Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Radionuklid-fluorescens Reporter gen Imaging för att spåra tumör Progression i gnagare tumör modeller

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

Vi beskriver ett protokoll för prekliniska i vivo spårning av cancer metastaser. Den är baserad på en radionuklid-fluorescens reporter kombinerar den natrium jodid symporter, upptäcks av icke-invasiva [18F] tetrafluoroborat-PET, och en fluorescerande protein för strömlinjeformad ex vivo bekräftelse. Metoden är tillämplig för prekliniska i vivo cell tracking bortom tumörbiologi.

Abstract

Metastaser är ansvarig för de flesta dödsfall i cancer. Trots omfattande forskning fortfarande mekanistisk förståelse för de komplexa processer som reglerar metastaser ofullständigt. In vivo -modeller är avgörande för metastaser forskning, men kräver förfining. Spåra spontana metastaser av icke-invasiva i vivo imaging är nu möjligt, men fortsatt utmanande eftersom det kräver lång tid observation och hög känslighet. Vi beskriver en längsgående kombinerade radionuklid och fluorescens hela kroppen i vivo imaging strategi för att spåra tumör progression och spontana metastaser. Denna reporter gen metod sysselsätter den natrium jodid symporter (NIS) smält till en fluorescerande protein (FP). Cancerceller är konstruerad för att stabilt express NIS-FP följt av urval baserat på fluorescens-aktiverad cell sortering. Motsvarande tumör modeller är etablerade i möss. NIS-FP uttrycker cancerceller är spåras icke-invasivt i vivo på hela kroppen nivå av positronemissionstomografi (PET) använder NIS radiotracer [18F] BF4. PET är för närvarande den mest känsliga i vivo imaging teknik som finns på denna skala och möjliggör tillförlitlig och absolut kvantifiering. Nuvarande metoder antingen lita på stora kohorter av djur som är euthanized för metastaser bedömning vid varierande tidpunkter eller förlita sig på knappt mätbara 2D imaging. Fördelarna med den beskrivna metoden är: (i) mycket känsliga icke-invasiv i vivo 3D PET imaging och kvantifiering, (ii) automatiserade PET tracer produktion, (iii) en betydande minskning krävs antalet djur på grund av upprepade imaging alternativ, (iv). förvärvet av Parade data från efterföljande imaging sessioner som ger bättre statistisk data och (v) alternativet inneboende för ex vivo bekräftelse av cancerceller i vävnader av fluorescensmikroskopi eller flödescytometri. I detta protokoll beskriver vi alla steg som krävs för rutinmässig NIS-FP-ges icke-invasiv i vivo cancer cell spårning med hjälp av PET/CT och ex vivo bekräfta i vivo resultat. Detta protokoll har tillämpningar utöver cancerforskningen när i vivo lokalisering, expansion och long-time övervakning cell befolkningen är av intresse.

Introduction

Metastaserande sjukdom är orsaken till de flesta dödsfall 1. Trots omfattande forskning om metastaserande processer är tillförlitlig övervakning av cancer metastaser i djurmodell system svårt att uppnå. Senaste framstegen inom hela kroppen imaging tekniker och multimodal imaging metoder har gjort det möjligt för icke-invasiv i vivo cell tracking2,3,4,5. Det senare kan användas som ett verktyg för att övervaka förekomsten, distribution, kvantitet och viabiliteten hos celler, icke-invasivt och upprepade gånger i ett levande djur eller en människa.

Syftet med den metod som beskrivs här är längdriktningen och icke-invasivt spåra cancerceller i 3D i levande gnagare tumör modeller. Med den här metoden kommer forskarna att kunna exakt kvantifiera tumör progression inklusive metastasering i 3D. Denna metod jämfört med traditionella icke-imaging-baserad teknik, och erbjuder förvärv av kvantitativa data med till stor del minskade antalet djur. En annan huvudnummer av den här metoden är att det tillåter korrelation i vivo Imaging med strömlinjeformad nedströms ex vivo analys av spårade cellerna i skördade vävnader av histologi eller flödescytometri3,6.

Den logiska grunden för utvecklingen av denna metod var att ge en in vivo -verktyg för övervakning och kvantifiering av hela metastaserande processen i gnagare tumör modeller. Viktigast av allt, var den avsedd att minimera användning av djur samtidigt som de minskar variabilitet. Längsgående noninvasiv hela kroppen imaging lämpar sig utmärkt att informera på metastaserad utväxt, för vilka i sig är det svårt att förutsäga exakt tid och plats för dess förekomst. Hela kroppen 3D imaging har därför varit i centrum för metodutveckling. För att stänga skala klyftan mellan hela kroppen i vivo antog imaging och potential nedströms ex vivo histologisk bekräftelse, en flerskalig imaging strategi baserad på en dual-mode radionuklid-fluorescens reporter var3, 6.

Positron emissions tomografi (PET) är den mest känsliga 3D hela kroppen bildteknik för närvarande tillgängliga erbjuder utmärkta djup penetration och absolut kvantifiering7 med en upplösning på < 1 mm8,9. För närvarande kan prekliniska cell tracking på nivån hela kroppen av radionuklid imaging tillförlitligt identifiera celler vid tätheter av ~ 1000 celler per volym miljon celler3,6 med resolutioner i regionen sub millimeter. Till skillnad från intravital mikroskopi, den skränande upptäcka enda sprida cancerceller, men det kräver kirurgiska ingrepp (t.ex. fönster kammare), är inte begränsad till ett litet synfält, och inte av låga vävnad penetration och scatter. Mareld imaging är ger ett billigt alternativ, men associerade med scatter och ljusabsorption frågor samt dålig djup penetration och följaktligen starkt begränsad i kvantifiering2. Fluorescens hela kroppen imaging har använts för förvärv av 3D-bilder, men det är mycket mindre känsliga jämfört med Mareld eller nukleärmedicinsk teknik2. Fluorescens erbjuder dock möjlighet att utföra ex vivo nedströms vävnadsanalys av flödescytometri eller mikroskopi. Den senare stänger skala-klyftan mellan makroskopiska hela kroppen imaging (mm upplösning) och fluorescens mikroskopiska vävnad analys (µm upplösning)3. Därför kompletterar radionuklid och fluorescens formerna varandra, alltifrån nivån hela kroppen till cellulära skalan (sub-).

Reporter gen imaging är idealiskt för långvarig cell spårning som krävs i metastaser forskning. I det här programmet det är överlägsen direkt cell märkning som det är (i) inte påverkas av etikett utspädning och således inte begränsad i spåra tid, och (ii) bättre återspeglar levande cell nummer. Följaktligen, hela kroppen cell tracking är särskilt användbara för tillämpningar där spårbara celler föröka eller expandera i vivo, till exempel i cancer forskning3,6, för detektion av teratoma bildandet i stammen cell forskning, eller för kvantifiering av immun cell expansion5.

Olika radionuklid-baserade reporter gener är tillgänglig2. Dessa inkluderar enzymer såsom herpes simplex virus HSV11 tymidinkinas (HSV1 -tk), transportörer såsom natrium jodid symporter (NIS) eller noradrenalin transportör (netto), samt ytan cellreceptorer såsom dopamin D2-receptorn ( D2R). NIS är ett glykosylerat trans-membran protein som aktivt förmedlar jodid upptag, till exempel i follikulära celler i sköldkörteln för efterföljande syntesen av sköldkörtelhormon10. Denna process drivs av en symport för Na+ och förlitar sig på den cellulära natrium lutningen, som upprätthålls av Na++k-ATPas11. Följaktligen, NIS bättre återspeglar levande cell nummer än andra reportrar som jodid/radiotracer upptag är kopplad till en aktiv Na+k+ lutning snarare än bara förekomsten av transportören. Traditionellt radioiodide har använts för NIS avbildning. För cell tracking, har alternativa NIS-radiotracers som inte är metaboliskt anhållna i sköldkörteln rapporterats vara överlägsen6. Detta nyligen utvecklat PET radiotracer [18F] tetrafluoroborat ([18F] BF4)12,13 visar överlägsen farmakokinetiken jämfört med radioiodide6 samtidigt som tillgängliga på hög specifik verksamhet14 utan behov av komplexa radiokemi faciliteter. [18F] BF4 kan syntetiseras via två olika sätt. Den första metoden bygger på isotop utbyte av icke-radioaktiva 19F i BF4 med radioaktiva 18F12. Den andra metoden är genom tillägg av 18F till icke-radioaktiva boron Kvävetrifluorid14. Den senare metoden rapporterades att ge högre specifik verksamhet14 och är metoden för val av preklinisk imaging.

