Summary
نهج علامة المستوى الغذائي الأحماض الدهنية، أي استيعاب الأحماض الدهنية كجزيء كامل ونقل الأنسجة المستهلك مع عدم وجود ثانوية أو التعديل، ويعوقها عن الثغرات المعرفية في استقلاب الأحماض الدهنية من اللافقاريات الصغيرة التربة. إيسوتوبولوجوي التنميط يتم توفيرها كأداة قيمة تشابك التفاعلات التغذوية.
Abstract
الأحماض الدهنية (فاس) هي المؤشرات الحيوية مفيدة في الإيكولوجيا الشبكة الغذائية لأنها عادة استيعابهم كجزيء كاملة وتحويلها إلى أنسجة المستهلك مع قاصر أو أي تعديل، مما يسمح توجيه الغذائية بين مختلف المستويات الغذائية. بيد يعوقها نهج العلامة التغذوية اتحاد كرة القدم لا تزال المعرفة المحدودة في الأيض الدهون الحيوانية التربة. هذه الدراسة بلميتيك تماما المسمى (13C16:0، 99 في المائة الذرة) تتبع في مسارات استقلاب الأحماض الدهنية للتربة على نطاق واسع هما Collembola، فيماتا بروتافورورا ونيتيدوس هيتيروموروس. من أجل التحقيق في مصير والتعديلات الأيضية لهذه السلائف، يرد أسلوب التنميط إيسوتوبولوجوي، يؤديها الكتلي باستخدام الرصد أيون واحد. وعلاوة على ذلك، هو وصف للمختبر المنبع تغذية التجربة، فضلا عن استخراج ومثلايشن الكسور المهيمنة في الدهون (الدهون محايدة، فوسفوليبيدات) وصيغة ذات الصلة والعمليات الحسابية. إيسوتوبولوجوي التنميط لا فقط الغلة إثراء 13ج عموما في الأحماض الدهنية المستمدة من 13ج المسمى السلائف بل تنتج أيضا نمط إيسوتوبولوجويس تتجاوز كتلة أيون الأصل (أي أيون الجزيئية اتحاد كرة القدم م+) كل المسمى اتحاد كرة القدم بواحد أو أكثر من وحدات جماعية (M+ 1، M+ 2، M+ 3، إلخ). تسمح هذه المعرفة الاستنتاجات على نسبة التوجيه الغذائية من FA المستهلكة تماما بالمقارنة مع حيثياته الحيوي. التنميط إيسوتوبولوجوي يقترح كأداة مفيدة لتقييم الأيض الأحماض الدهنية في الحيوانات التربة تشابك التفاعلات التغذوية.
Introduction
في موطن خفي مثل التربة، يصعب معالجة العلاقات التغذوية وكذلك مقيدة بصغر حجم الحيوانات. العقد الماضي قد شهد تقدما في الإيكولوجيا الكيميائية الحيوية، لا سيما في استخدام الأحماض الدهنية كالمؤشرات الحيوية لتحديد استراتيجيات تغذية الحيوانات التربة تحت حقل الشروط1،،من23. وهذا يستند إلى حقيقة أن الأحماض الدهنية من الموارد يمكن إدراجها في الأنسجة المستهلك كجزيئات كامل، وصف عملية التوجيه الغذائي4. وذكر نقل الأحماض الدهنية على ثلاثة مستويات غذائية، أي من الفطريات للديدان الخيطية إلى Collembola5. مؤخرا، واعتبرت أن الحيوانات المفترسة6،7 والاستعراضات الأولى على الأحماض الدهنية كعلامات المستوى الغذائي في الشبكات الغذائية التربة قد تم نشر8،9.
معلومات أكثر تفصيلاً عن التفاعلات التغذوية يتحقق بالأحماض الدهنية النظائر المستقرة السبر (اتحاد كرة القدم-المسبار). تحديد 13ج/12ج نسب الأحماض الدهنية في الوجبات الغذائية والمستهلكين يمكن أن تنسب الروابط الثنائية وتقدير تدفق الكربون المرتبطة بها، وقد استخدمت في الأرضية والمياه العذبة، والشبكات الغذائية البحرية10،11 ،،من1213. والافتراض الأساسي أن الأحماض الدهنية الموجه الغذائية لا تخضع العمليات الانزيمية؛ ولذلك، على 13ج إشارة، أي 13ج/12ج نسبة الأحماض الدهنية، في المستهلك مشابه لذلك في النظام الغذائي1. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن استنفاد تدريجي لتوقيع 13ج في سلسلة الغذاء في النظم المائية، مما يعرقل تطبيق FA-المسبار على نطاق واسع في الدراسات التغذوية14،،من1516. وعلاوة على ذلك، المعرفة في استقلاب الدهون في معظم اللافقاريات في شبكات الأغذية الأرضية ما زالت محدودة.
فهم مسارات الأيض الدهني في المستهلكين ضروري لاستخدام الأحماض الدهنية علامة المستوى الغذائي كوسيلة لتحديد تدفق كمية الكربون في الإيكولوجيا الشبكة الغذائية. مع وضع هذا في الاعتبار، 13ج-إيسوتوبولوجوي التنميط، يمكن تطبيق المبدأ الذي في التحقيق في استقلاب الكربون من أي نظام بيولوجي17، أسلوب يبشر بالخير. عقب إدخال الركازة الكربون المسمى ج 13، توزيع 13ج في شبكة الأيضية يمكن تتبعها منذ المنتجات الأيضية التي تم إنشاؤها في إظهار المستهلك بتوزيع إيسوتوبولوجوي محددة. يمكن تقييم هذا التحليل الطيفي الكمي الرنين النووي الأيضية18،19 أو الكتلي20،21، مع العينات البيولوجية يفضل في الأخير مع الكتلة الحيوية منخفضة بسبب لها أعلى حساسية.
على الرغم من أن التنميط إيسوتوبولوجوي بنجاح طبق للأحماض الأمينية وتوفر نظرة ثاقبة في فيفو استقلاب الكربون من مسببات الأمراض البكتيرية17،،من2223، تنفيذه في الدهنية وقد تخلفت الأحماض. أول تحليل مفصل عن مصير النظائر المستقرة التي تسمى الأحماض الدهنية السلائف والغذائية التوجيه أو التدهور عن طريق الأكسدة بيتا، في التربة المستهلكين اللافقاريات، أنجز مؤخرا بمنزل et al. 24-وترد هنا، أساسيات المنهجية لإدماج التجارب مع 13ج المسمى الأحماض الدهنية التي يتبعها التحليل إيسوتوبولوجوي من أحفاد الرئيسية في التربة متكررة اللافقاريات، Collembola،. هذه ميكروارثروبودس مجموعة نموذجا جيدا كما أنها تشكل عناصر هامة في الشبكة الغذائية للتربة وهي كذلك التحقيق على علامة المستوى الغذائي الأحماض الدهنية8،25.
فهم مسارات الأيض الدهني في المستهلكين ضروري لاستخدام الأحماض الدهنية علامة المستوى الغذائي كوسيلة لتحديد تدفق كمية الكربون في الإيكولوجيا الشبكة الغذائية. يعطي هذا البروتوكول بتصميم وإعداد لمختبر تغذية التجربة، والبيوكيميائية إجراءات استخراج ومثلايشن من الكسور المهيمنة الدهون (الدهون محايدة، فوسفوليبيدات) من Collembola. فإنه يوضح كيف يتم تحليل تكوين إيسوتوبولوجوي الأحماض الدهنية بالطيف الكتلي وتوضح الصيغة ذات الصلة والعمليات الحسابية. ينتج عن هذا الإجراء: (ط) نسب إيسوتوبولوجويس تتجاوز كتلة أيون الأصل (أي أيون الأحماض الدهنية الجزيئية م+) واحد أو أكثر الكتلة وحدات (M+ 1، M+ 2، M+ 3، إلخ) و (ii) الشاملة 13 ج الإثراء في الأحماض الدهنية المستمدة من السلائف توسم 13ج. على الرغم من أن يستخدم Collembola، هذا النهج يمكن تطبيقها عموما على أي تفاعل الفرائس الأخرى على فرضية أن هذه كولتورابل في كمية كافية تحت ظروف خاضعة للرقابة لضمان امتصاص تسمية ناجحة واللاحقة التحقق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول وصف لا تقع تحت الاختصاص من "أخلاقيات الحيوان". ومع ذلك، العناية عند تكييف الناس وصف بروتوكولات الحيوانات العليا، أن وافقت اللجنة "الحيوان الأخلاقيات" المؤسسية في البروتوكول للتعامل مع الحيوانات.
1-زراعة الحيوانات
ملاحظة: جميع شرح الخطوات التجريبية تستند إلى بروتوكولات راسخة26،،من2728. بيوتيستس في المختبر بحاجة إلى إمدادات مستمرة من الكائنات كولتورابل بسهولة. هنا، وقد استخدمت هذه الأنواع Collembola فيماتا بروتافورورا (جيسين، 1952) نيتيدوس هيتيرموروس (تمبلتون، 1835). كل الأنواع بسيطة للحفاظ على كثقافات المختبرات المنتجة التي تتغذى على بيكر للخميرة.
- في ميكروكوسمس بلاستيكية بأغطية مناسبة ضيق (قطرها 7 سم، ارتفاع 4.5 سم) وإضافة خليط فحم المنشط، جص باريس، والمقطر المياه لتوفير ركيزة خصبة جداً رطبة (الشكل 1A).
- عند إعداد مزيج ميكروكوسمس ما يكفي من الركازة، مثلاً، ميكروكوسمس 10 في دفعة. أجزاء 9 مزيج من الجص باريس (225 غ) والجزء 1 من جفاف الفحم المنشط (25 غ) معا في وعاء من جص، إضافة بعناية نحو 10 أجزاء من الماء المقطر (250 مل) والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق دون إثارة في درجة حرارة الغرفة.
- يقلب بملعقة معمل بسرعة معتدلة في اتجاه عقارب الساعة لتجنب فقاعات الهواء حتى يتحقق اتساق الرغوية سميكة. تصب مباشرة في ميكروكوسمس بارتفاع حوالي 1 سم.
- بالتنصت على مقاعد البدلاء لطيف ويحوم على نحو سلس الجص. علما بأن الثقوب (منتجات عشوائية من فقاعات الهواء) والشقوق (أضيف بنشاط مع ملعقة معقمة) قد يشجع Collembola خصبة تضع بيضها هناك. تجنب هذه الدراسة الثقوب والشقوق صالح بعد استنساخه بنفس الشروط. ومع ذلك، يعرض الشكل 1B لأغراض العرض التوضيحي بعض الثقوب.
- السماح لتجفيف لحوالي 1-2 أيام في درجة حرارة الغرفة؛ الحضانة عند 60 درجة مئوية قد يقلل ذلك الوقت إلى ح 1-2.
- ترطيب ميكروكوسمس قبل الاستخدام بإضافة ماء الصنبور مع ماصة حتى الركيزة مبللة قليلاً. تبقى مصغراً رطبة بإضافة الماء المقطر بانتظام كما Collembola بشرة ناعمة، وهو عرضه للجفاف.
- نقل Collembola بسهولة إلى قاعدة الجص استخدام أنبوب شفط بسيطة، أي أنبوب سيليكون طويل حوالي 25 سم طويلة مع تلميح ماصة مزودة بشبكة صغيرة لمنع شفط حيوانات في الأنبوب. وبدلاً من ذلك، نقل الحيوانات بالسماح لهم بالانضمام في شعيرات فرشاة صغيرة.
- نقل (راجع الخطوة 1، 2) 30 طازجة فقست Collembola إلى ميكروكوسمس جديدة وتوفر حبيبات الخميرة الشعبية بيكر الجافة كغذاء (حول تلميح سكين) (الشكل 1B)؛ تجديد على الأقل مرتين في أسبوع. الخطة ثلاثة مستقلة وإنشاء نسخ متماثلة يوميا أخذ العينات؛ في هذه الدراسة أيام 0-7 و 14. احتضان عند 15 درجة مئوية في الظلام. يتم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة ومن الضروري، الأحماض الدهنية يغير الأيض الحيواني الوفاء بمتطلبات السيولة الغشاء.
- تغذية Collembola مع بيكر للخميرة لمدة أربعة أسابيع قبل بدء تجارب التعرض للحصول على متجانسة 13ج/12ج إشارة ونمط في الأحماض الدهنية. استخدام أنبوب شفط أو فرشاة لإزالة جميع البيض (الشكل 1)، الكريات البراز، واكسوفياي بانتظام كالحيوانات قد تتغذى عليها وبالتالي تغيير صورتهم الدهن.
رقم 1: زراعة Collembola. (أ) صورة مصغرة مليئة بتربية الركازة، وخليط مجفف من باريس الجبس والفحم المنشط والماء المقطر. (ب) و (ج) عينة تمثيلية من ثقافة فيماتا بروتافورورا ؛ ملاحظة شذرات صغيرة من الخميرة الجافة بيكر لاستخدامه كمصدر للغذاء، وأيضا كالثقوب في الركيزة تربية (السهم الأسود) (ب) فضلا عن اثنين من البيض (السهم الأبيض) (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
2-وضع العلامات النظام الغذائي، والحصاد، والتعامل مع عينة
- وضع العلامات
- أربعة أسابيع بعد إنشاء ثقافات Collembola، ضع كل 30 شخصا في ميكروكوسمس الجديدة واحتضان عند 15 درجة مئوية في الظلام.
- عرض التسمية النبض باطعامهم الخميرة بيكر الذي يحتوي على تماما 13ج المسمى بلميتيك (13C16:0، 99 في المائة الذرة) بخلط حمض النخليك المسمى ج 13مع بيكر للخميرة مع ملعقة في نسبة 0.5:1، مثلاً، 5 غ 13 C16:0 و 10 جرام الجاف خميرة بيكر. ضع حول تلميح سكين على كل مصغر.
- بعد ح 6، يحل محل هذا المسمى الغذاء مع بيكر غير مسمى تماما للخميرة.
-
زراعة مزيد
- وأثناء التجربة تجديد النظام الغذائي الخميرة كل ثلاثة أيام وإضافة مبالغ تزيد على ما سوف تستهلك Collembola خلال تلك الفترة. الأهم من ذلك، استخدام أنبوب الشفط أو فرشاة لإزالة كوليمبولان البيض والكريات البراز واكسوفياي بانتظام لضمان تغذية الحصري بالحيوانات على الطعام المتوفر.
- الحصاد
- عينة ميكروكوسمس مدمر يوميا حتى يوم 7. ثم في يوم 14، جمع ثلاثة replicates مستقلة في كل وقت أخذ العينات؛ مرات أخذ العينات المختلفة الممكنة.
- إعداد أنابيب زجاجية 10 مل مزودة بالاغطية اللولبية تفلون المغلفة، واحدة لكل عينة. مسبقاً تنظيف هذه الأنابيب في غسالة الأواني زجاجية وشطف مرتين بالمياه بعد ذلك. وأخيراً، لإزالة أي آثار مسعور الملوثات يغسل مرتين بإضافة 2 مل كلوروفورم ([هبلك] الصف)، دوامة تقريبا وتجاهل المذيب.
- لمراقبة أخذ العينات (يوم 0)، 3 30 Collembola غير مكشوف من ثقافات ما قبل كعينات اليوم 0.
- لعينات المكشوفة (اليوم 1 وما بعدة)، تتخذ بالنسبة للعينات اليومية في كل حالة 3 30 تعرض Collembola من الثقافات العولم تغذية مع المزيج من حمض النخليك المسمى ج 13والخميرة الشعبية بيكر.
- تسجيل الوزن الطازج Collembola الترا-ميكروبالانسي. نقل الحيوانات استخدام مصاصة أو فرشاة للأحواض الحجم المناسب. لضمان سهولة التعامل من Collembola أثناء وزنها في النطاق الأحواض، الحيوانات صدمة باردة قبل (-80 درجة مئوية ح 2). وبدلاً من ذلك، يمكن بأمان صاعقة تيار2 CO لمدة 10 دقائق الحيوانات.
- وزنها مباشرة بعد وضع الحيوانات من المقياس-كعك بعناية في 10 مل زجاج أنابيب الاختبار. ملء الأنابيب مع 1 مل من الميثانول ([هبلك] الصف) ومخزن في-20 درجة مئوية حتى التحليل.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، تجنب التعامل مع عينة مع معدات البلاستيك كما تشارك المذيبات العضوية؛ بدلاً من ذلك استخدام موزعات والماصات التي تصلح للمذيبات وكذلك الأوعية الزجاجية.
3-الدهن الاستخراج من الأنسجة الحيوانية وميثانوليسيس
- إعداد ثلاثة الزجاج-أنابيب الاختبار (مجهزة بأغطية المسمار تفلون المغلفة) كل مجموعة التي تحتوي على فقط 1 مل ميثانول كقيم فارغة. الأهم من ذلك، إضافة أو نقل أي المذيبات المستخدمة في هذا البروتوكول إلا من خلال الزجاج الماصات أو كلوروفورم/الميثانول تشطف موزعات المقاوم للمذيبات.
- في بداية عملية استخراج الدهن، الحد من الميثانول تطبيقها للتخزين (أو تقطيع) عن طريق التبخر؛ ويوصي من benchtop مدمجة مركزات فراغ التناوب (RVC) مزودة بمضخة فراغ وفخ باردة. نقل أنابيب مفتوحة إلى RVC وتتبخر حتى الجاف عند ضغط 50 درجة مئوية، والفراغ من hPa 200 لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 5 مل مذيب الاستخراج على مرحلة واحدة (1:2:0.8 العازلة فوسفات chloroform/methanol/0.05 م، ودرجة الحموضة 7.4) لكل عينة (بما في ذلك الفراغات)، واستخراج الدهون كوليمبولان في درجة حرارة الغرفة بالمصافحة بين عشية وضحاها (~ 200 لفة في الدقيقة).
- نقل المذيب لأنابيب جديدة وإعادة استخراج عينات من الهز ح 3 مع مل 2.5 إضافية لاستخراج المذيبات. وبعد ذلك، تجمع بين مقتطفات من كل الخطوات؛ يوصي باستخدام الزجاج الماصات باستور. إضافة 0.8 مل كلوروفورم و 0.8 مل من الماء المقطر، ثم تخلط والطرد المركزي في ز 2,000 في 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وأخيراً، تسمح العينات إلى الوقوف لمدة 5 دقائق لفصل مائي كلوروفورم المراحل.
- لتحليل أنماط الأحماض الدهنية، تقسيم الدهون الخلوية مجموع من Collembola إلى المادة الدهنية محايدة وشحمي سكري والكسور فسفوليبيد.
- لكل عينة، وإعداد عمود حمض السيليكا (العمود التجاري مع حمض السليكى ز 0.5، مش حجم 100-200 ميكرومتر، انظر الجدول للمواد) بإضافة 1 مل كلوروفورم (حدد). لتسريع هذه العملية، جبل الأعمدة على كتلة فراغ كما يشيع استخدامها في الفصل اللوني لاستخراج المرحلة الصلبة. عدم استخدام الإبر النايلون؛ استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ أعلى الأنابيب.
- بعد كلوروفورم المستخدمة ل preconditioning مرت نقل العمود في مرحلة كلوروفورم السفلي كاملة لكل عينة لعمود فردي. لتبسيط هذا الإجراء، يمكن إزالة المرحلة المائية العليا مسبقاً. استخدام الماصات باستور من الزجاج، ومع ذلك، والعناية بأن الأعمدة لا تجف.
- تباعا الوت الكسور الدهن مع 5 مل كلوروفورم (بما في ذلك المادة الدهنية محايدة الأحماض الدهنية، نلفاس)، 10 مل من الأسيتون (جليكوليبيدس--لم يتم تحليلها في هذا المشروع) و 5 مل من الميثانول (بما في ذلك الأحماض الدهنية فسفوليبيد، بلفاس). جمع كل جزء في الأوعية الزجاجية الفردية.
- في نهاية الاستخراج، تخفيض كلوروفورم (نلفاس) والميثانول (بلفاس) عن طريق التبخر في RVC. نقل أنابيب مفتوحة إلى RVC وتتبخر حتى الجاف، ~ 90 دقيقة في 60 درجة مئوية وفراغ من 24 hPa.
- بدء تصبن الدهون (نلفا وبلفا الكسور) يتبع البروتوكول من وولش (1991)29 مع إضافة 1 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم-الميثانول (45 غ هيدروكسيد الصوديوم و 150 مل من الميثانول و 150 مل من الماء المقطر) واحتضان في 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي. بارد العينة في المياه الجليدية لمدة 2 دقيقة، ثم وضع العينات مرة أخرى على مقاعد البدلاء ومواصلة العمل في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة معيار داخلي لكل عينة بما فيها الفراغات. اختر الأحماض الدهنية ليست شائعة في الكائنات الحية التجريبية؛ أيضا استخدام الأحماض الدهنية مشبعة لتقليل الخسارة بالانقسام وحدد جزيء مع طول سلسلة الوسيطة. لأغراض عديدة، يعمل حمض (19:0) الوترية نوناديكانويك جيدا. لذا، إضافة 30 ميليلتر من حل 0.74 ملم في إيسوكتاني. كمية الدقيق مهم جداً--تأكد من فحص دقة الخاص بك ماصة مع ميكروبالانسي مقدما.
- إضافة 2 مل من حمض الهيدروكلوريك-الميثانول (ميكس 325 مل حمض الهيدروكلوريك ن 6.0 مع مل 275 من الميثانول)، واحتضان عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في حوض ماء وباردة سريعاً على الجليد لمدة 2 دقيقة. هذه الخطوة هي الوقت ودرجة الحرارة الحساسة؛ استخدام 80 ± 1 درجة مئوية و 10 ± 1 دقيقة الاختيار مع عينات كثيرة كيف يمكن الذهاب إلى حوض ماء في وقت واحد للحفاظ على 80 درجة مئوية.
ملاحظة: نتائج هذا الإجراء في الأحماض الدهنية استرات الميثيل (الشهرهشهره)، أي، تحليلها الأحماض الدهنية التي استقرت للتبخير في الفصل اللوني للغاز. - وأخيراً، إضافة 1.25 مل الهكسين/الميثيل بوتيل العالي خماسي البروم ثنائي الفينيل (1:1) وإزالة الصخور بلطف ل 10 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 2,000 ز للحد الأدنى 5 في المرحلة السفلي وتبقى مرحلة أعلى يتألف من الشهرهشهره؛ استخدام الزجاج الماصات باستور. أضف 3 مل هيدروكسيد الصوديوم المائية (10.8 غرام من هيدروكسيد الصوديوم المذابة في 900 مل ماء المقطر) لخطوة غسيل.
- موسيقى الروك وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
- تأخذ كامل العلوي المحتوية على الدهن مرحلة استخدام الزجاج ماصة باستور ونقل إلى قنينة نموذج الفصل لوني للغاز مجهزة حاجز تفلون. تجنب بما في ذلك كميات صغيرة حتى المرحلة المائية، وأن هذا سوف يسبب مشاكل مع قياس GC. تغليف القنينة وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى التحليل.
4-التحديد الكمي للأحماض الدهنية التي GC FID
- استخدام الفصل اللوني للغاز لتحديد وتقدير حجم الشهرهشهره في الكسور نفلا وبلفا الدهون Collembola (الحيوان). الغاز اللوني (GC) مجهزة مكشاف تاين الاشتعال (FID) هو معدات ثابتة ومجربة30.
- لتحديد الشهرهشهره، قارن الاحتفاظ بوقت الذروة في العينة لتلك الموجودة في معيار شهرة. هذه خليط القياسية النوعي أو الكمي لمفتاح الشهرهشهره تغطي مجموعة متنوعة من المنتجات الغذائية والكائنات الحية.
- وتستخدم المزائج الشهرة القياسية تتألف من ممثل منظمة تضامن النساء الأفريقيات لفريق التحقيق في الكائن الحي والحمية التجريبية. في Collembola، هذه خصائص الأحماض الدهنية حقيقيات النوى، مثلاً، سلسلة طويلة الأحماض الدهنية المشبعة مثل حمض اراسيدونيك (20:4ω6). عند استخدام الخميرة كالنظام الغذائي وهذه علامات الفطرية مثل حمض اللينوليك (18:2ω6). حسن اختيار هو ما يسمى المزيج الشهرة، تتألف من 37 من الأحماض الدهنية المختلفة المتكررة في الحيوان، والفطريات وخلط المواد النباتية، واستر الميثيل حمض البكتيرية (بام) (انظر الجدول للمواد).
- لتشغيل هذه العينات على GC-FID، إعداد تسلسل مع البرمجيات الخاصة بكل منها للصك. للحصول على إرشادات، الرجوع إلى الدليل الخاص بالشركة المصنعة. ويبدأ التسلسل الخلائط الخارجية القياسية (مثل الشهرة ومزيج بامي)، تليها العينات. علما أن هناك تحولاً وقت استبقاء أي تأخير بسيط في وقت شطف من الأحماض الدهنية من العمود GC مع كل تشغيل أثناء تشغيل عينات! أما تضمين معيار كل 10th تشغيل في تسلسل نموذج أو استخدام الوقت الاحتفاظ تأمين لحمض النخليك (16:0).
- التكيف مع إعدادات GC تعتمد على الصك. ويقترح البرنامج التالي لعمود شعرية عالية أداء (HP) (25 م × 0.2 مم i.d., فيلم سمك 0.33 ميكرومتر. حقن تعيين وحدة التخزين إلى 1 ميليلتر في وضع سبليتلس واستخدام الهيدروجين كالغاز الناقل. توظيف بداية برنامج درجة حرارة على 50 درجة مئوية (عقد لمدة 1 دقيقة)، وزيادة من 25 درجة مئوية دقيقة-1 إلى 175 درجة مئوية، تليها 3 درجة مئوية دقيقة-1 إلى 230 درجة مئوية (عقد لمدة دقيقة 5.7).
- حساب الأحماض الدهنية نمول كل غرام وزن (الجاف) جديدة من الكائنات باستخدام الاستجابة التي حصلت عليها FID للشهرة كل تطبيق المبالغ المعروفة للأحماض الدهنية كل منها باستخدام الصيغة التالية:
الشهرة: منطقة الذروة من شهرة كل منهما في العينة
ميغاواطFM: الوزن الجزيئي لكل منهما وشهرة في ميكروغرام/µmol
جهي: تركيز القياسية الداخلية في ميكروغرام
هي: منطقة ذروة مستوى الداخلية
مCol: الوزن (الجاف) جديدة لكل عينة Collembola في ز
1000: معامل التحويل من µmol نمول
جالأسلحة البيولوجية: تركيز كل منهما وشهرة في متوسط القيم الفارغة المقابلة في نمول
5-تحليل 13ج بالتنميط إيسوتوبولوجوي
- استخدام نظام GC مقترنة إلى الجماهيري انتقائية كاشف (MS) المتوفرة مع مصدر تاين (الصناعات الاستخراجية) إلكترون لتحديد إيسوتوبولوجوي.
- استخدام عمود شعري قطبية (مثلاً DB 23، 88 CP-سيل) كما يسمح هذا زيادة الفصل بين الأحماض الدهنية غير المشبعة حتى مع نفس أرقام سندات مزدوجة. اختيار العمود GC حاسم بالنسبة للنتائج كما أنه يحدد تمثيل جيد لايون الجزيء في الأحماض الدهنية.
- لعمود DB 23 (60 م × 0.25 مم الهوية، وفيلم سمك 0.15 ميكرون) وتبدأ درجة حرارة الفرن 130 درجة مئوية ونسبة 6.5 درجة مئوية/دقيقة إلى 170 درجة مئوية. اتبع مع زيادة قدرها 3 درجة مئوية/دقيقة إلى 203 درجة مئوية وعقد 1.9 دقيقة اتبع مع زيادة قدرها 40 درجة مئوية/دقيقة إلى 230 درجة مئوية، وعقد لنقل مجموعة 8.3 دقيقة خط درجة الحرارة إلى 280 درجة مئوية. مرة أخرى، قم بضبط الأسلوب GC للصك.
- استخدام المعايير الكمية تضم كميات معروفة من الشهرهشهره لجميع الأحماض الدهنية للتحقيق لإدراج 13ج. وضع هذه المعايير في بداية ونهاية كل تسلسل نموذج تشغيل. أن زمن الاحتفاظ بالأحماض الدهنية للفائدة من هذه المعايير.
- قياس عينات من التجارب دائماً بدءاً بالعينات غير مسمى، وتحقيقات المسمى بعد ذلك. تطبيق نسبة تقسيم مناسب لتركيزات عينة، مثلاً 1:12.5.If المتاحة للصك، تنطبق باكفلوش مع الهليوم بعد كل عينة تشغيل لإلغاء إيقاف عمود من تحليلها المتبقية.
- تطبيق وقت الاحتفاظ تأمين إلى الأسلوب GC-MS حيث أن اقتناء سيم لا يعاني من التحول، وهناك أوقات استبقاء أكثر استنساخه.
- تحديد تضمين 13ج أيون الجزيئية من الأحماض الدهنية قبل GC/الصناعات الاستخراجية-MS استخدام أيون المحدد مراقبة الوضع (SIM) من الصك. تشغيل في وضع سيم يسمح للكشف عن تحليلها محددة مع زيادة الحساسية بالنسبة إلى وضع التفحص الكامل.
- تشغيل المسح الضوئي عبر أولى أولاً لمعرفة ما هو هذا، ثم قم بتشغيل SIM على أيونات المناسبة. الحصول على البيانات في الجماهير الجزيئية للاهتمام بتحديد m/z مسح windows (مجموعات سيم) يشمل وقت الذروة الكروماتوغرافي الأحماض الدهنية الخاصة بكل منها. بشكل عام، رصد اثنين إلى أربعة أيونات كل إطار أكثر والوقت.
- وبغية زيادة الحساسية وضبط معدل المسح الشامل ويسكن مرات (الوقت الذي يقضيه تبحث في كل كتلة). يتم الحصول على أفضل جودة البيانات بأقل سرعة ممكنة، وعموما القاعدة في سيم مسح 8 إلى 12 خلال ذروة أكثر. وكيل لإعدادات أداة وقت يسكن متوسط كل كتلة ms 9، وقت دورة 6 s ووقت المسح الضوئي ل سيل 175 ms-1.
- الكشف عن أيون الجزيئية (م+) الأحماض الدهنية منها وجميع إيسوتوبولوجويس به (M+ 1، و M+ 2 ، وهكذا). للحصول على أمثلة، راجع نتائج الممثل.
- سجل الوفرة من كل جزء أيون (إيسوتوبولوجوي). علما أن وفرة أيون الجزيء وبه إيسوتوبولوجويس منخفض نسبيا ونوعية الكمي يعتمد إلى حد كبير على أداء نظام MS. تشغيل نغمة قبل بدء تسلسل عينة كبيرة (التجربة) وتنظيف المصدر أيون إذا لزم الأمر.
ملاحظة: أولاً، هذه البيانات العائد الإجمالي 13ج الفاسدون من كل الأحماض الدهنية بالسلائف المستهلكة (هنا 16:0). - استخدام نسبة تركيبة النظائر المسمى الأحماض الدهنية من نظرائهم غير مميزة لتعيين تدفق الكربون التغذوية. استخدام الصيغة % ذرة في الخطوة 6، 1 لحساب النسبة المئوية للكربون المسمى (% ذرة، ذرة ٪) في الأحماض الدهنية الخاصة بكل منها. مقارنة النسبة المئوية ل 13ج في الأحماض الدهنية من Collembola بين المسمى (اليوم 1 والإصدارات الأحدث) والحيوانات غير مسمى (يوم 0) كمؤشر نسبي لتدفق 13ج من النظام الغذائي إلى المستهلك.
- تعيين موضع إدراج 13ج في سلسلة الأحماض الدهنية. على أساس التوزيع لتشابك إيسوتوبولوجويس التوجيه الغذائي للأحماض الدهنية الراسم ملحوظ كامل (هنا 16:0) من استطالة السلسلة بدهن الأيض. في حين يزيد الاستيعاب جزيء علامة كامل وفرة إيسوتوبولوجويس الأبعد لايون الأصل (م+)، مثلاً، M+ 15، م+ 16، مع استطالة السلسلة بالاستخدام 13ج المسمى C2 الأجزاء (13ج البيروفات) الحصول على إيسوتوبولوجويس القرب من أيون الجزيئية أكثر تواترا.
6-العمليات الحسابية لتخصيب 13ج
- وفقا لتوزيع إيسوتوبولوجويس، حساب النسبة المئوية الإجمالية للكربون المسمى (في ذرة ٪) في الأحماض الدهنية كل منها باستخدام العلاقة التالية: ذرة % = (نسبة 13ج إيسوتوبولوجوي أدرجت) x (التردد إيسوتوبولوجوي كل منهما)
ويحسب هذا بعد كوباردت et al. 31 حسب:
حيث N هو عدد ذرات الكربون في الأحماض الدهنية، ي عدد النظائر 13ج، م + J هو الوفرة من إيسوتوبولوجوي الخاصة بكل منها، و T إجمالي الوفرة من جميع إيسوتوبولوجويس. - للحساب، جمع القيم منطقة الذروة لايون الجزيئية (م+) اتحاد كرة القدم في كل وجميع إيسوتوبولوجويس (M+ 1م+ 2وهكذا)، الكشف عنها بواسطة تحليل سيم--مرض التصلب العصبي المتعدد، وتعيين إلى الوفرة النسبية 100%. حساب الجزء من كل إيسوتوبولوجوي تم الكشف عنها بسهولة باتباع القاعدة من ثلاثة.
- طرح قيمة عنصر التحكم غير المسمى اليوم 0 (الخلفية الطبيعية 13ج) من القيم التجريبية للحصول على البيانات النهائية ترجع فقط إلى أداء خارجي 13ج-وضع العلامات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
محتوى جديد الوزن والدهن من Collembola
أثناء التجربة وصف المحتوى الموجود في نلفاس وبلفاس لم تتغير كثيرا مع مرور الوقت، بينما وزن العينات الطازجة زيادة طفيفة ولكن ليس إلى حد كبير24. كلا المعلمتين تشير إلى مستوى جيد من اللياقة البدنية للعينات Collembola. كن على علم بالتحقيق محتوى ل Collembola الوزن والدهن الطازج طوال التجربة المقابلة لأيام أخذ العينات للأحماض الدهنية وتحليل النظائر. علما أن فقدان الوزن و/أو انخفاض محتوى الدهون خلال الفترة التجريبية تشير إلى انخفاض اللياقة بدنية للكائن الاختبار وتفقد البيانات المشتقة كبير أهمية.
كشف إيسوتوبولوجوي
وتكمن أهمية إيسوتوبولوجوي التنميط المشاريع الخاصة في الكشف عن الفردية والتحديد الكمي لايون الجزيئية وجميع إيسوتوبولوجويس في الأحماض الدهنية محددة. على سبيل المثال، في حالة 16:0 الأيونات تتراوح بين 270، أي، الجزيئات أيون م+ (ج هيكل عظمى تتكون أساسا من ذرات ج 12) 286 (إيسوتوبولوجوي م+ 16 -سلسلة الكربون تماما محل الثقيلة 13ج). ويعرض الشكل 2A طيف سيم--مرض التصلب العصبي المتعدد من محض 16:0, بلميتيك. وفرة الطبيعية 13ج في هذا المركب يصبح يمكن كشفها بوجود M+ 1 و M+ 2 إيسوتوبولوجويس بالإضافة إلى أيون الجزيئية (م+). وعلى سبيل المقارنة، يبين الشكل 2B الطيفية لحمض النخليك تماما المسمى (ذرة 99% 13ج) المستخدمة في هذه الدراسة. هنا، يعبر عن التواجد الوحيد ل أيون م+ 16 نقاء عالية لهذا المسمى صناعيا مجمع.
رقم 2: مسح سيم الممثل نقية حمض النخليك (A) غير مسمى والمسمى (ب) تماما. ملاحظة الطبيعية وفرة M+ 1 و M+ 2 إيسوتوبولوجويس بالإضافة إلى أيون الجزيئية (م+) في ج غير مسمى 16:0 (A) لكن وجود الحصرية من إيسوتوبولوجوي+ 16 م في الأحماض الدهنية تماما المسمى (ذرة 99 % 13ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
استطالة/عدم التشبع، في مقابل دي نوفو التوليف
بعد الحصاد اختبار الكائنات الحية، واستخراج الدهن و derivatization، الشهرهشهره الذي تم إنشاؤه على استعداد ليتم تحليلها بواسطة GC وسيم--مرض التصلب العصبي المتعدد. قبل دراسة التنميط البيانات إيسوتوبولوجوي، واحد يمكن الآن التمييز بين التوليف حيثياته وعدم التشبع/استطالة أحداث الأحماض الدهنية علامة المسمى كامل. السابقة يمكن أن يحدث، على الأقل جزئيا، استناداً إلى 13"ج أسيتيل" كمنتج لتدهور السلائف المسمى عن طريق بيتاوكسيديشن. ويبين الشكل 3 أمثلة مستمدة من أربعة الأحماض الدهنية السائدة في كسر بلفا H. نيتيدوس في أول يوم أخذ العينات بعد وسمها بمسح سيم. استيعاب للجزيء علامة توسم في حمض النخليك يصبح مرئياً بوفرة م+ 16 -إيسوتوبولوجوي، كما أنها تمثل الأحماض الدهنية تماما المسمى (الشكل 3 ألف -16:0). علاوة على ذلك، عدم التشبع من 16:0 (الشكل 3B -16:1ω7) أو استطالة بالإضافة إلى عدم التشبع (الشكل 3 -18:1ω9، الشكل 3D -20:4ω6) يمكن تعيينها. وبالتالي، إثبات الكشف عن إيسوتوبولوجويس أكبر من M+ 16و مثل M+ 17 م18 استطالة سلسلة من السلائف توسم 16:0 باستخدام 13C2-الشظايا. تتم الإشارة إلى حيثياته الحيوي استناداً إلى 13"ج البيروفات" من الأحماض الدهنية إذا إيسوتوبولوجويس قريبة من أيون الجزيئية، أي، M+ 1 إلى M+ 2 الحصول على كثيرا أكثر تواترا مما في عنصر التحكم الذي يمثله أخذ العينات اليوم 0.
الشكل 3: سيم الممثل (رصد أيون مختارة) مسح من الأيونات جزء في الأحماض الدهنية من نيتيدوس هيتيروموروس (بلفا الكسر، يوم 1 بعد وضع العلامات). حمض النخليك (A) (16:0) حمض Palmitoleic (ب) (16:1ω7) (ج) حمض الأولييك (18:1ω9)، و (د) حمض اراسيدونيك (20:4ω6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
كذلك توضح هذا، الرقم 4 يقارن نمط إيسوتوبولوجوي الأولى من الأحماض الدهنية المسماة الأكثر شدة خمسة (حلل في بلفاس ونلفاس على السواء)؛ مقارنة بالبيانات من الأنواع Collembola P. فيماتا على واليوم 0 1. في اليوم 1، استند إشارة ج 13في C16 وفاس C18 كلياً تقريبا وقوع أيون الجزيء+ 16م، الناتجة عن المسمى تماما 13ج 16:0، تكملة للمواد الغذائية. كما سبقت الإشارة إلى ذلك، لوحظت آثار M+ 18 18:0 و 18:1ω9 تشير إلى الأخذ بنسبة طفيفة من 13"أسيتيل ج" عن طريق استطالة سلسلة من 16:0 18:0. ل 18:1ω9 هذا كان أكثر وضوحاً في فصيل بلفا. هذه 13ج أسيتيل مستمد من بيتا--الأكسدة المسمى 13ج 16:0 الجزيئات. إدراج 13ج البيروفات كما حدث في استطالة الخطوة من طول السلسلة C18 إلى C20، كما عهدت بها 20:4ω6 عينات بلفا. وبالتالي، إثراء 13ج في م+ 16 و M+ 18 زيادة كبيرة مع مرور الوقت حتى يوم 14 (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، زادت M+ 2 من هذا 20:4ω6 بلفا في يوم 14 عند مقارنتها باليوم 0 أو 1. هذا تخصيص 13ج في إيسوتوبولوجويس مختلفة تشير إلى أن تشكيل 20:4ω6 يرتكز على توليف حيثياته مع إدراج أسيتيل المسمى مع 13ج أو في الوفرة الطبيعية 13ج عدم التشبع في استطالة جزيء السلائف C16:0 كامل 13. وفي المقابل، لم تظهر واضح المسمى 20:4ω6 في الكسر نلفا (الشكل 4).
الشكل 4: إيسوتوبولوجوي نمط التأسيس 13ج سيم (رصد أيون مختارة)- قدم من أجزاء النسبية ل الأيونات M+ 1 إلى M+ 3 و M+ 16 إلى M+ 20 خمسة نلفاس وبلفاس المسمى بشدة أكثر من فيماتا بروتافورورا، المقدرة في اليوم 0 ويوم 1. فقط من أجل 20:4ω6 يتم عرض البيانات يوم 14 وبالإضافة إلى ذلك. ف< 0.05 (الاختبار دونيت مع البيانات اليوم 0 المستخدمة كمرجع). وهذا الرقم إعادة طبع الرقم 5 نشرت في منزل et al. 24 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إيسوتوبولوجوي التنميط
تحليل مفصل للجوانب الكمية في توزيع 13ج في فاس يحتاج إلى التكنولوجيا المتطورة لتعيين الكربون التقسيم في الشبكات الغذائية. يعمل هذا العمل إيسوتوبولوجوي التنميط لتقييم ال 13ج/نسب12ج في المؤشرات الحيوية فا المشترك لتفاعلات طردية. هذا الأسلوب هو راسخة لتحليل الأحماض الأمينية اللوني السائل (ش-MS) وطبق لتحقيقات أيض الكربون في البكتيريا المسببة للمرض17،23. إلا في الآونة الأخيرة، كان إيسوتوبولوجوي التنميط تطويرها كأداة لدراسة توجيه الغذائية من الدهون في اللافقاريات الصغيرة التربة بمنزل et al. 24 منذ هذا الأسلوب لا تعوقها "يحمل عبر" إشارة 13ج، أنها ذلك مفيداً لتقييم الأنسجة العضوية عالي التخصيب مع أحد نظائر محددة بالمقارنة إلى GC-ج-إيرمس32.
مع هذا النهج، تتحدد القيم الشامل للتهمة (m/z) في أيون الجزيئية وبه إيسوتوبولوجويس GC-MS باستخدام وضع الصناعات الاستخراجية وسيم. بالمقارنة مع مسح كامل، يمكن زيادة الحساسية في سيم بحول عامل 100، الذي يفوق حتى النطاق الكمي GC FID33. علاوة على ذلك، بالحصول على مجموعة محددة من الأيونات في إطار زمني معين، يقاس أكثر موثوق بها على الرغم من خلفية من التينج شاركت قمم30. ثورنهوفير وفيتير34 أثبت أن سيم مناسبة لتحديد اتحاد كرة القدم والكمي في عينات المواد الغذائية حتى بكميات قليلة من الدهون المتوفرة.
عند استخدام SIM للتنميط إيسوتوبولوجوي 13ج قد اثنين على الأقل من القيود المنهجية التي سينظر فيها. أولاً، الأيونات الجزيئية لوفرة منخفضة نسبيا وعلى إيسوتوبولوجويس حتى أقل. مع مصدر أيون قذرة، أصبحت هذه أقل وفرة ونتيجة للأسلوب سيم يكون إلا شبه كمي33. ثانيا، حدوث زيادة من 13ج في واحد أو أكثر من مواقع الكربون من اتحاد كرة القدم يقلل من وفرة الطبيعية ج 13من ذرات الكربون المرتبطة بها. هذه التغييرات مع وضع العلامات غير الخطية، وهي ظاهرة تسمى "انحراف" في الوفرة الطبيعية، التي يمكن أن تؤدي إلى التقليل إثراء في هذه الجماهير20. يجب أن تحسب هذا تأثير الانحراف أما باستخدام مصفوفة تصحيح استناداً إلى معايير الشهرة (انظر فرنانديز et al.) أو بواسطة بما في ذلك الضوابط الطبيعية، أي منظمة تضامن النساء الأفريقيات من الكائنات التجريبية دون تسمية. وأجرى هذا الأخير في العمل الحالي مقارنة اتحاد كرة القدم في نفس المسمى (اليوم 1 والإصدارات الأحدث) وغير المسمى Collembola (يوم 0).
الغذائية التمويه ج التوجيه و 13
بينما مزايا المنهجية التنميط إيسوتوبولوجوي لتحديد 13ج في فاس بصفة واضحة، يمكن أن تعرقل في فيفو التمثيل الغذائي للكائنات الحية بالوسائل البيولوجية. حالة ثابتة النظائر والايض يصعب تحقيقه عندما، مثلاً، استخدام النظام الغذائي أو الحالة الفسيولوجية للمستهلكين غير معروفة، يعوق الحصول على تدفقات الكربون المطلقة. ومع ذلك، بمقارنة ملامح إيسوتوبولوجويس 13ج من منظمة تضامن النساء الأفريقيات في النظام الغذائي والمستهلك، يمكن الحصول على النسبية نسبة الاستيعاب اتحاد كرة القدم والأيضية. ويسمح هذا النهج التالي مصير محدد علامة FA استناداً إلى ما تسمية 13ج عن طريق تتبع توجيه الغذائية. مرض التصلب العصبي المتعدد-سيم أثبتت أن علامة فا تم توجيه أساسا إلى كسور نفلا من كل الأنواع التي تم تحليلها Collembola24. علاوة على ذلك، تم تخزين علامة اتحاد كرة القدم في الدهون محايدة مع قاصر أو لا تعديلات فقط. تم الكشف عن الإطالة فقط الغذائية 13C16:0 إلى 18:0 وعدم التشبع إلى مكافئات مونونويك (انظر الشكل 4). وجود أيون م+ 16 في C16 وفاس C18 العينات يوم 1 يؤكد أن هذه منظمة تضامن النساء الأفريقيات هم أحفاد تستكمل تماما المسمى بلميتيك. هذا الاستنتاج يدعم الدراسات السابقة التي تستند إلى نمط فا للمستهلك واتباع نظام غذائي فقط5،35 ، وتقترح إدراج علامة فاس كأسرة الجزيئات في الأنسجة المستهلك (لإجراء استعراض، راجع روس و 8من تشامبرلين).
وفي الوقت نفسه، كشفت أن نمط 13ج إيسوتوبولوجوي بلفاس أن الزيادة الملحوظة في 13C20:46 مع مرور الوقت بسبب استطالة/عدم التشبع سلائف تماما وصفت منظمة تضامن النساء الأفريقيات وتوليف حيثياته مع هذا الأخير أيضا بما في ذلك 13 ج المسمى أسيتيل كما يتضح من وجود M+ 18 آثار أيون C20 وأيضا منظمة تضامن النساء الأفريقيات C18 (انظر الشكل 4). ويلخص الشكل 5 التوجيه الغذائية المكملة 13C16:0 داخل بلفاس ونلفاس من الأنواع Collembola الملاحظة. من المثير للاهتمام، فقط 13ج بلميتيك من بلفاس تخضع لتغييرات أقوى، بينما ظلت التحول الأيضي في نلفاس استطالة تقتصر على واحد فقط وعدم التشبع خطوتين.
الشكل 5: مصير حمض النخليك الغذائية 13ج في الدهون المستهلك. الانسيابية تظهر مصير أدرجت 13C16:0 المقترحة في الأنواع Collembola التحقيق. سهام ترمز إلى مختلف مستويات دوران الأيضية مع سماكة مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وباختصار، إيسوتوبولوجوي التنميط بمرض التصلب العصبي المتعدد-سيم يبين بوضوح أن استخدام FA كعلامة المستوى الغذائي وسيلة قوية وموثوق بها في بيئة الشبكات الغذائية. على الرغم من أن لا يسمح التصميم التجريبي القياس الكمي الدقيق للتمويه 13ج (مثلاً، كذرة % 13ج من اتحاد كرة القدم المكملة) لمختلف الخطوات في مسارات الأيض فا، إيسوتوبولوجوي التنميط أداة مفيدة جميع الدراسات الإيكولوجية باستخدام الأحماض الدهنية كعلامات التغذوية. هدفا للمستقبل الحصول على مستهلك كمية فا ميزانية الكربون باستخدام نظم مصغرة مغلقة وتغذية المستهلكين معرفة كميات السلائف مسماة من الأحماض الدهنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
هو العرفان بدعم مالي من منزل ر. ول روس قبل الأوقيانوغرافية الألمانية (RU780 رو/11-1). ومولت نهرينغ ر قبل رو 780/10-1. وأخيراً، نحن نشكر جداً الدكتور هازل روفيمبو مابوريك لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط لدينا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | --- | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
References
- Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
- Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands - Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
- Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
- Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
- Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
- Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
- Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
- Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
- Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
- Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
- Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
- Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
- Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
- Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059 (2012).
- Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
- Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
- Garton, N. J., O'Hare, H. M.
- Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
- Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
- Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
- Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
- Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
- Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
- Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
- Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
- ISO, I. O. fS. Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , ISO 11267:1999 (1999).
- Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
- Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
- Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
- Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
- Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
- Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
- Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).
