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Immunology and Infection

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

doi: 10.3791/57116 Published: April 6, 2019

Summary

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Abstract

Die Analyse der bioaktiven Komponenten in Lebensmittel und Naturprodukte ist ein beliebtes Gebiet der Studie in vielen Bereichen, einschließlich der traditionellen chinesischen Medizin und Lebensmittel Sicherheit/Toxikologie geworden. Viele der klassischen Analysetechniken erfordern teure Ausrüstung und/oder Know-how. Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (Elisa) sind vor allem eine neue Methode für die Analyse von Lebensmitteln und natürlichen Produkten geworden. Diese Methode basiert auf Antikörper-vermittelten Erkennung von Zielkomponenten. Wie viele bioaktiven Komponenten bei Naturprodukten sind jedoch klein (< 1.000 Da) und keine Immunantwort auslösen, Erstellen von monoklonalen Antikörpern (mAbs) gegen sie ist oft schwierig. In diesem Protokoll bieten wir eine ausführliche Erläuterung der Schritte erforderlich, um mAbs gegen Zielmoleküle als auch benötigt, um die damit verbundenen indirekten wettbewerbsfähig (ic) ELISA für die schnelle Analyse der Verbindung mehrerer Proben erstellen generieren. Das Verfahren beschreibt die Synthese des künstlichen Antigens (d. h. das Hapten-Carrier-Konjugat), Immunisierung, Zellfusion, monoklonalen Hybridom-Vorbereitung, Charakterisierung der MAB und die ELISA-basierten Anwendung der MAB. Das Hapten-Carrier-Konjugat wurde durch das Natrium synthetisiert periodate Methode und von MALDI-TOF-MS ausgewertet. Nach der Immunisierung, Splenocyten wurden isoliert von der immunisierten Maus mit der höchsten Antikörpertiter und verschmolzen mit der Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (Hut) - sensible Maus Myelom Zelllinie Sp2/0 - Ag14 mit einem Polyethylenglykol (PEG)-basierte Methode. Die Hybridome sezernierenden mAbs reagiert auf das Ziel-Antigen wurden durch IcELISA für Spezifität und Kreuzreaktivität gezeigt. Darüber hinaus wurde die begrenzende Verdünnungsmethode angewandt, um monoklonale Hybridome vorzubereiten. Die endgültige mAbs waren weitere zeichnet sich durch IcELISA und dann in einem ELISA-basierten Anwendung zur schnellen und bequemen Detektion von Beispiel-Hapten (Naringin (NAR)) in natürlichen Produkten genutzt.

Introduction

Monoklonale Antikörper (MAK), auch bekannt als Mono-spezifische Antikörper werden aus einem einzigen zahlreiche Klon hergestellt und bestehen aus monovalenten Antikörper, dass alle an der gleichen Epitop1binden. In den letzten Jahren haben viele pflanzliche natürliche Arzneimittel bei der Behandlung von verschiedenen Krankheiten2verwendet worden. In der Tat sind viele kleine Molekülverbindungen ursprünglich abgeleitet aus Naturprodukten nun als Erstlinien Drogen wie Artemisinin für Malaria und Paciltaxel (Taxol) für Krebs2,3angewendet. Die Studie von Naturprodukten machte rasche Fortschritte, vor allem auf die enorme Entwicklung und Optimierung der herkömmlichen Analyse-Techniken, einschließlich Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Massenspektrometrie (MS). Allerdings gibt es noch einige Einschränkungen, die diese Methoden, wie z. B. ihre komplexen Vorbehandlung Protokolle und die damit verbundenen Kosten in Bezug auf Zeit, Arbeit/Expertisen und erforderlichen Instrumente4zugeordnet.

Vor kurzem wurden Enzym-linked Immunosorbentprobe mAb basierende Assays (Elisa) angewendet, um Lebensmittel und natürliche Produkte qualitativ und quantitativ zu analysieren. In der Tat, diese Methode beantragt worden Analyse von biologischen Proben und klinische Tests und hat gezeigt, dass genau, empfindlich und höchst effizient zu sein, während auch die Vermeidung der mühsame Vorbehandlung Schritte verknüpft mit anderen Analysen5, 6.

Wenn mAb-basierte ELISAs verwenden, um komplexe natürliche Produkte zu studieren, ist Vorbereitung von monoklonalen Antikörpern eines der Kern-Schritte. Leider der mAbs speziell für kleinen bioaktiven Komponenten in diesen Arten von Substanzen6,7,8,9,10,11,12 vorhanden ,13,14,15 sind oft begrenzt, im Vergleich zu den Protein-Antigene. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir ein Protokoll, um speziell generieren mAbs gegen kleine Verbindungen entwickelt. Die hier vorgestellten Protokoll umfasst künstliche Antigen-Synthese, Maus Immunisierung Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung.

Vor allem unsere Forschungsgruppe die Bildung von mAbs gegen kleine bioaktiven Verbindungen, die aus der traditionellen chinesischen Medizin studiert und entwickeln ihre Anwendungen seit Jahren. In unseren laufenden Studien haben wir mAbs gegen Baicalin16, Puerarin17Glycyrrhizic Säure18, Paeoniflorin19, Ginsenoside Re20, Ginsenoside Rh121und viele andere kleine Moleküle entwickelt. Unsere ELISA-Protokolle basierend auf diese mAbs wurden in einer Reihe von Studien zur Pharmakokinetik von diesen kleinen Molekülen sowie ihre Interaktionen mit anderen bioaktiven Substanzen zu bewerten. Darüber hinaus entwickelten verwenden diese mAbs, auch Immunoaffinitäts Chromatographie Methoden zur Trennung von strukturelle Analoga, einschließlich Epimers wir. Vor kurzem haben wir eine lateral Flow Immunoassay mit unserer Anti-Puerarin mAb, die anschließend für schnelle, vor-Ort-Nachweis von dieser Verbindung verwendet wurde. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass unsere mAb basierende Assays unverzichtbar und praktische Werkzeuge sind für das Studium der Biologie und der Qualität der natürlichen Produkt abgeleitete Verbindungen, insbesondere in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet.

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Protocol

Alle tierischen Verfahren durchgeführt, die in dieser Studie wurden von der ethischen Prüfungsausschuss an der Beijing University of Chinese Medicine (Genehmigung Nr. 2016BZYYL00109) genehmigt.

Hinweis: Die weiblichen BALB/c Mäuse (8 Wochen alt) wurden mit Hapten-Carrier-Protein Konjugate immunisiert. Wenn Sie allein, ein kleines Molekül (< 1.000 Da) kann keine Immunantwort hervorrufen. Jedoch Konjugation das kleine Molekül in ein Träger Makromolekül führt in Antigen-Synthese. In diesem Zusammenhang ist das kleine Molekül ein Hapten beschriftet. Hapten Konjugation ist ein notwendiges und wirksames Strategie bei der mAb-Produktion. Kreuz Reaktivität, zwei verschiedene Eiweißträgern wie Rinderserumalbumin (BSA) und Ovalbumin (OVA) oder Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) zu vermeiden und BSA, sollte als die immunogenen (für tierische Immunisierung) und Beschichtung Antigene (auf die Platte zum Beschichten verwendet werden Anti-Serum-Erkennung). BSA und Eizellen werden als Beispiel in dieses Protokoll verwendet.

1. Vorbereitung des Immunogen und Beschichtung Antigen

Hinweis: Für künstliche Antigen-Synthese, verwenden Sie die entsprechenden funktionellen Gruppe (z.B., Hydroxyl, Sulfhydryl Carboxylgruppen sauer oder amino) als den Seitenarm für die kovalente Bindung mit dem Trägerprotein. Die Konjugation, die Methoden umfassen periodate Oxidation, der Carbodiimide-Methode, eine gemischte Anhydride Reaktion, Glutaraldehyd Reaktion und die Succinat-Methode. Dieses Protokoll verwendet Naringin (NAR), eine bekannte Flavanone Glykosid, als Beispiel Verbindung. NAR ist eine kleine Anlage (581 Da) in Zitrusfrüchten sowie verschiedene traditionelle chinesische Medizin.

  1. Verwenden Sie eine Periodate Oxidation Verfahren, um NAR-BSA und NAR-OVA Konjugate zu synthetisieren.
    1. 50 mg NAR in einer Endkonzentration von 1 mg/mL22Wasser auflösen.
    2. Fügen Sie 100 µL der frisch zubereiteten Natrium periodate Lösung (0,1 M) bis 5 mL der NAR-Lösung hinzu. Rühren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 1 h.
  2. 4 mg von BSA und Eizellen in 2,0 mL 50 mM-Karbonat-Puffer (pH 9,6) auflösen. Fügen Sie dieses Protein Lösung für das NAR/Natrium periodate Reaktionsgemisch.
  3. Passen Sie die Mischung auf pH 9 mit 1 M Na2CO3 Lösung und rühren bei Raumtemperatur für 6-8 h.
  4. Dialyse das Reaktionsgemisch in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer Dialysemembran (MWCO 10 kDa) für 3 Tage, die CBS auszutauschen.
  5. Analysieren der Hapten-Carrier-Konjugat mit Matrix assisted Laser Desorption/Ionisierung Zeit des Fluges (MALDI-TOF)-MS.
    1. Mischen Sie 1 bis 10 Pmol des Konjugats mit 103-molare Sinapinic Säure-Überschuss in einer wässrigen Lösung mit 0,15 % Trifluoroacetic Säure (TFA) Falten. Trocknen Sie die Mischung auf einem Probenteller in Luft.
    2. Führen Sie die Analyse mit ein MALDI-TOF Massenspektrometer, ausgestattet mit einem gepulsten Stickstoff Laser betrieben bei 337 nm. Positive Ionen MALDI Massenspektren im linearen Modus innerhalb der Masse 15.000-100.000 wie zuvor beschrieben22(m/Z) zu erwerben.

2. Immunisierung

Hinweis: Insgesamt 5 BALB/c weibliche Mäuse (8 Wochen alt) wurden verwendet: 4 für NAR Konjugat-Impfung und 1 für die Kontrolle (PBS) Immunisierung.

  1. Für die erste Impfung 50 µg Konjugat (in 100 µL PBS verdünnt) mit ein gleiches Volumen der Freunds kompletten Adjuvans (CFA) mischen und vollständig emulgieren. Verabreichen Sie 100 µL dieser Mischung an jede Maus über dorsalen subkutanen Injektion.
  2. Liefern Sie zwei Wochen später ein Booster Impfung (100 µL) durch subkutane Injektion mit der gleichen Menge an Konjugat mit unvollständige Adjuvans (IFA) gemischt.
  3. Extrahieren Sie, 200 µL Blut aus der Vene Schweif von jeder Maus 7 Tage später um Serum erhalten.
    1. Zentrifuge das Blut bei 3.000 x g für 10 min. Transfer überstand das Serum zu einem neuen Schlauch.
    2. Analysieren Sie das Serum mit einem ELISA als zuvor beschriebenen21. Wählen Sie die Maus mit der höchsten Serum-Titer für Zellfusion verwenden.
  4. In Vorbereitung auf Zellfusion Verwalten einer gepulsten Immunisierung, die gewählten Maus über intraperitoneale Injektion von 50 µg des Konjugats in 300 µL PBS ohne Adjuvans 3 Tage vor der Fusion.
    Hinweis: Dieser Schritt kann ausgelassen werden, wenn der Titer hoch genug ist.

3. Vorbereitung auf Zellfusion

  1. Cell Fusion mittlere Vorbereitung
    1. Für die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (Hut) selektiven Medium: 50 x Hut Medien Ergänzung in 10 mL von RPMI-1640 auflösen und fügen Sie diese Mischung auf 500 mL RPMI-1640 mit 20 % FBS.
      Hinweis: Wenn 10 mL Konzentrat 50 X 500 mL Kulturmedium verdünnt sind, sind die Endkonzentrationen von Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin 100 µM, 0,4 µM und 16 µM bzw..
    2. Für die Hypoxanthin-Thymidin (HT) Medien: Auflösen der 50 x HT Media Ergänzung in 10 mL von RPMI-1640 und fügen Sie diese Mischung auf 500 mL RPMI-1640 mit 20 % FBS. Die Endkonzentrationen von Hypoxanthin und Thymidin sind 100 µM bzw. 16 µM.
  2. Kulturzellen Sie Sp2/0-Ag14.
    1. Tauen Sie mindestens 7 Tage vor der Fusion auf, schnell ein Fläschchen mit flüssigem Stickstoff eingefroren SP2/0-Ag14 Myelomzellen im warmen Wasser.
    2. Übertragen Sie die Zelle Lösung in 5 mL frisches Nährmedium (RPMI-1640) und Zentrifuge für 10 min bei 1000 X g.
    3. Entfernen Sie nach Zentrifugation das Kulturmedium und Aufschwemmen der Zellen frische RPMI-1640 mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt.
    4. Zellen und Medium in einem 25 cm2 Kolben und Inkubation bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2.
    5. Erweitern Sie die Zellen auf 3 oder 4 75 cm2 Fläschchen vor der Fusion.
  3. Vorbereitung der Abdominal-Feeder Schicht Zellen
    1. Opfern Sie eine 12 Wochen altes Baby Albino-ICR-Maus durch zervikale Dislokation 1 Tag vor Zellfusion zu und Tauchen Sie es in 75 % Ethanol.
    2. Nach dem Entfernen des Fells aus dem Bauch mit hämostatischen Zangen, desinfizieren der Gegend mit 75 % Ethanol. Schneiden Sie die äußere Haut um die Bauchhöhle verfügbar zu machen. 3 mL steriles RPMI-1640 Medium in die Bauchhöhle injiziert und massieren Sie den Bauch um zusätzliche Zellen in die Lösung zu lösen. Aspirieren Sie die Feeder-Zellsuspension in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen.
    3. Nach der Zellsuspension für 10 min bei 1000 X g Zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Feeder-Zellen in 20 mL Hut selektiven Medium.
    4. Übertragen Sie die Zellen in Kultur 96-Well Zellplatten (100 µL/Well). Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.

4. Zellfusion

  1. Nach die gewählten geimpft wurde Maus für Zellfusion erstellt (siehe Punkt 2.4), eine intraperitoneale Injektion von 10 % Chloral Hydrate (Narkose) zu verwalten und immunisierten Maus durch zervikale Dislokation zu opfern.
  2. Sammeln Sie zusätzliche Blut aus dem Herzen (1 mL), und bereiten Sie Serum wie unter Schritt 2.3.1 als Positivkontrolle während Hybridom Auswahl verwenden.
  3. Entfernen Sie die Haut und Muskel Gewebe mit einer Schere, um die Milz verfügbar zu machen.
  4. Isolieren Sie die Milz vorsichtig mit einer Pinzette zu und waschen Sie die Milz mit RPMI-1640. Die Milz in Stücke schneiden und langsam die Milz zu genannte Pfund. Bereiten Sie eine Milz Zellsuspension durch Drücken der Milz-Gewebe durch eine 800 Sieb Zelle in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.
  5. Waschen Sie die Milz Zellsuspension mit RPMI-1640 Medium. Ernte der Milzzellen durch Zentrifugieren (1000 x g, 10 min und 4 ° C), und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diese Waschschritt dreimal.
  6. Entfernen Sie kultiviert und verstärkte Myelom-Zellen aus dem Inkubator und sanft Hahn/schütteln die Kolben um eine Zellsuspension zu erhalten. Waschen Sie diese Suspension mit RPMI-1640 Medium zweimal um die FBS zu entfernen.
    Hinweis: Dies ist ein wesentlicher Schritt, als FBS Zellfusion beeinflussen können.
  7. Zählen der Zellen und die Konzentration vor dem Mischen mit der Milzzellen anpassen. Das letzte Verhältnis der Milzzellen auf Myelomzellen sollte zwischen 1:5 und 01:10.
  8. Mischen Sie die Milz Zelle Aussetzung und Myelom-Zellen. Zentrifugieren Sie die Zelle Mischung (1000 x g, 10 min und 4 ° C), und entfernen Sie den überstand.
  9. Fügen Sie 1 mL der Lösung 50 % Polyethylenglykol (PEG) zu den Zellen und rühren Sie sanft bei 37 ° C für 1 min. Lassen Sie stehen für 30 s.
    Hinweis: Die PEG-Lösung verwendet in diesem Schritt sollte enthalten 50 % (w/V) Polyethylenglykol 1500 und 10 % (V/V) Dimethyl Sulfoxid (DMSO) mit PBS-Puffer ohne Calcium (Ca2 +).
  10. Fügen Sie 2 mL RPMI-1640 Medium für 2 min, die Reaktion zu kündigen. Fügen Sie eine zusätzliche 2 mL RPMI-1640 Medium für ein weiteres 1 min, und fügen Sie eine zusätzliche 10 mL RPMI-1640 Medium.
  11. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 X g für 10 min. Nach verwerfen des Überstands, Hut Lösung hinzufügen und weiter, die Zellen zu kultivieren. Dann fügen Sie 100 µL Zellsuspension in jede Vertiefung der Feeder-Schicht-Platten und inkubieren Sie die Platten für 7 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2.
    Hinweis: Unter diesen Bedingungen werden fusionierter Myelom-Zellen sterben, während die Hybridom-Zellen werden weiter im Hut Medium wachsen. Innerhalb von 7 Tagen wird monoklonalen Hybridom bilden als einem einzigen Cluster von Zellen in den Brunnen, Brunnen mit polyklonalen Hybridom mehrere Cluster von Zellen haben werden.
  12. Aspirieren des Überstands für die Analyse und das Medium mit HT Medium zu ersetzen.
    Hinweis: Achten Sie darauf, das Hut-Medium zu ersetzen mit HT mittlere zunächst als Wechsel direkt zu unsupplemented Medium wirkt sich nachteilig auf die Hybridom.

5. indirekte wettbewerbsfähige ELISA (IcELISA)

  1. Bestreichen Sie eine 96-Well-Platte mit NAR-OVA (1 µg/mL, 100 µL/Well) und 1 h bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° c inkubieren
  2. Blockieren Sie die Platte mit 300 µL GPBS (PBS mit 1 % m/V Gelatine) für 1 h bei 37 ° C, nicht-spezifische Adsorption zu verhindern.
  3. Waschen Sie die Platte dreimal mit TPBS (PBS mit 0,05 % V/V Tween-20).
  4. Verdünnen Sie unconjugated NAR in einer Reihe von Konzentrationen mit 10 % Methanol. Fügen Sie 50 µL diese Verdünnungen, Brunnen zu trennen. Fügen Sie in die weiteren Bohrungen 50 µL Antiserum oder Hybridom überstand (mit mAbs). Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° c
  5. Fügen Sie 100 μL der Peroxidase radioaktiv markierten Anti-Maus IgG in jede Vertiefung und weitere 1 h inkubieren.
  6. Nach dem Waschen der Platte dreimal mit TPBS, 100 µL Substratlösung hinzufügen (0,1 M Citrat-Puffer (pH 4) enthält 0,015 % V/V H2O2 und 2 mg/mL von 3, 3', 5, 5'-Tetramethyl-Benzidine (TMB)) zu jedem gut und 15 min inkubieren.
  7. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 µL 1 M H2SO4 in jede Vertiefung.
  8. Messen Sie die Absorption mit einem Mikrotestplatte Reader bei 450 nm. Wählen Sie die Hybridome, die höchsten Konzentrationen von NAR Antikörper in ihren überstand zur weiteren Vorbereitung abgesondert.

6. Vorbereitung der monoklonalen Hybridomen

  1. Verwenden Sie die begrenzende Verdünnungsmethode um monoklonale Hybridome vorzubereiten.
    1. Nach dem Entfernen der HT-Medium aus der ausgewählten Hybridome (d. h. diejenigen positiv für NAR Antikörper Sekretion), die Zellen RPMI-1640 Aufschwemmen und sie zählen.
    2. Verdünnen Sie die Zellen zu einer Konzentration von 1 Zelle, 2 Zellen und 4 Zellen pro Bohrloch in 100 µL RPMI-1640 in eine 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C, 5 % CO2.
    3. Erkennen Sie nach 7-10 Tagen die NAR-Antikörper in der Kultur Überstand über das IcELISA-Protokoll (Schritt 5). Übertragen Sie Zellen von den Hybridome, die positiv auf NAR Antikörper gegen 24-Well Platten, 25 cm2 Fläschchen und 75 cm2 Fläschchen für den Anbau sind.
  2. Tiefgefrieren Sie die monoklonalen Hybridome.
    1. Ernten der Zellen und übertragen Sie sie um Rohre zu zentrifugieren.
    2. Nach dem Zentrifugieren der Zellen (800 X g, 10 min), entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zellen in der eisigen Medium (RPMI-1640, 20 % fetalen Kälberserum (FCS) und 10 % DMSO). Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf Cryoröhrchen.
    3. Speichern Sie die Cryoröhrchen in einem Farbverlauf Kühlbox bei-80 ° C für 24 h. Dann übertragen Sie die Cryoröhrchen zu flüssigem Stickstoff für die Langzeitlagerung.

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Representative Results

Generierung von monoklonalen Hybridomen

Das Molekulargewicht des Konjugats Hapten-Carrier wurde durch MALDI-TOF-MS-Analyse bestätigt. Da das Molekulargewicht des BSA und NAR bekannt sind, konnte die Anzahl von kleinen Molekülen mit BSA konjugierten berechnet werden. Abbildung 1 zeigt repräsentative spektrale Ergebnisse für NAR-BSA22, die eine breite Spitze bei m/Z 77.058 anzeigt. Da das mittlere Molekulargewicht der BSA 66.430 ist, scheint es, dass mindestens 18 NAR Moleküle (MW 581) mit der BSA konjugiert wurden (molare Kupplung Verhältnis (NAR:BSA) = 18:1).

IcELISAs wurden durchgeführt, um festzustellen, das Anti-Serum-Titer nach Maus Immunisierung22. Es scheint, dass die Serum-Antikörpertiter der vier Mäuse mit der NAR-BSA-Konjugat immunisiert deutlich höher als bei der Kontrolle Maus (Abbildung 2 waren). Die Maus mit der höchsten Titer (über 1:5, 000) für Zellfusion verwendet wurde.

Nachdem der Milzzellen von dieser Maus zu den Abdominal-Feeder Schicht Zellen verschmolzen waren, wurden die Hybridome für 7 Tage Inselection Medium angebaut. Mit IcELISAs, die Zellkultur Überstand wurde getestet, Andthehybridomas für NAR mAbs positiv waren recloned und erweitert. Die Bilder in Abbildung 3 zeigen die konventionellen Ergebnisse für stabile monoklonale und polyklonale Hybridom-Zell-Linien.

Screening und Anwendung von Anti-NAR-mAb

Der kritische Punkt dieses Experiments ist das Screening von mAb Spezifität. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass die mAb in diesem Experiment mit NAR aber nicht die blockierende Puffer oder Carrier Proteine22reagiert. Darüber hinaus wurde die Besonderheit der MAB weiter ausgewertet durch Testen der Kreuzreaktivität mit strukturell verwandten Verbindungen. Tabelle 2 zeigt die berechneten Kreuzreaktivität Preise. Da die Kreuzreaktivität Rate für die andere Flavonoide getestet wurden in weniger als 2 %, es ist klar, dass diese mAb spezifisch für NAR22.

Ein IcELISA wurde entwickelt, mit dem Anti-NAR-mAb und highlights der Anwendung dieser Methode. Mit Lösungen, die bekannten Konzentrationen von NAR, eine Standardkurve wurde aufgetragen mit der Absorptionswerte dieser Lösungen und des linearen Bereichs des Modells s-Kurve war (in der oberen rechten Abbildung Inset dargestellt) berechnet. Die lineare Regressionsgleichung (y = 0,176 ln(x) + 1.1243, R2 = 0.9978) berechnet für diese Kurve auf Quantitative Analyse unbekannter Proben angewendet werden kann.

Herstellung und Charakterisierung von mAb gegen Glycyrrhizic Säure

Mit dieser Splenocyte/Myelom Cell Fusion-Protokoll, war ein monoklonaler Hybridom sezernierenden Anti-Glycyrrhizic Säure mAb, benannt DF5, auch etablierte18. Der Untertyp dieses DF5 MAB wurde als IgG1 mit einem Kappa-Leichtketten (Tabelle 3) identifiziert. Ähnlich wie bei der vorstehenden Analyse, die mAb diente für zusätzliche Abschirmung und Anwendungen, während die Antigen-spezifische monoklonale Hybridome erweiterte Andcryopreserved in flüssigem Stickstoff für die Langzeitspeicherung waren.

Beschichtungsstoff Ein450 -Wert Kreuzreaktivität (%)
NAR-OVA 0,97 100
OVA 0,056 < 0,01
BSA 0,068 < 0,01
Gelatine 0,053 < 0,01
Magermilch 0.05 < 0,01

Tabelle 1. Reaktivität der Anti-NAR-MAB mit NAR-OVA und Carrier Proteine.

Klassifizierung Verbindung Kreuzreaktivität (%)
Flavonoide Naringin 100 %
Puerarin 1,26 %
Neohesperidin 18.80 %
Rutin 1,95 %
Baicalein < 0,09 %
Hyperoside < 0,09 %
Terpene Ginsenoside Rg2 < 0,09 %
Ginsenoside Rb1 < 0,09 %
Ginsenoside Re < 0,09 %
Notoginsenoside < 0,09 %
Glycyrrhizic Säure < 0,09 %
Glycyrrhetic Säure < 0,09 %
Saikosaponin < 0,09 %
Paeoniflorin < 0,09 %
Gentiopicrin < 0,09 %
Sterides Cholsäure < 0,09 %
Deoxycholic Säure < 0,09 %
Anthrachinone Rheumemodin < 0,09 %
Rheinic Säure < 0,09 %
Andere Salvianolic Säure < 0,09 %
Curcumin < 0,09 %
Gastrodin < 0,09 %
Amygdalin < 0,09 %

Tabelle 2. Kreuzreaktivität (%) die Anti-NAR-MAB gegen NAR und seine verwandten Verbindungen.

Isotype der schweren Kette Isotype Lichterkette
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgA IgM Kappa Lambda
DF5

Tabelle 3. Isotype Analyse der mAb DF5.

Figure 1
Abbildung 1: MALDI-TOF-MS-Analyse des NAR-BSA-Konjugats. [M + H] + und [M + 2H]2 + geben Sie die Einzel- und Doppel-protonierten Moleküle des NAR-BSA, beziehungsweise. Diese Zahl wurde von Qu Et Al., 201622 geändert 

Figure 2
Abbildung 2 : Analyse der Anti-Serum-Titer von IcELISA. Mäuse 1 - 4 wurden mit der NAR-BSA immunisiert konjugieren, während das Steuerelement mit Fahrzeug (PBS) geimpft wurde. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) (n = 3). Diese Zahl wurde von Qu Et Al., 201622geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 3
Abbildung 3 : Repräsentative Bilder von stabile monoklonalen (A) und polyklonalen (B) Hybridome. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 4
Abbildung 4 : Anwendung von Anti-NAR-mAb in ein IcELISA. Verschiedenen Konzentrationen von NAR wurden mit mAb in Brunnen vorbeschichtet mit NAR-OVA (1 mg/mL) inkubiert. A ist die Absorption im Beisein von NAR, während eine0 die Extinktion bei fehlender NAR ist. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) (n = 3). Diese Zahl wurde von Qu Et Al., 201622geändert. 

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Discussion

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die erfolgreiche Produktion von mAbs gegen natürliche Produkt abgeleitet kleine Moleküle. Die wesentlichen Schritte des Verfahrens umrissen worden, und wir haben bewiesen, dass die Nützlichkeit dieses Protokoll mit NAR als ein Beispiel kleines Molekül. Die Beispiel-Spektren, Reaktivität Analysen und IcELISA Ergebnisse zeigen Vertreter experimenteller und Steuerdaten, die mit diesem Protokoll abgerufen wird. Beispielbilder von der Hybridome bieten eine visuelle Darstellung der was der Forscher achten sollten, wenn zwischen der monoklonale und polyklonale Hybridome Differenzierung. Zusammengenommen haben wir gezeigt, dass mAb Herstellung, Charakterisierung und Anwendungsstrategie hier Ergebnisse bei der Schaffung einer effektiven mAb gegen ein kleines Molekül sowie ein Roman ELISA basierend auf bestimmten mAb, die verwendet werden können präsentiert, um zu testen der Ausdruck des Zielmoleküls in anderen natürlichen Produkten.

Arbeiten mit jeder Art von Antikörper, ist die häufigste Frage, die bei diesem Vorgang entstehen die Empfindlichkeit der MAB zugeordnet. In der Tat gibt es ein hohes Risiko, das die mAb nicht erwartungsgemäß wird durch geringe Empfindlichkeit, hohe Kreuzreaktivität oder andere Faktoren. Wie die ganze Prozedur mindestens 4 Monate in vollem Umfang durchführen dauert, ist es wichtig während der ersten Screening der mAbs abgesondert von der Hybridome zu kümmern. Ein wesentlicher Aspekt zu vermeiden, eine unwirksame mAb ist das Anti-Serum von IcELISA vor Zellfusion bestätigt reaktiv mit dem Hapten aber nicht der Träger auf den Bildschirm. Dies erfolgt mithilfe von zwei verschiedenen Eiweißträgern (in diesem Fall BSA und OVA) als Immunogen und Beschichtung Antigen Träger bzw.. Während der Immunisierung mit dem Hapten-BSA-Konjugat, werden die Tiere produzieren Antikörper gegen beide das Hapten (z. B.NAR) und BSA. So sollten zur Vermeidung von falsch-positiven Nachweis von Anti-BSA-Antikörpern bei Sichtung Hapten-OVA verwendet werden, um die Anti-Hapten Antikörper spezifisch zu erkennen. Die Schaffung von diesen zwei Eiweißträgern sowie beim Einsetzen in das Protokoll ausdrücklich hervorgehoben wird.

Es ist auch wichtig zu beachten, dass während der Zubereitung von monoklonalen Hybridome begrenzende Verdünnungsmethode muss oft mehrmals wiederholt werden, bis alle der Brunnen mit dem monoklonalen Zellen positiv sind. Diese Wiederholung hilft um zu bestätigen, dass jeder Klon stabil Geheimnisse der spezifischen Antikörper.

Die Grenzen dieser Methode sind das komplizierte Verfahren der Hybridom-Generation und den Zeitaufwand für die Auswahl der gewünschten Antikörper-produzierenden Hybridom. Jedoch kann sobald die mAb erhalten und die IcELISA entwickelt, die Erkennung von der Ziel-Verbindung in natürlichen Produkten schnell und effizient durchgeführt werden. Vor allem, dieses Protokoll vermeidet einige der Kosten im Zusammenhang mit anderen Analysetechniken und erfordert keine teure Instrumente immer wieder für jedes natürliche Produkt getestet.

Einmal produziert und abgeschirmt, kann in einer Vielzahl von Analysen Hapten mAb verbreitet. In diesem Protokoll konzentrierten wir uns auf die Verwendung von mAb in einem ELISA-basierten Methode, die verwendet wurde, um die Biologie der kleinen Moleküls sowie seiner pharmakokinetischen Interaktionen20,22zu studieren. Anderen mAbs erstellt mit diesem Protokoll sind auch benutzt worden, ein mAb-basierte Immunoaffinitäts Chromatographie Methode für die Trennung von strukturelle Analoga18, einschließlich Epimers21sowie ein lateral Flow Immunoassay23 für schnellen und vor-Ort-Nachweis des Zielmoleküls. Diese Studien unterstreichen Anwendungder mAbs hergestellt, unter Verwendung des Protokolls beschrieben hier. Damit dieses Verfahren und die mAbs geschaffen, Handlungen als eine Grundlage für die Entwicklung verschiedener Ziel mAb-basierten Immunoassays, die als analytische Werkzeuge für die Bewertung und Kontrolle der Qualität der Naturprodukte effektiv genutzt werden können.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 81573573, 81473338 und 81503344) und dem klassischen Rezept grundlegende Forschungsteam an der Beijing Universität der chinesischen Medizin unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
800 mesh (40 μm nylon) filter  FALCON 352340
24 well culture plate NUNC 119567
25 cm2 Flask Labserv 310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) Sigma Aldrich 860336 1G
75 cm2 Flask Corning 430720
96 well culture plate NUNC 117246
bovine serum albumin AMRESCO 332
cell strainer FALCON 352340
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
cryotubes, 1 mL  Sigma Aldrich V7384-1CS
cultivator DRP-9082  Samsung
dialysis membrane (10kDa) Heng Hui 45-10000D
dimethylsulfoxide Sinopharm Chemical DH105-10
electronic balance  BS124-S  Sartorius
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
ethanol, 96% Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
fetal calf serum Invitrogen 10270106
Freund´s adjuvant, complete Sigma Aldrich SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete Sigma Aldrich SLBL0210V
Gelatin AMRESCO 9764-500g
Gradient cooler container Nalgene 5100-0001
HAT media supplement Sigma Aldrich H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
HT media supplement Sigma Aldrich H0137-10VL
Inverted Microscope IX73 Olympus 
keyhole limpet hemocyanin Sigma Aldrich H8283
MALDI-TOF-MS  Axima-CFR  plus   Axima 
Microplate Reader BioTex ELX-800 
mouse Vital River  BALB/c
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG Sigma Aldrich RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution Hyclone SV30010
Pipette 10 mL COSTAR 4488
Pipette 25 mL FALCON 357525
RPMI 1640 Corning 10-040-CVR
skim milk applygen P1622
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021

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References

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Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte
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Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).More

Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).

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