NIS uttrycks mycket i sköldkörteln vävnader. Det uttrycks också i saliv, lachrymal och digivande mjölkkörtlar samt magen, men på lägre nivåer jämfört med sköldkörteln10. Därför kan utmärkt kontrast imaging i andra organ regioner uppnås med NIS. Det är också mycket homologa mellan människa, råtta och mus10. Dessutom finns det inga rapporter om toxicitet vid ektopisk NIS uttryck i icke-thyroidal celler. Ännu viktigare, har NIS också inte associerats med värd immunsvar, varken människor eller gnagare. NIS har använts som en reporter gen för att mäta arrangören aktivitet15,16,17 och gen uttryck18,19,20,21,22 ,23 i flera olika sammanhang. Det har också använts för icke-invasiv imaging gen terapi vektorer24,25, och att spåra celler i hjärtats4, hematopoetiska26, inflammation5och neurala studier27. Nyligen, NIS har också använts som en reporter gen för att spåra cancer metastaser i vivo3,6.

Sammanfattningsvis är de främsta fördelarna med denna metod över tidigare tekniker: a mycket känsliga icke-invasiv 3D i vivo lokalisering och kvantifiering av metastatisk spridning, (ii) automatiserad produktion av [18F] BF4 på hög molar aktiviteter, (iii) en betydande minskning krävs djur genom längsgående imaging, (iv) förvärv av Parade data från efterföljande imaging sessioner vilket resulterar i förbättrad statistiska uppgifter, vilket i sin tur ytterligare minskar användning av djur, och (v) det inneboende alternativet för ex vivo bekräftelse av cancerceller i vävnader med hjälp av flödescytometri eller fluorescence mikroskopi.

Protocol

Detta protokoll uppfyller alla krav som ställs i Storbritannien (UK) lagstiftning och panelen lokala etikprövning. När du följer detta protokoll, säkerställa förfaranden också uppfyller alla krav dikteras av nationell lagstiftning och lokala etikprövning panel. Se till varje experiment som rör radioaktivitet är kompatibel med lagstiftning och lokala regler och utförs på ett säkert sätt.

1. teknik och karakterisering av cancerceller att uttrycka radionuklid-fluorescens fusion reportern NIS-FP

Notera: För enkelhetens skull mEGFP A206K förkortas ”GFP” och mCherry som ”RFP” i de efterföljande avsnitten i detta protokoll.

  1. Generation av lentiviral partiklar
    1. För att producera lentivirus partiklar, Co transfect 293T celler med följande fyra plasmidsna med en lämplig transfection metod: a reporter gen kodning plasmid (pLNT SFFV NIS-GFP eller pLNT SFFV NIS-RFP (se tilläggsinformation), (ii) tredje generationens lentiviral förpackning plasmider pRRE och (iii) pRSV-Rev, och (iv) ett virus kuvert innehållande plasmid, e.g, pMD2.G. Förblandning plasmider innan du lägger till dem till transfection mixen. Utföra transfection i en cell kultur huva.
      Obs: Ytterligare transfection information tillhandahålls i kompletterande Information.
    2. Bedöma transfection framgång efter 48 h av standard wide-fältet fluorescensmikroskopi med filterinställningar som är lämpliga för den valda fusion reportern (NIS-GFP eller NIS-RFP).
      Obs: Fluorescens signaler är vägledande för reporter gen transfection och därför endast ett surrogat för framgångsrika samtidig transfection, inte en indikator på lyckad virus produktion.
    3. Skörda virus partikel-innehållande supernatanten med hjälp av en spruta och ta bort flytande celler och cellfragment genom filtrering genom ett 0,45 µm sterila polyetersulfon (PES) filter. Överför till en steril 1,5 mL polypropylen reaktionsröret. Utföra virus arbete i en cell kultur huva och säkerställa att inga levande virus lämnar innehöll miljön.
  2. Transduktion och urval av NIS-FP uttrycker cancer cellinjer
    1. Använd ren fräsch virus från steg 1.1.3 blandad 1:1 (v/v) med optimal odlingsmedium för varje cancer cellinje (DMEM för MDA-MB-231 celler och RPMI 1640 för 4T1 celler, se material tabell för media sammansättning). Utföra transduktion i en cell kultur huva.
      Obs: Ett mer allmänna protokoll är avses i kompletterande Information.
    2. Transduce cancerceller med virusinnehållande medium i en inkubator med fuktad atmosfär som innehåller 5% (v/v) CO2 vid 37 ° C i 72 h (arbete på 6-väl eller 12-väl skala med 1 mL eller 0,4 mL av virus blandningen från steg 1.2.1).
    3. Övervaka mål cell NIS-FP uttryck genom fluorescensmikroskopi.
    4. Expandera framgångsrikt sensorik celler till en skala av 3-10 miljoner celler använder standard odlingsbetingelser (se ATCC för MDA-MB-231 och 4T1 cellinjer).
    5. Använd fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) för att rena NIS-FP uttrycker celler från icke-sensorik celler.
      Obs: FACS kan vara en källa av mycoplasma infektioner; Det är rekommenderat att kontrollera för mycoplasma innan virus produktion och transduktion men också efter FACS och innan steg 1.3.
  3. Karakterisering NIS-FP uttrycker cancer cellinjer
    1. Bekräfta reporter uttryck genom standard flödescytometri som beskrivs på annan plats28.
    2. Bekräfta reporter integritet genom standard immunoblotting som beskrivs på andra ställen29.
    3. Analysera intracellulära fusion reporter lokalisering av confocal fluorescensmikroskopi.
      Obs: Färgning med eller samtidig uttryck av ett plasmamembran markör6 och efterföljande samtidig lokalisering analys30 kommer att underlätta detta steg.
    4. Analysera radiotracer upptag i NIS-FP uttrycker cellinjer.
      Observera: Alla radioaktiva NIS substrat som är förenlig med befintlig utrustning är lämplig, e.g. de jodid isotoperna (123jag-, 124I-, 125jag-, 131jag), 99 m TcO4-, 188ReO4-, [18F] så3F eller [18F] BF4.
      1. Utsäde 106 renat celler i 6-väl plattor i sin optimala odlingsmedium (se tabell för material) en dag före experimentet. Förbereda alla prover i tre exemplar och inkluderar kontrollprover: (i) ”specificitet kontroller”, dvs NIS-FP uttrycker celler före inkuberas med konkurrenskraftiga NIS substrat att testa upptag specificitet; (ii) ”Föräldrakontroll cell kontroller”, dvs celler inte uttrycker NIS-FP men får radiotracer för att testa basala upptag i föräldrarnas celler.
      2. På den nästa morgonen, tvätta cellerna en gång med serumfritt odlingsmedium.
      3. Inkubera cellerna i serumfritt odlingsmedium i närvaro av 50 kBq 99 mTcO4 eller [18F] BF4 under 30 minuter vid 37 ° C (1 mL total volym). För specificitet kontroller, Preinkubera cellerna för 30 min med konkurrenskraftiga substrat NaClO4 (12,5 µM slutlig koncentration). Hålla konkurrenskraftiga substrat koncentrationen konstant under hela försöket.
      4. Samla in supernatanten och överföra 100 µL till en förberedd samling röret ”supernatant”.
      5. Tvätta cellerna två gånger med 1 mL iskallt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande Ca2 +/Mg2 +. Samla varje tvättlösning och överföra 100 µL av varje i en förberedd samling röret märkt ”wash1” eller ”wash2”, respektive.
      6. Lyft cellerna genom att lägga till 500 µL PBS om innehåller 0,25% (w/v) trypsin och 0,53 mM EDTA och inkubation vid 37 ° C tills cellerna lossa (kontrollera visuellt med hjälp av ett Mikroskop). Över till en förberedd samling röret ”celler”. Tvätta brunnarna med 500 µL iskall PBS som innehåller Ca2 +/Mg2 + och lägga till röret ”celler”. Pellet cellerna genom centrifugering (250 x g, 4 min, 4 ° C).
      7. Räkna alla fyra typer av prov från varje brunn med hjälp av en gamma motverka korrekt inställd för radioisotop val (här: 99 mTc eller 18F).
        Obs: På grund av det stora antalet prover i denna analys, är det rekommenderat att använda en automatiserad γ-räknare kan automatisk decay correction.
      8. Analysera data genom att summera erhållna gamma räkningarna av prover från varje brunn för att bestämma en totala radioaktiviteten räkna per brunn.
        Obs: ta alikvotering i steg 1.3.4.4 och 1.3.4.5 beaktande av multiplicerande nummer av 10 för ”supernatant”, och ”tvätta” fraktioner.
      9. Express cellulär radiotracer upptag som % upptag som anges i Equ.1. Beräkna medelvärden och standardavvikelser från tre exemplar experiment.
        Equation 1(Equ.1)
        Obs: Här, reporter validering experiment beskrivs, men icke-reporter-relaterade cellulära funktioner (t.ex. spridning, cancer cell invasion, genuttryck etc.) är ytterst programspecifika och varje användarens ansvar.

2. inrättandet av i vivo tumör modeller

  1. Använd endast fullt kännetecknas och validerade celler för i vivo experiment. Kontrollera fluorescens av celler före administrering av någon lämplig teknik (t.ex. fluorescensmikroskopi, flödescytometri) vid varje tillfälle.
  2. Fastställa den tumör modellen i 5-6 veckor gamla ung-vuxen honmöss. Använda BALB/cAnNCrl eller BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu (BALB/c naken) möss för 4T1 tumör modell och nicka. CG-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ (NSG) möss för MDA-MB-231-baserade tumör-modellen. Raka djur lokalt och Använd aseptisk teknik. Direkt injicera 50 µL av en suspension innehållande 106 NIS-FP uttrycker cancer celler/mL i mjölkkörtlar fettet pad mellan fjärde och den femma bröstvårta31.
    Obs: För att förbättra injektion noggrannhet, är det rekommenderat utför injektionen under narkos med bedövningsmedel inandningsbar såsom isofluran (1-2% (v/v) i O2).
    Obs: Kirurgisk implantation av tumör bitar från NIS-FP uttrycker tumörer är en alternativ strategi för tumör modell etablering31.
  3. Kontrollera fluorescens av celler vid injektionsstället efter administrering och i den tidiga dagar efter injektionen. Använd en fluorescens ficklampa och filter glasögon passar FP val.
  4. Övervaka tumörtillväxt och kontrollera om några kliniska tecken (särskilt vid senare tidpunkter).
    Obs: För ytliga tumörer, dvs ortotop bröstcancer tumörer i detta protokoll, Använd bromsok och formeln för genomsnittlig tumör diameter (MTD) = ½· (L + W) 32.

3. produktion av [18 F] BF 4 med hjälp av en automatiserad radiotracer syntes (ARS) plattform.

Obs: Här, automatiserade [18F] BF4 syntes utifrån metoden av 18F tillägg till bortrifluorid beskrivs. Användare av ett mer allmänt tillgänglig ARS-plattform (se tabell för material), kan hämta filen för motsvarande Extensible Markup Language (XML) som krävs för att köra automatiserade sekvensen på denna plattform (kompletterande fil). En detaljerad förklaring av kassett layouten visas i figur 1 ges i (tabell 1) samt en detaljerad beskrivning av varje steg i den XML-sekvens (tabell 2) för att stödja översättning till någon annan automatiserad plattform.

  1. Ställ in ARS plattformen som beskrivs i tabell 1 och kontrollera de fungerar med rätt XML-filen lastas kontroll datorn. Säkerställa ARS plattformen placeras i en kemisk huva som är lämplig för säkert arbete med GBq mängder radioaktivitet.
  2. Aspirera cyklotron-producerade [18F] F (vanligtvis 1,5-2 GBq i 2-7 mL [18O] H2O) via inloppet reservoaren (V6).
  3. Fällan radioaktiviteten på en exchange anjonharts (e.g. kvaternära ammoniumsalter anjon exchange patronen; V4 V5), återvinna den [18O] H2O i en separat injektionsflaska (V1).
  4. Eluera de [18F] F (omvänd eluering, V5 till V4) in i reaktorn (V8) med 750 µL av 0,9% (w/v) koksaltlösning (V2), följt av 1,5 mL acetonitril (V16).
  5. Ta bort vattnet genom azeotropisk avdunstning under vakuum och kväve flöde genom upphettning vid 105 ° C och 120 ° C i 5 min.
  6. Minska reaktorn temperaturen till 80 ° C.
  7. Tillsätt 800 µL 15-crown-5 i vattenfri acetonitril (46 mg, 0,21 mmol) i torrt [18F] F genom den centrala porten av reaktorn (V8).
  8. Tillsätt 850 µL av BF3. OEt2 i vattenfri acetonitril (0,16 mg, 1.13 µmol) till reaktorn.
  9. Reagera för 5 min när du återvänder till rumstemperatur.
  10. Passera reaktionsblandningen genom en aluminiumoxid patron (V17 till V18) att fälla trifluoroborate.
  11. Returnera reaktionsblandningen att spruta S2 och späd med vatten (ca 1,6 mL).
  12. Passera reaktionsblandningen genom en andra anjon exchange patron (V19 till V20) att fälla [18F] BF4 produkten.
  13. Tvätta reaktorn med vatten (ca 5,5 mL).
  14. Passera den resulterande lösningen genom aluminiumoxid och andra anjon utbyte patroner.
  15. Skölj sprutor S2 och S3 med vatten.
  16. Tvätta andra anjon exchange patronen med vatten och torka den med kvävgas.
  17. Eluera produkten (V19 till V20) med 1 mL 0,9% NaCl (V14) in i sprutan S3.
  18. Överföra produkten (400-500 µL) via outlet-linjen (V21) till en samling 1 mL injektionsflaska av glas.
    Obs: Molar aktivitet är en viktig aspekt av varje radiotracer. Men dess rutinmässig bestämning är inte bara tidskrävande men också kräver betydande mängder färska syntetiserade [18F] BF4-, så att det blir en begränsande faktor för antalen djur som kan avbildas. Att testa reproducerbarhet och molar aktiviteter av resultanten [18F] BF4, det rekommenderas att schemalägga några hängivna test-körningar för detta ändamål. För mer information om molar aktiviteter, se diskussionsavsnittet.

4. in vivo imaging av NIS-FP uttrycker celler av nanoPET/CT

  1. Djur förberedelse
    1. Söva möss med 1,5-2,0% (v/v) isofluran i O2 med en flödeshastighet av 1,0-1,5 L/min i en induktion kammare. För att kontrollera för tillräcklig anestesi leta efter avsaknad av pedal reflexen.
    2. Se till att applicera vet salva på djurs ögon att förhindra torrhet under anestesi
    3. Flytta musen på en värmedyna med näsan i en narkos leverans mask och varm svansen (t.ex. genom att doppa det i 37 ° C vatten eller använda en infraröd lampa).
    4. Späd den nylagade sterila-filtrerad [18F] BF4 lösningen 5 MBq per 50 µL med 0,9% steril koksaltlösning.
    5. Med hjälp av en spruta ansluten till injektionsnål (spårvidd 29-31), rita 100 µL av [18F] BF4 lösningen, mäta radioaktiviteten i sprutan och notera värdet och tid för mätningen.
    6. Intravenöst administrera 50 µL av den [18F] BF4 lösningen i förväg värmde svans venen.
    7. Mät den återstående radioaktiviteten i sprutan och notera värdet och tid för mätningen. Skillnaden mellan värden som mäts vid steg 4.1.7 och 4.1.5 är den injicerade dosen (ID).
    8. Ställa in timern att räkna ner från 45 min (starttid PET Imaging = 0 min).
    9. Placera musen på sängen av nanoPET/CT-skannern och kontrollera bedövningsmedel leverans korrekt åter bifogade.
    10. Kontrollera anestesi förblir klar genom att testa för avsaknad av pedal reflexen.
    11. Se till att musen är placerad på sängen på önskat sätt, t.ex. 'Sfinxen'-som position.
    12. Installera djur övervakning enheter enligt tillverkarens rekommendationer, t.ex. en rektal temperatur probe, en sond som mäter djur andas eller elektroder för att registrera EKG. Kontrollera korrekt funktion av alla instrument.
      Obs: För Invivo specificitet tester med NIS radiotracer [18F] BF4, djur är avbildade som beskrivs ovan, och sedan vilade vaken tills radioaktiviteten har skämda tillräckligt för att betraktas som försumbar, t.ex. 48 h senare när endast 1.3·106% resterande 18F radioaktivitet kommer att närvara i djuret. I den efterföljande bildsession, konkurrenskraftiga substratet ClO4 administreras vid en dos på 200 mg/kg 30 min före radiotracer administrering och imaging utförs enligt beskrivningen ovan.
  2. Avbildning av nanoPET/CT
    1. Ange önskad CT imaging parametrar, t.ex. med hjälp av den nanoPET/CT 55 kVp rörspänning, ställa in exponering till 1200 ms med grad kantiga kliva och 180 graders prognoser.
    2. Ställa in parametrar för PET bild förvärv. Använd statiska genomsökningsparametrar PET med en löptid på 30 min, 1:5 tillfällighet läge och 400-600 keVp energifönster.
    3. Vid nedräkningstiden = 15 min start datortomografen bild.
    4. Vid nedräkningstiden = 0 min start PET bild förvärv.
      1. Om seriell djur imaging återhämta krävs, låt djuren fullt från anestesi, dvs återfå medvetandet under övervakning. Därefter överför dem till en underhåll enhet.
      2. Om detta är terminalen imaging session, vidare till djur dödshjälp genom antingen narkos överdosering, stigande koncentration av koldioxid, eller hängning.

5. in vivo dataanalys

  1. Rekonstruera den PET/CT-data med en Monte Carlo-baserade full 3D iterativ algoritm. Säkerställa att korrigeringar för dämpning, dödtid och radioisotop förfall anses. För detaljer, se tillverkarens anvisningar av PET/CT instrumentet i bruk.
  2. Kontrollera CT och PET-bilder registreras korrekt Co och spara data i en lämplig exchange format såsom 'Digital Imaging and Communications in Medicine ”(DICOM).
  3. Analysera bilder
    1. Ladda de rekonstruerade DICOM-filerna till en lämplig bild analys programvara som möjliggör erkännande och avgränsning av områden av intresse (ROIs) och efterföljande PET signal kvantifiering i dessa ROIs.
    2. Segmentera de ROIs som använder manuell eller adaptiv tröskelvärde för att definiera ROIs33,34 med en lämplig programpaket. Anatomisk bildinformation från CT scan hjälper guide ROI uppdrag, t.ex. ytliga tumörer eller lung volymer.
    3. Använda programvaran analys enligt tillverkarens instruktioner och säkerställa data är kalibrerade till den injicerade radioaktivitet dos och korrigerad för dämpning och radioaktivt sönderfall.
  4. Rita grafer visar data från detta in-vivo -kvantifiering. Data som antingen procent Express injiceras dos/volym (%ID/mL) eller standard upptag värde (SUV), som är en alternativ åtgärd med tanke på radioaktiviteten i hela kroppen av ämnet.
    1. Beräkna %ID/g värden förutsatt att vävnad densitet är som vatten, dvs ~ 1 g/L. Det är anmärkningsvärt att detta antagande kan vara ogiltiga för organ med avsevärt olika densiteter, såsom lung- eller ben.
    2. Beräkna olika stadsjeepar för att uppskatta den sanna SUV (t.ex. SUVmean, SUVmax); SUVmax är mer tillförlitlig för små föremål och används oftare än SUVmean35.

6. ex vivo analyser

Utföra börsnoterade nedströms analyser: a fluorescens avbildning av organ som innehåller fluorescerande cancerceller (primärtumör och metastaser) under djurens dissektion, (ii) mätning av radiotracer vävnadsdistribution, och (iii) histologisk eller (iv) flödescytometrisk bedömning av cancerogena organ.

  1. Mätning av radiotracer fördelning på γ-räkna (ex vivo biodistribution) och ex vivo fluorescens avbildning av cancervävnader.
    1. Mäta radioaktivitet hela döda djuret och notera värdet och tiden.
    2. Dissekera djur och skörd följande vävnader: lunga, hjärta, blod (med 20 mm glas kapillärer), lever, mage, njurar, mjälte, tunntarm och tjocktarm, sköldkörtel och spottkörtlar, en bit muskel från benet, och ben av de bakre lårbenet, och relevanta och dissectible lymfkörtlar och cancervävnader.
    3. Mäta radioaktiviteten i återstående slaktkroppen först inklusive sedan exklusive svansen och notera värdena och tider av mätning.
      Obs: Radioaktivitet i svansen kan betraktas som härrör från radiotracer som injicerades mis och därmed inte nådde omsättning. Denna mängd radiotracer därför inte bidrar till den injicerade dosen. Radioaktiviteten i svansen fungerar även som en retrospektiv parameter av injektion kvalitet.
    4. Väg alla vävnader (använda pre vägde rör).
    5. Ta fotografier av cancerogena organ i dagsljus och under fluorescerande ljus.
      Obs: Använd ett kamera stativ att hålla avståndet mellan kameralinsen och orgel konstant (eller använda en dedikerad kommersiella instrument för detta ändamål).
    6. Bädda in organ/vävnader avsedda för nedströms histologi i OCT eller doppa dem i formalin för fixering. För andra nedströms tillämpningar kan provberedning variera.
    7. Förbered radiotracer kalibrering standarder i dubbla, e.g. 0 till 1000 kBq [18F] BF4.
      Obs: Kalibrering standarder krävs för att (i) avser den uppmätta räknas per min radioaktivitet värden (i kBq) och (ii) förenkla decay korrigering; 18 F kan ersätta [18F] BF4.
    8. Räkna radioaktiviteten i alla skördade vävnader med hjälp av en γ-räknare tillsammans med radioaktivitet kalibrering standarder från steg 6.1.7. Notera tiden för mätning. Om räkna priser är för höga (dvs. utanför linjäritet kalibrering standard eller anges av för hög detektor döda gånger), åter räkna prover två radiotracer halv-liv senare.
    9. Presentera data antingen som %ID/g eller standard upptag värden (SUV) (Equ.2).
      SUV = Equation 2 (Equ.2)
    10. Kassera alla skördade vävnader som inte krävs för ytterligare nedströms analyser enligt lokal avfallshantering regler.
  2. Analysera cancervävnader av flödescytometri eller histologi enligt användarens preferenser och standard protokoll (som beskrivs på andra ställen3,6,28).

Representative Results

Det första steget kräver genteknik av cancerceller av intresse. Här, resultaten av lentiviral transduktion metastaserande murina inflammatoriska 4T1 bröstcancerceller och mänskliga metastaserande MDA-MB-231 celler med lentivirus partiklar bär DNA-kodning antingen NIS-GFP eller NIS-RFP visas. Transduktion effektivitetsvinster varierade mellan cancer cellinjer (figur 2A, vänstra kolumnen). Dock sensorik alla resulterande cancercell linjer valdes genom FACS till renhet (figur 2A, höger). Confocal fluorescensmikroskopi (figur 2B) visat rätt plasmamembranet lokalisering av NIS-FPs. NIS-FP-funktionen kvantifierades använder NIS-ges radiotracer upptag (figur 2 c-2E) och visat NIS funktion och specificitet. Framför allt, inga signifikanta skillnader mellan 4T1. NIS-GFP och 4T1. NIS-RFP uttrycker cellinjer med liknande NIS uttrycksnivåerna hittades (figur 2 c).

Efter full i vitro cell linje karakterisering, tumör modeller sattes upp med de nyligen genererade spårbara cancer cellinjer. Som ett exempel, 4T1. NIS-GFP tumör modell, en modell för inflammatorisk bröstcancer, visas här (figur 3). I tumör-bärande djur längsgående hela kroppen PET imaging informerade sedan på tumör progression inklusive metastasering (figur 3B). PET radiotracer [18F] BF4 var nödvändigt för imaging och produceras nymalen varje PET imaging session på morgonen. Syntesen av [18F] BF4 utfördes med hjälp av den beskrivna ARS-metoden. Vanligtvis ~1.6 GBq 18F användes som indata och erhålls ~ 244 MBq [18F] BF4 i 40.5±3.9 min (N = 17). Produkten var analyseras av radio tunnskiktskromatografi eller jonkromatografi och visade en strålningskemisk renhet på 94.7±1.4%. Radiokemiska avkastningen var 19.4±4.0% (decay-korrigerat).

Dag 19 efter tumör Inympning, den primära tumören var tydligt identifieras med hjälp av PET, men hittade inga metastaser. Tio dagar senare (dag 29), samma tumör-bärande möss var åter avbildad och fjärrmetastaser på olika platser i alla djur (lungmetastaser, metastaser till olika inguinal och/eller armhålan lymfkörtlarna) identifierades. Exemplet i figur 3 visade omfattande lungmetastaser med flera tydligt identifierbara och kvantifierbara knölar i lungan (figur 3B-3E). Dessutom presenteras djuret med regional spridning av tumören i de peritoneal vägg samt metastaser i inguinal och båda lymfkörtlar. % ID-värden för enskilda metastaser i lungan (figur 3E) skilde sig allmänt, men det gjorde de ockuperade volymerna av de underliggande metastaserande knölar. Volym-normaliserade %ID/mL värden (figur 3E) var däremot mycket mer enhetlig. Detta var begriplig för olika metastaser vid liknande utvecklingsstadier (dvs utvecklats mellan dagar 19 och 29; Figur 3B). Däremot var värdet normaliserat %ID/mL för den primära tumören lägre än för lungmetastaser, vilket är i linje med en tumör massa som hade mer tid att utvecklas och omskapa inklusive tillströmningen av andra celltyper (stromaceller, immunceller) , särskilt i denna modell av inflammatorisk bröstcancer.

Vägledas av i vivo bilder och fluorescensen av cancerceller (synlig under djurens dissektion under fluorescens ljus), lilla djupt rotad organ såsom lymfkörtlar var tillförlitligt skördas och, samtidigt, bedömas för cancer knöl innehåll ( Figur 4A). Medan fluorescens signalen under djurens dissektion var vägledande av tumör cell närvaro, var det viktigt att säkerställa denna klassificering åtföljdes av ex vivo radioaktivitet mätningar av de skördade vävnaderna. Figur 4B visar de standard upptag-värden (SUV) som erhållits för de olika vävnaderna över en kohort av tre djur, varav alla presenteras med metastaser. Endogent NIS-uttryckande organ såsom sköldkörteln och spottkörtlar (skördas kombinerat) eller magen visade också förväntade höga radiotracer upptaget. Dessutom detta NIS-FP tillvägagångssätt lov okomplicerad cancer cell identifiering under histologi (figur 4 c). Detta immunofluorescens histologi exempeldata visade tumör vaskularisering i 4T1. NIS-GFP tumör modell. Dessa data visade också att NIS-GFP reportern bodde huvudsakligen i plasma membran av tumören celler också i vivo (figur 4 c), därmed validera resultaten upptag.

Figure 1
Figur 1. Systemet beskriver utformningen av automatiserade radiotracer syntes plattformen för produktion av [18F] BF4 via metoden fluor-18-till-bortrifluorid tillägg. Reagensmedlens namn är tryckta på respektive rören i systemet. QMA är förkortningen för Kvartära ammoniumsalter anjon exchange och anger används fasta fasen kromatografisk separation materialet. Ytterligare information finns i tabellerna 1 och 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Typisk karakterisering resultat av cancer cellinjer stabilt uttrycker NIS-GFP eller NIS-RFP. (A) de angivna cellinjer har gjorts med hjälp lentiviruses överföra antingen NIS-GFP eller NIS-RFP. Den vänstra kolumnen visar transduced befolkningen (grön eller röd fluorescerande) jämfört med respektive föräldrarnas cellerna (grå; 4T1 och MDA-MB-231 celler, respektive). Procenttalen visar transduktion effektivitetsvinster som bestäms av flödescytometri. Kolumnen till höger visar resultaten av flöde flödescytometrisk analys efter FACS rening den blandade befolkningen i den vänstra kolumnen. Alla cellinjer befanns vara > 99% ren för anges NIS-uttryckande celler (med flödescytometri). (B) Confocal fluorescensmikroskopi av renat cellinjer visar plasmamembranet lokalisering av NIS-GFP eller NIS-RFP i respektive cell linjer. WGA-Alexa633 användes som plasmamembranet markör. (C, D) Funktionella validering av NIS-FP protein uttryckt i indikerad nyligen genererade cancer cellinjer. NIS funktion mättes använder radiotracer 99 mTcO4 (50 kBq per miljon celler). Som kontroller användes föräldrarnas celler samt fusion reporter uttrycker celler som behandlades med de NIS samtidig substrat perklorat före och under analysen (specificitet kontroll). Resultaten visar tydligt NIS-FP-funktionen och specificitet i alla cellinjer. (E) funktionell validering av 4T1. NIS-FP cellinjer med [18F] BF4 som en radiotracer för NIS. Alla andra villkor var identiska med (C). Viktigast av allt, motivera mycket liknande relativa upptag resultat erhölls för båda 4T1-derived cellinjer med både radiotracers (figur 2 c och E), därmed att utbytbara på både för in vitro- funktionell karakterisering av NIS-FP uttrycker cellinjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Representativa resultat av metastaser spårning av [18F] BF4-PET/CT imaging i en mus med en 4T1. NIS-GFP tumör. (A) en miljon 4T1. NIS-GFP celler skulle injiceras i de mammary fett kuddar av 5-6 veckor gamla BALB/c CanN.Cg-Foxn1nu/Crl möss och tumörtillväxt följdes över tid använda bromsok. På grund av GFP fluorescensen av cancerceller var rå visuell identifiering/tillväxt bedömning också möjligt med en fluorescens ficklampa och lämpligt filter glasögon (se infälld). (B/vänster) På dag 19 inlägg tumör Inympning, var den primära tumören (gul streckad linje) tydligt men inga metastaser. Den bild som presenteras är en maximal intensitet projektion (MIP) av PET bilden. Endogena NIS signaler (vit deskriptorer) spelades också, dvs sköldkörteln och spottkörtlar (Th + SG), magen (S), och vid mycket låga nivåer, vissa delar av mjölkkörtlar och tårfilmens körtlar. Urinblåsan (B) signalen härstammar från tracer utsöndring. (B/höger) På dag 29 inlägg tumör Inympning, metastaser var tydligt: flera metastaser i lungan (gul streckad linje) samt lymfkörtelmetastaser (ILN, AxLN; gula pilspetsar). Den bild som presenteras är ett Minimiimportpris av PET/CT bilden. Den primära tumören (gul streckad linje) växte inte bara i en klotformig form vid denna tidpunkt, men också hade invaderat i peritoneal väggen. (C) en 3D genomförandet av Otsu tröskelvärde tekniken aktiverat 3D surface rendering av cancervävnader; dessa är överlagrade på en PET-MIP. Lungmetastaser visas i vitt, metastaserad lymfkörtlar i rött, metastaserad inguinal lymfkörteln i gult och den primära tumören som invaderat i peritoneal väggen i turkos. (D) en blow-up bild PET/CT MIP (B/höger) för att ange enskilda lungmetastaser. (E) Radiotracer upptag i cancervävnader var kvantifieras från 3D-bilder (% ID) och normaliserade av deras respektive volymer (%ID/mL). Enskilda lungmetastaser motsvarar numreringen i (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Typiska exempel på ex vivo data tillgängliga från NIS-FP tumör-bärande möss. (A) under vävnad skörd för nedströms analyser, fluorescerande egenskaperna för NIS-FP uttrycker tumörcellerna tjänstgjorde som indikator vägledande djur dissektion. Som förebilder, vävnader från djur i figur 3, visas dvs lungan med flera metastatiska lesioner och två positiva lymfkörtlar. Dagsljus fotografering samt fluorescens bilder visas. Fluorescens bilderna togs med samma kamera som dagsljus bilder men under blå ljus excitation (450±10 nm bandpassfilter) med ett grönt utsläpp filter (530±30 nm bandpassfilter) placeras framför kameralinsen. (B) fördelningen av radiotracer i olika organ ('biodistribution') av djur med 4T1. NIS-GFP tumörer (N = 3; dag 29 inlägg tumör inympning; 5 MBq [18F] BF4). Standard upptag värden (SUV) beräknades och värden > 1 ange specifika ansamling av radiotracer i respektive organ. Data visar specifika radiotracer upptag i cancervävnader, dvs primärtumör, lymfkörtelmetastaser (som identifierats av imaging och dissektion under fluorescens ljus), lunga (var dissekerade som helhet utan separera enskilda metastaser), samt organ uttrycker endogenously NIS, dvs sköldkörteln och spottkörtlar och magen. (C) immunofluorescens histologi av den primära tumören från samma mus som visas i figur 3. Den primära tumören var skördas, inbäddade i okt och fryst innan sektionerad (10 µm) och bearbetat för färgning. NIS-GFP uttrycker cancerceller identifierades direkt utan behov av antikropp färgning. Blodkärl var målat med en kanin antikropp mot mus PECAM-1/CD31 (2 µg/mL) och en Cy5-konjugerad get-anti-kanin-sekundär antikropp. Atomkärnor var målat med 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 µg/mL) och provet monterad i poly (vinylalkohol - vinylacetat) som innehåller 2,5% (w/v) Dabco som en antifade. Confocal bilder erhölls med confocal Mikroskop med inställningar som passar 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole, GFP och Cy5. Dessa exempeldata visar tydligt att 4T1. NIS-GFP tumör är vaskulariserad men denna vascularization skiljer sig också i dess omfattning (jfr överst till vänster med botten mitten). Det visar också att NIS-GFP reportern huvudsakligen finns i plasma membran av tumör celler i vivo (infälld), därmed validera resultaten in vitro- upptag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

FASTlab grenrör ventil Reagens, lösningsmedel, patron eller slangar * Detaljer
V1 Silikon slangar till [18O] H2O avfallsflaskan 14 cm
V2 0,9% NaCl-lösning, 750 µL 11 mm injektionsflaska
V3 Sprutan S1 1 mL
V4 anjon exchange patron C1, pre luftkonditionerade med 1 M NaCl (10 mL) och H2O (10 mL) t.ex. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus ljus (vatten, katt. Lol WAT023525)
V5 Silikon slangar till anjon exchange kassett C1 14 cm
V6 [18O] H2O /18F inlopp reservoar Max 5 mL
V7 Silikon slangar till reaktortanken (vänster; gasinloppet) 14 cm
V8 Silikon slangar till reaktortanken (centrala hamn; flytande inlopp/utlopp) 14 cm
V9 Stängt
V10 Stängt
V11 Sprutan S2 5 mL
V12 15-crown-5, 46 mg i 800 µL MeCN 11 mm injektionsflaska
V13 Trifluoroborate dietyleter etherate, 0,14 µL i 850 µL MeCN (utspädd 14 µL av BF3. OEt2 med 1 mL MeCN. Späd 10 µL av lösningen till 850 µL med MeCN). 13 mm injektionsflaska
V14 0,9% NaCl-lösning, 1 mL 13 mm injektionsflaska
V15 Vatten väska spike
V16 Acetonitril (MeCN), 1,5 mL 13 mm injektionsflaska
V17 Silikon slangar till aluminiumoxid neutrala kassett C2 14 cm
V18 Aluminiumoxid neutrala patron C2, pre luftkonditionerade med H2O (10 mL), aceton (10 mL) och luft (20 mL) t.ex. Sep-Pak aluminiumoxid N Plus ljus (vatten, katt. Lol WAT023561)
V19 Silikon slangar till anjon exchange bläckpatron C3 14 cm
V20 anjon exchange bläckpatron C3, pre-luftkonditionerade med 1 M NaCl (10 mL) och H2O (10 mL) t.ex. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus ljus (vatten, katt. Lol WAT023525)
V21 Silikon slangar till samling injektionsflaska 40 cm
V22 Stängt
V23 Stängt
V24 Sprutan S3 5 mL
V25 Silikon slangar till reaktortanken (höger; vakuum port) 40 cm
* Obs: På grund av plast spikar, döda volymen för 11 mm injektionsflaskor och 13 mm injektionsflaskor är ungefär 0,35 mL 0,4 ml respektive. De faktiska beloppen av reagenser överförs till reaktorn är därför något annorlunda. Alla kvantiteter som anges i denna metod avser de faktiska belopp som införts i injektionsflaska reagens.

Tabell 1. Beskrivning av layouten kassett för automatiserad [18F] BF4 syntes via metoden fluor-18-till-bortrifluorid tillägg (jfr figur 1).

Sekvens steg Kommentar
[1 - 2] Trycksätta systemet och spola grenröret med N2
[3-15] Skölj sprutan S3 två gånger med H2O (V15), spola grenröret med N2
[16-23] Trycksätta reagens flaskor i positioner V14, V13, V16 och V12, spolning grenröret med N2 mellan varje injektionsflaska
[24-26] Öppna aktiviteten inloppet (V6)
Anslut injektionsflaskan med 18F. Om den totala volymen är > 5 mL, endast in nålen halvvägs in i injektionsflaskan innan du fortsätter.
[27-39] Stäng aktivitet inloppet (V6), fälla 18F i QMA patron C1 (V5), samla [18O] H2O i avfallsflaskan (V1). Om den totala volymen är > 5 mL, pausa sekvens steg 37, återgå till steg 26, tryck in nålen i injektionsflaskan med 18F, och återuppta processen.
[40] Stäng [18O] H2O avfallsflaskan (V1), spola grenröret med N2
[41] Trycksätta eluenten injektionsflaskan i position V2
[42-44] Öppna reaktorn ventil V8, aspirera eluenten från V2 in sprutan S1
[45-50] Eluera QMA patron C1 in reaktorn (V8) med hjälp av saltlösning från sprutan S1, ställa in reaktorn temperaturen till 90 ° C
[51] Spola QMA patronen C1 med N2 och reaktorn temperatur stiger till 105 ° C
[52-53] Rita acetonitril från V16 in sprutan S2
[54-57] Överföra acetonitril från sprutan S2 till reaktorn (V8)
[58-60] Värm reaktorn vid 120 ° C i 5 min. avdunsta lösningsmedlet med ett flöde av N2 till reaktorn (V7).
[61-65] Inställd temperatur på 105 ° C, torrt spruta S1 med N2
[66-69] Dra 15-crown-5 lösningen från V13 in sprutan S2, reaktorn temperatur stiger till 120 ° C
[70-71] Minska temperaturen till 105 ° C, spola grenröret med N2
[72] Kyla ned reaktorn (set temperaturen till 40 ° C) under 5 minuter
[73-78] Ställa in reaktorn temperaturen till 80 ° C, överför 15-crown-5 lösningen från sprutan S2 till reaktorn (V8)
[79-81] Rita den BF3. OEt2 lösning från V14 in sprutan S2
[82-87] Överföra de BF3. OEt2 lösning från sprutan S2 till reaktorn (V8), spola reaktorn raden med N2
[88] Flush grenröret med N2
[89] Reagera för 5 min, låt temperaturen tillbaka till RT
[90-95] Överföra reaktionsblandningen (V8) till sprutan S2
[96-104] Passera reaktionsblandningen genom aluminiumoxid N patronen C2, in sprutan S3
[105] Flush grenröret med N2
[106-109] Returnera reaktionsblandningen att spruta S2
[110-112] Töm sprutan S3, rita H2O (V15) in sprutan S2 att späda reaktionsblandningen
[113-115] Ladda reaktionsblandningen på QMA bläckpatron C3
[116-118] Rita H2O (V15) in sprutan S2
[119-124] Skölj reaktorn (V8) med H2O från sprutan S2, sug upp upp sköljvattnet i sprutan S2
[125-128] Passera upp sköljvattnet genom patroner C2 och C3
[129-130] Torka av bläckpatroner och samlingsröret med N2
[131-136] Tvätta sprutan S1 med H2O (V15)
[137-142] Tvätta sprutan S2 med H2O (V15)
[143] Flush grenröret med N2
[144-147] Rita H2O (V15) in sprutan S2
[148-151] Spola QMA bläckpatron C3 med H2O från sprutan S2
[152-153] Torka QMA bläckpatron C3 med N2 och spola grenröret med N2
[154-157] Eluera QMA bläckpatron C3 med 0,9% NaCl (V14) in sprutan S3
[158-161] Överföra produkten från sprutan S3 till injektionsflaskan samling (V21)
[162-163] Spola QMA bläckpatron C3 med N2 till injektionsflaskan samling (V21)
[164-166] Flush grenröret med N2
[167-170] Spola patroner C2 och C3 (till avfall flaska) och samlingsröret med N2
[171] Spola samling slangen (V21) med N2

Tabell 2. Beskrivning av stegen i den XML-sekvens.

Discussion

Det första steget att återge cancer celler spårbar i vivo genom denna metod kräver engineering dem uttrycka NIS-FP fusion reportern. Valet av fluorescerande protein i fusion reportern är kritisk som oligomerizing fluorescerande proteiner kan leda till konstgjorda reporter klustring, därmed negativt påverkar dess funktion. Vi har haft framgång med beprövade monomer fluorescerande proteiner som mEGFP (med monomerizing-mutationen A206K36,37), mTagRFP eller mCherry. NIS kan antingen vara av mänskliga eller mus ursprung (HNI eller msNIS) beroende på syftet med försöket och cancer modell. Transduktion effektivitet varierar i allmänhet mellan olika cancer cellinjer. Dock renas genererade cancer cellinjer därefter av FACS i detta protokoll, vilket minskar behovet av att optimera transduktion villkor. Transduktion med hög multiplicity av infektion är inte alltid tillrådligt eftersom flera construct integrering i genomet sannolikt resulterar inte bara i högre konstruera uttryck, men också mer oönskade/oreglerad genomet modifiering. Det är därför viktigt att låta polyklonala sensorik celler växer till stabiliteten i uttryck (övervakas av flödescytometri) och undvika sortering ljusaste klonerna endast av FACS. Det gör även funktionella validering av icke-reporter funktioner avgörande innan dessa celler bör användas för in-vivo -experiment. Ett nyligen utvecklat alternativ till viral genen leverans är genen redigering teknik38, som erbjuder mer specifik kontroll över viral integration webbplatser. Uttryck analys av flödescytometri och immunoblotting är viktigt. Flödescytometri tillåter förvärv av populationsbaserade enda celldata, exempelvis att undersöka huruvida det finns någon drift i reporter uttryck nivåer över tid. Det bygger på den FP-biexponentiellt endast, om inte cellerna färgas också med en antikropp riktad mot ytan eller totala NIS. Flödescytometri informerar inte på fusion reporter integritet. Däremot rapporterar immunoblotting integritet av fusion reporter. Molekylvikten för NIS och FP måste läggas till avgöra den valda NIS-FP. Confocal fluorescence mikroskopi visade fusion reporter colocalization med de plasmamembran markör vetegroddar agglutinin i alla förväntade molekylvikt nyligen gjorde cellinjer. Detta var den förväntade cellulära platsen för de flesta av protein och anges en klartecken milstolpe för efterföljande funktionella validering. Om minimal/inget NIS-FP hittades på plasmamembranet (t.ex. endast i inre cellulära fack), detta skulle innebära ett cell biologiska problem med fusion reporter i denna cell linje, eller en potentiell mutation av fusion reporter som påverkar dess intracellulära människohandel. Det är anmärkningsvärt att vi inte har observerat sådant fall i någon av de cancerceller som vi testat hittills, och som ingår: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (mänskliga melanom); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (mänskliga bröstcancer); NCI-H1975 (mänskliga lungcancer); SK-Hep1 (mänskliga levercancer); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (murina inflammatorisk bröstcancer); B16F0, B16F3, B16F10 (murina melanom); MTLn3 (råtta bröst adenocarcinom).

NIS funktion måste mätas med upptag analyser med radioaktiva NIS substrat. På grund av den SPECT radiotracer 99 mTcO4 som generator-producerade och därför allmänt tillgänglig på sjukhus utan behov av någon radiotracer syntes samt ha en bekvämare längre halveringstid (6.01 h för 99 m TC jämfört med 110 min för 18F), vi använde detta NIS substrat för rutinmässig funktionella validering av nya NIS-FP uttrycker cellinjer. Pre blockering av NIS-uttryckande celler med de NIS samtidig substrat natrium perklorat resulterade i förväntad minskning/abolishmenten av radiotracer upptag, därmed visar specificiteten av radiotracer upptag. Detta NIS specificitet test är en kritisk valideringsstegen. Om ett NIS specificitet experiment inte skulle leda till minskad radiotracer upptag jämförbar med respektive föräldrarnas cellerna, antingen ett tekniskt fel under experimentet har uppstått eller radiotracer upptaget berodde inte på NIS. Det är också möjligt att natrium perklorat pre blockering minskar radiotracer upptag i en Föräldrakontroll cell fodrar; Detta skulle identifiera cellinjer med endogena funktionella NIS uttryck (t.ex. stimuleras sköldkörtel cellerna6).

En avgörande fördel av detta protokoll-avbildning är att information som samlas in i 3D och över tid. Detta tillåter jämförelse av bilder från samma djur över tid, vilket ger Parade data och därmed övervinna de problem som orsakas av variabilitet. Detta kontrasterar mot mest icke-imaging relaterade metastaser bedömningsmetoder som baseras på att offra olika djur vid olika tidpunkter. I figur 3B är det uppenbart hur metastatisk spridning och utväxt utvecklats över tiden i ett enskilt djur. De signaler som upptäcks av PET/CT imaging grunden orsakade av NIS uttryck. Detta omfattar alla signaler från exogent NIS-uttryckande cancerceller samt alla organ endogenously uttrycker NIS. Typiska endogena NIS signaler finns i sköldkörteln och spottkörtlar, magen, och på låga nivåer i vissa delar av mjölkkörtlar och tårfilmens körtlar. Utöver endogena NIS uttryck utsöndras NIS radiotracer [18F] BF4 också via njurarna, därmed förklarar radiotracer upptag i urinen-fyllda blåsor. Njure upptag är inte längre detekterbar den imaging tidpunkt rekommenderas i detta protokoll (45 min post radiotracer injektion6). Om signalerna från urin-fyllda blåsor bör leda till signal till bakgrunden problem, kan blåsan tömmas mekaniskt under narkos innan imaging. Ännu viktigare, kan de endogena signalerna variera mellan djur stammar. Det är också anmärkningsvärt att endogena NIS uttryck i mjölkkörtlar kan vara högre under lakterande villkor10. I presenterade fall och i fall av dessa metastaserande cellinjer som framgångsrikt kännetecknas innan (jfr listan ovan), vi inte hitta endogen NIS uttryck att kraftigt störa metastaser upptäckt. Det är anmärkningsvärt, att [18F] BF4 förblir mer tillgänglig för upptag i cancervävnader jämfört med jodid, eftersom jodid metaboliseras till sköldkörtelhormoner6. Detta fenomen kan också bidra till större mängder av radioiodide i blodet jämfört med [18F] BF4- 6. Detta skilja sig för olika applikationer (cancercell tracking i andra cancerformer eller icke-cancer cell tracking program), och det rekommenderas därför att bedöma om endogena NIS uttryck är sannolikt att orsaka signal till bakgrunden problem genom preliminära experiment. En viktig aspekt inom preklinisk imaging är radiotracer molar verksamhet. Den metod som beskrivs här använder ~1.5 GBq 18F som start material14 och har visat sig producera molar aktiviteter avsevärt över den tidigare rapporterade substitution metod12. [18F] BF4 producerat molara aktiviteter ≤1 GBq/µmol12 kan leda till reducerat upptag i NIS-uttryckande vävnader. Detta är särskilt viktigt när den injicerade mängden radioaktivitet per kilo är hög, dvs när små djur som möss avbildas39; Det är mindre viktigt i den mänskliga inställning40. Hög molar verksamhet är därför absolut nödvändigt för hög kvalitet preklinisk PET imaging. Molar verksamhet erhålls genom boron Kvävetrifluorid tillägg metod14, som visas i sin automatiserad form i detta protokoll, övervinna problemet. Dessutom är det anmärkningsvärt att protokollet presenteras för [18F] BF4 syntes inte är kompatibel med god tillverkningssed (GMP) och därför olämpliga för användning i kliniska prövningar i det här formuläret. En GMP-protokollet (via 18F substitutionsmetoden till radiomärkas BF4) är tillgängligt någon annanstans40.

PET/CT imaging tillåter visualisering av radiotracer upptag, vilket är vägledande av NIS-medierad radiotracer upptag som härrör från NIS-FP uttrycker cancerceller. Viktigare, kan de associera PET-signalerna kvantifieras. Det är nödvändigt att tillämpa tillförlitlig tröskelvärde förfaranden för att säkerställa en enhetlig och objektiv differentiering av relevanta signaler från alla potentiella bakgrund. Som bakgrund varierar i olika platser i vivo, är det viktigt att beakta lokala och regionala tröskelvärde och segmentering. En sådan metod utvecklades av och uppkallad efter Otsu34, och dess 3D genomförande är anställd för 3D-rendering av primärtumör och metastaser i detta protokoll. Bilden sett observatören visuellt motsvarar i allmänhet bäst på de kvantifierade % injicerat dosen (% ID) värdena. När det gäller image-baserad kvantifiering är det också viktigt att normalisera värdena uppmätta radioaktivitet i olika vävnader till deras volymer. Det finns två huvudsakligen använda sätt att uttrycka normaliserade resultat, a %-ID per volym (t.ex. %ID/mL), och (ii) standard upptag värde (SUV35). De skiljer sig i att %ID/mL tar hänsyn till den enskilda volymen bara, medan SUV är ett mått som är i förhållande till den genomsnittliga radioaktiviteten över hela djuret. Det är också viktigt att notera att NIS imaging gör den levande tumör volymen (LTV) tillgängliga, eftersom död/döende celler inte syntetisera ATP kan inte längre importera radiotracer10. Detta förklarar det stora låg-signal området inom den primära tumören (”donut formade” tumör) som indikerar områden av tumör cell death/nekros. Huvudsakligen, var LTV ett mycket mer tillförlitliga mått på tumör börda jämfört med rå tumör volym nås med skjutmått mätningar (som inte tar in i konto livskraft och bedömer endast ytlig tumör regioner).

En stor fördel med denna dubbla lägen spårning strategi är uppenbart när skörda vävnader efter djur avlivats. Biträdd av fluorescerande cancerceller under djurens dissektion och styrs av i vivo bilder, kan små och djupt liggande organ/metastaser också på ett tillförlitligt sätt skördas. Fryst vävnad bevarande/snittning metod möjliggör direkt fluorescens bildtagning av GFP utan behov av färgning med en anti-GFP-antikropp, men på bekostnad av minskad strukturella vävnad bevarande jämfört med formalin-fasta paraffin-inbäddat metodik (FFPE). Den senare kräver kritiskt också anti-FP färgning, eftersom FFPE är oförenlig med intakt bevarandet av fluorescerande proteiner (på grund av fixering/uttorkning/rehydrering). Medan fluorescens-signalen är ett tecken på tumör cell närvaro, är det viktigt att säkerställa denna klassificering bekräftas av ex vivo radioaktivitet mätningar av de skördade vävnaderna ('biodistribution'). Ex vivo radioaktivitet mätningar är mer känsliga än visuell identifiering av fluorescens, därmed kan tillåta identifiering av cancer cell-beroende signaler som annars skulle förbli oupptäckta. Vid en terminal imaging session, det är viktigt att noggrant notera de injicerade radiotracer belopp samt tider av radiotracer radioaktivitet mätningar, djur injektion, djur som avlivats och kalibrerad scintillationsräknare mätningar av skördade vävnader. Detta är avgörande för att säkerställa korrigering för radiotracer sönderfall och därmed möjliggöra tillförlitliga biodistribution analys.

PET/CT imaging möjliggör upprepade noninvasiv 3D kvantifiering av tumör progression inklusive bedömning av metastasering på hela kroppen nivå. Denna funktion är en signifikant fördel jämfört med konventionella metoder, som förlitar sig ofta på stora kohorter av djur som är euthanized för bedömning av tumör progression vid varierande tidpunkter. Fördelarna med detta imaging-baserat tillvägagångssätt är: (i) mycket känsliga icke-invasiv 3D i vivo kvantifiering, (ii) en betydande minskning av antalet djur på grund av möjligheten att upprepa imaging, (iii) förvärv av longitudinella kopplade data från efterföljande imaging sessioner att förbättra statistiken genom att utesluta variabilitet, vilket i sin tur ytterligare minskar antalet djur, (iv) automatiserad produktion av [18F] BF4 på hög specifik verksamhet, och (v) den inneboende alternativ för ex vivo bekräftelse i vävnader av fluorescens metoder såsom mikroskopi eller flödescytometri.

In vivo cell tracking är ett växande område. Det har drivits av senaste framsteg i imaging teknik, vilket resulterade i förbättrad upplösning, detektionsgränser och multiplex kapacitet (via multimodal imaging). I detta protokoll tillämpar vi detta koncept för att spåra tumör progression inklusive spontana cancer cell metastaser i 3D genom att upprepa imaging. Tillämpningar inkluderar studier syftar till att nysta upp mekanismer för spontana cancer cell metastaser. Spårbar tumörceller kunde exempelvis användas för att studera effekterna av olika immunceller komponenter (som för närvarande/funktionell i djura stammar av olika nivåer av immunocompromisation) på metastaserad processen. På samma sätt kunde effekten av enskilda gener, antingen i den animaliska stammen eller raden cancer cell, studeras. Dessutom kunde presenteras protokollet användas för att bedöma/validera effekten av specifika läkemedel eller terapeutiska begrepp på tumör progression. Allt detta reporter gen: radiotracer par för PET imaging (NIS: [18F] BF4) kan också användas för annan cell spårningsprogram. Exempelvis finns flera cellterapi för närvarande nya så lovande behandlingsmetoder. Detta inkluderar cellulär therapeutics för cancer behandling41 men också transplantation42 och regenerativ medicin43,44 inställningar. Hela kroppen i vivo cell tracking blir allt viktigare för utveckling och klinisk översättning av cellulära therapeutics, exempelvis för att utvärdera säkerheten och för övervakning av terapi.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Forskningen stöddes av King's College London och UCL omfattande Cancer Imaging Centre, finansieras av Cancer Research UK och EPSRC i samarbete med MRC och DoH (England); National Institute for Health Research (NIHR) Biomedical Research Centre baserat på Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust och King's College London; Centre of Excellence i medicinsk teknik finansieras av Wellcome Trust och EPSRC under grant nummer WT 088641/Z/09/Z; en Cancer Research UK tvärvetenskapliga projekt Award till GOF PJB och en King's Health Partners bidrag till GOF. NanoPET/CT och nanoSPECT/CT scanners köptes och underhålls av en utrustning bidrag från Wellcome Trust. De åsikter som framförs är författarnas och inte nödvändigtvis de av NHS, NIHR eller DoH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. Noninvasive molecular imaging using reporter genes. J Nucl Med. 54, (2), 167-172 (2013).
  3. Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments. J Nucl Med. 55, (4), 686-694 (2014).
  4. Terrovitis, J., et al. Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 52, (20), 1652-1660 (2008).
  5. Seo, J. H., et al. Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation. J Nucl Med. 51, (10), 1637-1643 (2010).
  6. Diocou, S., et al. [18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model. Scientific Reports. 7, (1), 946 (2017).
  7. Lajtos, I., et al. Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom. Phys Med Biol. 59, (11), 2727-2746 (2014).
  8. Nagy, K., et al. Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system. J Nucl Med. 54, (10), 1825-1832 (2013).
  9. Deleye, S., et al. Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, (5), 744-758 (2013).
  10. Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact. Endocr Rev. 35, (1), 106-149 (2014).
  11. Dohan, O., et al. The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev. 24, (1), 48-77 (2003).
  12. Jauregui-Osoro, M., et al. Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (11), 2108-2116 (2010).
  13. Weeks, A. J., et al. Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS. Nucl Med Commun. 32, (2), 98-105 (2011).
  14. Khoshnevisan, A., et al. [(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity. EJNMMI Res. 6, (1), 34 (2016).
  15. Groot-Wassink, T., et al. Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice. Cancer Res. 64, (14), 4906-4911 (2004).
  16. Chen, L., et al. Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene. J Nucl Med. 47, (5), 854-862 (2006).
  17. Sieger, S., et al. Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3). Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30, (5), 748-756 (2003).
  18. Chisholm, E. J., et al. Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles. Cancer Res. 69, (6), 2655-2662 (2009).
  19. Klutz, K., et al. Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Clin Cancer Res. 15, (19), 6079-6086 (2009).
  20. Merron, A., et al. Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (7), 1377-1385 (2010).
  21. Merron, A., et al. SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene. Gene Ther. 14, (24), 1731-1738 (2007).
  22. Dingli, D., et al. Combined I-124 positron emission tomography/computed tomography imaging of NIS gene expression in animal models of stably transfected and intravenously transfected tumor. Mol Imaging Biol. 8, (1), 16-23 (2006).
  23. Carlson, S. K., et al. Quantitative molecular imaging of viral therapy for pancreatic cancer using an engineered measles virus expressing the sodium-iodide symporter reporter gene. AJR Am J Roentgenol. 192, (1), 279-287 (2009).
  24. Barton, K. N., et al. GENIS: gene expression of sodium iodide symporter for noninvasive imaging of gene therapy vectors and quantification of gene expression in vivo. Mol Ther. 8, (3), 508-518 (2003).
  25. Siddiqui, F., et al. Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials. Hum Gene Ther. 18, (4), 312-322 (2007).
  26. Rad, A. M., et al. AC133+ progenitor cells as gene delivery vehicle and cellular probe in subcutaneous tumor models: a preliminary study. BMC Biotechnol. 9, 28 (2009).
  27. Hwang do, W., et al. Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35, (1), 135-145 (2008).
  28. Edmonds, S., et al. Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines. ACS Nano. 10, (11), 10294-10307 (2016).
  29. Zhang, R., et al. Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy. ACS Nano. 11, (1), 249-257 (2017).
  30. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  31. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol. Chapter 20 Unit 20.22 (2001).
  32. Workman, P., et al. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br J Cancer. 102, (11), 1555-1577 (2010).
  33. Foster, B., Bagci, U., Mansoor, A., Xu, Z., Mollura, D. J. A review on segmentation of positron emission tomography images. Comput Biol Med. 50, 76-96 (2014).
  34. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  35. Kinahan, P. E., Fletcher, J. W. Positron emission tomography-computed tomography standardized uptake values in clinical practice and assessing response to therapy. Semin Ultrasound CT MR. 31, (6), 496-505 (2010).
  36. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  37. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J Cell Biol. 163, (2), 257-269 (2003).
  38. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  39. Hume, S. P., Gunn, R. N., Jones, T. Pharmacological constraints associated with positron emission tomographic scanning of small laboratory animals. Eur J Nucl Med. 25, (2), 173-176 (1998).
  40. O'Doherty, J., et al. 18F-Tetrafluoroborate, a PET Probe for Imaging Sodium/Iodide Symporter Expression: Whole-Body Biodistribution, Safety, and Radiation Dosimetry in Thyroid Cancer Patients. J Nucl Med. 58, (10), 1666-1671 (2017).
  41. Couzin-Frankel, J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 342, (6165), 1432-1433 (2013).
  42. Boardman, D. A., et al. Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection. American Journal of Transplantation. (2017).
  43. Rashid, T., Takebe, T., Nakauchi, H. Novel strategies for liver therapy using stem cells. Gut. 64, (1), 1-4 (2015).
  44. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154, (4), 827-842 (2013).
Radionuklid-fluorescens Reporter gen Imaging för att spåra tumör Progression i gnagare tumör modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter