert av produsenten er i god avtale med verdier anslagsvis følgende trinn 8, bruker peker presisjonen til et enkel molekyl lokalisert på ulike tidspunkt poeng22 (figur 1 d).

Figur 2A viser et typisk eksempel på dSTORM bilde av vimentin filamenter immunolabeled med Alexa647. Økningen i oppløsning kan tydelig sees på sammenligning med bildet kjøpt med standard wide-field mikroskop (figur 2B-C). Fluorescens intensitet profilene i figur 2D viser at super-oppløsning mikroskopi bildebehandling kan løse vimentin pakker. DSTORM løsningen er tilstrekkelig til å telle antall filamenter i pakker.

Figur 3 viser et typisk eksempel på to-farge dSTORM bilde av den vimentin og tubulin nettverk immunolabeled med Alexa647 og Alexa555 henholdsvis. Overlappingen av to nettverk viser at vimentin pakker er ofte lokalisert langs piskehale som henger, gir strukturell informasjon om koblingen mellom de to cytoskjelett delsystemene.

Figur 4 illustrerer ulike eksempler på dSTORM bilder piskehale som henger innhentet i ikke-optimale forhold. Først med Alexa488 og en buffer med 143 mM beta-mercaptoethanol (en annen reductive agent i stedet for MEA9,10,11) og oksygen scavenging system (sammensatt av 0,5 mg/mL gluko og 40 µg/mL catalase), fluorophores var blinker men ikke var sterke nok til å være nettopp lokaliserte (lavt Foton tall) (figur 4A). Andre bruker Alexa555 med 143 mM beta-mercaptoethanol, 50 mM MEA og en oksygen scavenging system, fluorophores kunne ikke pumpes til mørk tilstand og derfor ikke godt romlig atskilt (for høy driftssyklus, dvs brøkdel av tid i "på"-tilstand er for lang) (figur 4B). Til slutt bruker Alexa568, med 143 mM beta-mercaptoethanol, 50 mM MEA og en oksygen scavenging system, fluorophores var ikke lyse og var blinker sakte med veldig lenge "på" og "off" tilstander (lav Foton nummer og for høy driftssyklus) (figur 4C). I alle disse ikke-optimale forhold, ble microtubule nettverket dårlig gjengitt i super-oppløsning bilder. Avslutningsvis optimale forhold krever fluorophores med høy Foton nummer og lav driftssyklus9,10 i tilsvarende tenkelig bufferen. Merk at optimalisere merking tetthet og imaging buffer forholdene gode blinkende forhold er en standard prosedyre for to-farge dSTORM og er ikke spesifikke for hvis-microtubule imaging.

Ifølge den Nyquist-Shannon teoremet, er det nødvendig å ha fluorophores minst hver 10 nm en oppløsning på 20 nm. Utvidet 2D strukturer, anslått Dempsey et al at en merking av ~ 104 fluorophores per µm2 er nødvendig. Hvis nettverket er tettere og dens filamenter er tynnere (10 nm vs 25 nm diameter uten primære og sekundære antistoffer) sammenlignet med microtubule nettverket, observerte vi at to ganger flere steder er nødvendig å beskrive hvis nettverket. Vi fikk god bilder med 5 000 lokaliseringer/µm2 for hvis og 2500 lokaliseringer/µm² for piskehale som henger, fikk 40 000 rammer og 20 000 rammer henholdsvis. Bildet med den høyeste oppløsningen ble oppnådd med en lokalisering presisjon av σSMLM ~ 8-12 nm beregnet etter trinn 8 av protokollen (peker presisjon av et eneste molekyl lokalisert på ulike tidspunkt poeng22). Dette anslaget lokalisering presisjon var bra avtale med verdiene fra produsenten programvaren i et histogram for lokalisering presiseringer utvunnet fra alle oppdaget molekylene i rådataene (eksemplet i figur 1 c). Slik lokalisering presisjon kunne gi et bilde med en oppløsning på ~ 30 nm (2,35 * presisjon) hvis merking tetthet er høy nok. Observerte vi rutinemessig vimentin glød med en Full bredde på halv maksimal (FWMH) av ~ 40-nm og piskehale som henger med en bredde FWMH ~ 55 nm. Siden bildeoppløsningen er avhengig av både lokalisering presisjon og lokalisering tetthet, tilbyr vi eksperimentelle forhold som gir best resultater tar hensyn til begge vilkårene.

Figure 1
Figur 1 : Optimal tetthet enkelt molekyler under oppkjøp og lokalisering presisjon forhåndsberegning.
(AB) Venstre: Representant raw-bilder fra et enkeltbilde med en optimal tetthet enkelt molekyler i lyse staten (A) og en for høy tetthet (B) under STORM oppkjøpet (trinn 6.12.) fast U373 celler beiset med anti-vimentin og anti-mus Alexa647. Høyre: RAW-bilder hvor enkelt molekyler med fluorescens nivå over toppen intensiteten støy terskelen (satt til 6) er omgitt av sirkler (hvit eller rød). Sirkel-diameter er satt av topp maske størrelsen (satt til 9 piksel) og fargen avgjør om molekylene overlapper (rød) eller ikke (hvit). Merk at høy tetthet av enkelt molekyler (i (B)) føre til en høy mengde overlappende molekyler som ikke er tatt hensyn til STORM bildet gjenoppbygging. A innfelt: diagram som viser en typisk fluorescens intensitet profil av et eneste molekyl i rødt og dens Gaussian passer i svart. I dette eksemplet lokalisering presisjonen er σx = 6,7 nm. Skala bar, 1 µm. (C) typisk histogram for lokalisering presiseringer for alle molekyler oppdaget og analysert av produsenten. Den kan visualiseres oppdateres regelmessig under oppkjøpet av rådata Takket være online behandling. Dette histogrammet tilsvarer dSTORM bildet av microtubule nettverket vises i figur 3B. (D) Venstre: STORM bilde av et eneste molekyl presenterer på glassplaten etter gjenoppbygging. Høyre: Histogrammer for X og Y stillingene innhentet etter Gaussian montering. Gaussian passende X- og Y-distribusjoner anslå lokalisering presisjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant dSTORM bilde av et vimentin nettverk. dSTORM bilde (A), tilsvarende standard wide-feltet bilde (B) og overlegg (C) viser forkanten av en U373 glial celle løst som beskrevet i protokollen og farget for vimentin med Alexa647. Bunnen: zoom av det uthevede området. (D) tverrgående intensitet profiler langs den gule streken på jevner ut bilder i A og B. skala bar, 2 µm og 500 nm i zoom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant to farger dSTORM bilde av vimentin og microtubule. (A) Vimentin nettverk farget med Alexa647 (samme som i figur 2A). (B) Microtubule nettverk merket med Alexa555. (C) overlegg vimentin (rød) og microtubule (cyan) nettverk med en zoom-regionen til høyre. DSTORM bildet av vimentin ble oppnådd med ~1.5 millioner av steder av 40 000 rammer. DSTORM bildet piskehale som henger ble oppnådd med ~ 850 000 steder av 20 000 rammer. Skala bar, 2 µm og 500 nm i zoom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Eksempler på ikke-optimale imaging forhold piskehale som henger. Når fluorophores blinker, men er ikke skarpe nok med en Alexa488 merking av tubulin i U373 gliacellene og 143 mM BetaMercaptoethanol og oksygen åtseldyr i tenkelig bufferen (A), når fluorophores er lys nok, men ikke riktig utarmet i mørke staten (på den maksimale laser makten tilgjengelig) og blinker langsomt med Alexa555 tubulin i 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA og oksygen åtseldyr buffer (B) og når fluorophores blinke sakte og er ikke lyse med Alexa568 merket tubulin i en storm buffer som inneholder 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA og oksygen åtseldyr (C). I alle disse tilfellene, har dSTORM bildene degradert oppløsning. Skala bar, 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Representant dual-farge dSTORM bilde av vimentin og microtubule nettverk av en U373 celle fast med kaldt metanol i 5 min. (A) Vimentin og (B) piskehale som henger nettverk merket med Alexa647 og Alexa555 henholdsvis med uthevet zoomer. Legg merke til tilstedeværelsen av enkelt molekyler på forsiden av cellene lokalisert i cytoplasma reduksjon av global oppløsning filament nettverk. Skala bar, 2 µm og 500 nm i zoom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Sammenligning av dSTORM rekonstruert bilder
Rekonstruert dSTORM bilde av produsenten programvare (A) og tordenvær (FiJi plugin) (B). (C) overlapping av (A) i magenta og (B) i grønt. Skala bar, 2 µm og 500 nm i zoom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Avgjørende skritt i protokollen

Vi presenterer her en protokoll som minimerer gjenstander i dSTORM bilder av piskehale som henger og IFs i gliacellene. Gjenstander kan opprettes i hvert trinn av prøven forberedelse og bildebehandling: fiksering, blokkering, immunolabeling, drift under oppkjøpet ingen-optimal blinkende forhold23. Vi liste under de viktigste trinnene.

Rengjøring av coverslips er et viktig skritt å begrense uspesifisert binding av fluorophores på overflaten og derfor begrense bakgrunnsstøyen i dSTORM bildet.

Vi foreslår feste prøven med et trinn utvinning og fiksering løsninger med en blanding av glutaraldehyde og triton, og deretter fiksering PFA (paraformaldehyde) (trinn n ° 3). Fiksering protokollen ble tilpasset fra Chazeau et al12: vi redusert utvinning/fiksering trinn inkubasjon tiden til 60 s (trinn 3.4), fjerne glukose fra cytoskjelett bufferen, og hoppet det ekstra-trinnet i permeabilization. Fordelen med denne metoden er at de fritt bevegelige cellen cytoskjelett underenheter er drenert bort, slik at super-oppløsning bildebehandling med mindre bakgrunnen12. Mer generelt fiksering trinnet er avgjørende fordi dårlig fiksering (med gamle PFA, kaldt løsninger, for lange/korte inkubasjon trinn) føre til delvis ødeleggelse av filament nettverk (brutt piskehale som henger, piskehale som henger som ikke når cellen foran og/eller i en lav tetthet). Merk at det også er mulig å bruke metanol fiksering, spesielt hvis bare vimentin nettverket er avbildet som beskrevet i Leduc et al15. Imidlertid kan bakgrunnsstøy observeres i cellen (figur 5). Selv om dSTORM bildene oppnådd med metanol fast cellene er av dårligere kvalitet, de fortsatt gi informasjon om hva både hvis og microtubule nettverk skal se ut f.eks inne frist av filament tetthet. Fiksering med bare glutaraldehyde ga veldig dårlige resultater for IFs, selv om det er den beste protokollen for microtubule fiksering23.

I den immunostai-delen er det viktig å bruke anti-muse-antistoffer som minimerer kryssreaksjon med antistoffer utviklet i rotte. Vi kan ikke bruke Fab fragmenter (anti-mus) derfor fordi de cross-react nonspecifically med rotte anti-tubulin i tillegg til musa anti-vimentin.

Fordi begrenset laser makt tilgjengelig er det nødvendig å bruke både 488 og 561 nm laser linjer for å pumpe Alexa555 fargestoffer mørke tilstanden. Høy 488 laser makt (~ 50%) er også nødvendig under oppkjøpet å observere god blinker og lav driftssyklus (brøkdel av tiden et fluorophore tilbringer tilstanden på), men det øker bakgrunnsstøyen også. TIRF belysning modusen begrenser magnetisering av fluorophores i et tynt lag (~ 200 nm over glass dekkglassvæske). Det øker signal-til-støy forholdet ved å redusere bakgrunnen lys, men også minsker eksitasjon makt. HILO modus tillater aksial snitting og kan være effektivt å optimalisere signal-til-støy-forhold. Det er derfor en god mellomliggende mellom epi og TIRF. Bruke HILO modus er viktig å opphisse effektivt Alexa555 fluorophores, som krever høy laser makt å blinke riktig.

Et annet viktig skritt er oppkjøpet av rådata (trinn 6). Det er nødvendig å justere oppkjøpet parametere (eksponering, gevinst, TIRF og selv fokus når ingen fokus blokkenhet tilgjengelig) mens filmen er ervervet. Holde en optimal tettheten av lyse fluorophores er viktig (figur 1A): det må være lavt nok romlig skille hver farge, men høy nok til å visualisere hele strukturen etter 40 000 rammer. Hvis antallet aktivert molekyler er for lav, bør lengre stabler anskaffes. Vi fikk god bilder med ~ 5000 lokaliseringer per µm² for IFs og 2 500 lokaliseringer per cm ² for piskehale som henger.

Endringer og feilsøking av metoden

Det er viktig å arbeide med fersk prøver og optimalisert imaging buffere. pH bør være nøyaktig justert, spesielt for MEA.

Vimentin og piskehale som henger bør se jevnt merket når fotografert med standard wide-field mikroskopi teknikk (WF). Hvis filamenter ser krydres/stiplet med klassisk mikroskopi, vil dette bli forsterket ved bruk av super-oppløsning. I dette tilfellet er det bedre å forberede nye prøver. Ikke-optimalisert fiksering forhold (gamle PFA etc.) kan resultere i piskehale som henger ute fragmentert. Høy bakgrunn på glassplaten kan oppstå fra en ineffektiv sperring. I så fall kan BSA (bovine serum albumin) erstattes av FBS (fosterets bovin serum), og brukes i hver inkubasjon trinn.

Hvis merking tetthet er for høy (figur 1B) og kan ikke tilstrekkelig skyves i mørke av-staten, selv med den høyeste laser power, mengden av sekundær antistoffer skal senkes (bedre enn å redusere mengden av primære antistoffer). Dette krever imidlertid utarbeidelse av nye prøver. Generelt, er det nødvendig å vurdere empirisk antall sekundære antistoffer bruke.

Hvis fluorophores ikke blinker normalt (de burde være i lyse staten under én ramme), kontroller at pH i tenkelig bufferen er riktig (pH 8.3). Klargjør nye løsninger hvis problemet vedvarer (spesielt MEA). Kontroller alltid at TIRF collimator er på (TIRF u_HP). Med begrenset laser makt, å få riktig blinker kan være utfordrende (på og av priser samt fargestoff lysstyrke avhengig av laser makt, som beskrevet i van de Linde et al11). Andre fargestoffer som Alexa488 eller Atto488 kan utforskes hvis mer strøm av eksitasjon laser tilgjengelig14.

Hvis fluorophores slutter å blinke før slutten av 40 000 rammer, endre tenkelig bufferen som kanskje er oksidert. Kontroller at det er ingen luftbobler mellom bufferen og lokket etter buffer. Forseglet prøver kan avbildes i noen timer i en rå.

Hvis STORM filmer er ervervet på vanlige TIRF mikroskop utstyrt med en EMCCD, er det mulig å bruke tordenvær24 for å rekonstruere bilder. Lignende alternativer er tilgjengelige for drift korreksjon, bilde filtrering og bildegjengivelse. Torden er en plugin som brukes i Fiji/imageJ programvaren. Lignende resultater ble oppnådd med produsenten programvare og tordenvær (figur 6).

BABYSENG (cyclooctatetraene) kan legges til tenkelig bufferen å forbedre lokalisering presisjonen for enkelt molekyler. Det øker antall fotoner slippes ut per syklus for Alexa64725. En bedre lokalisering presisjon ble faktisk observert (ned 6 nm) når legge 2 mM SPRINKELSENG til STORM bufferen beskrevet i trinn 5 eller med 100 mM MEA som beskrevet i referanse25. Men i disse forholdene, reduserer antallet lyse molekyler under oppkjøpet mye raskere enn uten BABYSENG, begrense antall molekyl steder på slutten av oppkjøpet og kan føre til under utvalg av hvis nettverket. Andre tenkelig buffere ble rapportert å fungere med Alexa fargestoffer, for eksempel med laktase og oxyrase som oksygen scavenging systemet26. I denne protokollen, vi rapportere buffer sammensetning som ga best resultat på sikt oppløsning for våre prøver og bildebehandling satt opp, men hver eksempel type krever buffer optimalisering, i tillegg til merking og fiksering forhold optimalisering.

Begrensninger av metoden og mulig forbedringer

Metoden som presenteres her er begrenset til faste celler og 2D-bilder. Bruk en standard tenkelig sett opp med TIRF mikroskop og en EMCCD, den mest begrensende faktoren var laser krefter (100 mW for 561 nm laser var ikke tilstrekkelig til å gjøre Alexa555 fargestoffer blinker). En 532 nm laser linje kan være mer effektivt å opphisse disse fargestoffer. En mulig forbedring av metoden ville være å utføre 3D dSTORM bruker optisk astigmatisme27. Dette vil kreve minimalt modifikasjoner av protokollen, unntatt lavere merking tetthet og en økt bildenummer. 3D to farger STORM bildet vil gi en bedre visning av IFs pakket rundt piskehale som henger, spesielt i bunter. Merk at utgangen filamenter kan også sees ved hjelp av samme metode som fiksering og en optimalisert mengde fluorescerende phalloidin8. 3 farger STORM kan brukes til å observere organiseringen av tre cellen cytoskjelett delsystemene.

Bruke primære og sekundære antistoffer øker størrelsen på objektet av interesse siden videregående antistoffer er lokalisert opptil 20 nm fra målet. Vanligvis en 25-nm diameter microtubule vil ha en bredde på ~ 50 nm etter merking. En mulighet til å forbedre avstanden mellom målet og fargestoff er direkte merke primære antistoffer med de aktuelle fargestoffer. Ideelt skal nanobodies merket med organisk fargestoffer brukes28.

Vi gir her bare en enkel metode for å beregne gjennomsnittlig lokalisering presisjonen til et enkel molekyl etter Endesfelder et al22. Generelle oppløsningen på bildene som tar hensyn til både lokalisering presisjon og merking tetthet, kan også måles ved hjelp av Fourier Ring korrelasjon tilnærming29.

Når kanalen registreringen er det vanskelig å overlappe perfekt alle perler i synsfeltet. En mer kompleks korreksjon kan finnes i Chazeau et al 12.

Begrensninger som følge av den blinker i fluorophores og bleking av sonder kan overvinnes ved hjelp av DNA-PAINT (DNA poeng oppsamling for Imaging i nanoskala topografi)30. I denne metoden opprettes blinkingen nødvendig for ett molekyl lokalisering ved forbigående binding av kort-dye-merket oligonucleotides sine komplementære mål.

Konklusjon

Denne artikkelen presenterer en robust protokoll for å utføre to-farge dSTORM imaging i 2 dimensjoner av cellen cytoskjelett filamenter i fast celler. Eksperimentelle forhold som ble funnet optimalt i fiksering, immunolabeling og bildebehandling bufferen for vår eksempel type er beskrevet i detaljer. Deretter prosessen med rå datainnsamling og hvilken blinkende bilder som må registreres (molekyl tetthet, signal til støyforhold, fluorophore plikt syklus etc) presenteres samt hvordan å rekonstruere dSTORM bilder, riktig drift og filtrere dataene. Disse trinnene er generiske for to-farge dSTORM bildebehandling og prøve type spesifikke. Til slutt vises hvordan denne teknikken hjelper deg for å løse tett organiseringen av de to sammen cellen cytoskjelett nettverkene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Mickael Lelek, Orestis Faklaris og Nicolas Bourg til fruktbar diskusjon, Andrey Aristov og Elena Rensen hjelp med super-oppløsning teknikken og Shailaja Seetharaman for nøye gjennomlesing av manus. Vi erkjenner takknemlig UtechS fotoniske BioImaging (Imagopole) Citech av Institut Pasteur (Paris, Frankrike), i tillegg til Frankrike-BioImaging infrastrukturnettverket støttes av franske National Research Agency (ANR-10-INSB-04; Investeringer for fremtiden), og Région Ile-de-France (programmet Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) for bruk av Elyra mikroskop. Dette arbeidet ble støttet av den Ligue Contre le kreft og franske National Research Agency (ANR-16-CE13-0019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 41090-028 cell culture
non essential amino acid Gibco 1140-050 cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum Gibco 10270-106 cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25300-054 cell culture
PBS 10x fischer scientific 11540486 cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H Marienfield/Dominic dutsher 900556 coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution Sigma F8775 cell fixation
glutaraldehyde Sigma G5882 cell fixation
triton X100 Sigma T9284 non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4) Sigma 452904-25ML cell fixation
BSA Sigma A7906 sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse Sigma V6630 primary antibodies
Rat anti alpha tubulin Biorad MCA77G primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Fisher scientific 10635923 secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Fisher scientific 10226162 secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Fisher scientific T7279 fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA) Sigma 30070 for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger Sigma G0543 for the blinking buffer
glucose sigma for the blinking buffer
catalase from bovine liver Sigma C9322 for the blinking buffer
Tris (trizma) Sigma T1503 for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack Sigma Z688568
Parafilm Sigma P7793-1EA paraffin film
ultrasonic cleaner Fisher scientific 15-335-6
plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 133 intermediære filamenter vimentin microtubule STORM super-oppløsning mikroskopi cytoskeleton
Tenkelig intermediære filamenter og piskehale som henger med 2-dimensjonal direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S.… More

Leduc, C., Salles, A., Shorte, S. L., Etienne-Manneville, S. Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. J. Vis. Exp. (133), e57087, doi:10.3791/57087 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter