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Immunology and Infection

प्राकृतिक उत्पादों के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन

doi: 10.3791/57116 Published: April 6, 2019

Summary

यह लेख विभिंन immunoassays में उपयोग के लिए प्राकृतिक उत्पादों के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तैयारी और मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है । इस प्रक्रिया में प्रतिरक्षण, सेल फ्यूजन, सकारात्मक क्लोन स्क्रीनिंग के लिए अप्रत्यक्ष प्रतियोगी एलिसा, और मोनोक्लोनल हाइपरडोमा तैयार करना शामिल है । मालदी-TOF-MS और ELISA विश्लेषण का उपयोग कर एंटीबॉडी लक्षण वर्णन के लिए विनिर्देशों भी प्रदान किए जाते हैं ।

Abstract

खाद्य पदार्थों और प्राकृतिक उत्पादों में मौजूद जैव सक्रिय घटकों का विश्लेषण कई क्षेत्रों में अध्ययन का एक लोकप्रिय क्षेत्र बन गया है, जिसमें पारंपरिक चीनी चिकित्सा और खाद्य सुरक्षा/ शास्त्रीय विश्लेषण तकनीकों के कई महंगे उपकरण और/ विशेष रूप से, एन्जाइम-लिंक्ड इमयूनोसोमोंट असेस (एलिसस) खाद्य पदार्थों और प्राकृतिक उत्पादों के विश्लेषण के लिए एक उभरती हुई पद्धति बन गए हैं । इस विधि को लक्षित घटकों के एंटीबॉडी-mediated पता लगाने पर आधारित है । हालांकि, के रूप में प्राकृतिक उत्पादों में bioactive घटकों के कई छोटे है (< 1000 डीए) और एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा नहीं, उनके खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) बनाने अक्सर मुश्किल है । इस प्रोटोकॉल में, हम लक्ष्य अणुओं के खिलाफ mAbs उत्पंन करने के लिए आवश्यक चरणों का एक विस्तृत विवरण प्रदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उन से जुड़े अप्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी (आईसी) ELISA कई नमूनों में यौगिक के तेजी से विश्लेषण के लिए बनाने की जरूरत है । प्रक्रिया कृत्रिम प्रतिजन के संश्लेषण का वर्णन (यानी, hapten वाहक संयुग्मी), प्रतिरक्षण, सेल फ्यूजन, मोनोक्लोनल संकर डोमा तैयारी, mab के लक्षण वर्णन, और elisa आधारित आवेदन mab. Hapten वाहक संयुग्मी सोडियम periodate विधि द्वारा संश्लेषित किया गया था और मालदी-TOF-MS द्वारा मूल्यांकन । प्रतिरक्षण के बाद, splenocytes एक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) आधारित विधि का उपयोग करते हुए उच्चतम एंटीबॉडी अनुमापांक और hypoxanthine-aminopterin-थायमिडीन (HAT)-संवेदनशील माउस मायलोमा सेल लाइन Sp2/0-Ag14 के साथ संगलित के साथ प्रतिरक्षित माउस से अलग किए गए थे । लक्ष्य प्रतिजन के लिए अभिक्रियाशील mAbs रिएक्टिव संकरण को विशिष्टता और क्रॉस-जेट के लिए icELISA द्वारा प्रदर्शित किया गया था । इसके अलावा, सीमित तनुकरण विधि मोनोक्लोनल हाइब्रिड तैयार करने के लिए लागू किया गया था । अंतिम mAbs आगे icELISA द्वारा विशेषता और फिर एक ELISA आधारित आवेदन में उदाहरण hapten के तेजी से और सुविधाजनक पता लगाने के लिए उपयोग किया गया (naringin (नार)) प्राकृतिक उत्पादों में ।

Introduction

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs), भी मोनो विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में जाना जाता है, एक एकल बी-लिम्फोसाइट क्लोन से उत्पादित कर रहे हैं और एक ही epitope1के लिए सभी बाँध कि मोनोवेलेंट एंटीबॉडी से बना रहे हैं. हाल के वर्षों में कई औषधीय पादप व्युत्पन्न प्राकृतिक उत्पादों का उपयोग विभिन्न रोगों के उपचार में किया गया है2. वास्तव में, कई छोटे आणविक यौगिकों मूल रूप से प्राकृतिक उत्पादों से व्युत्पंन अब पहली लाइन दवाओं के रूप में लागू कर रहे हैं, इस तरह के रूप में मलेरिया और paciltaxel के लिए आर्टेमिसिलिन (taxol) के लिए कैंसर2,3। प्राकृतिक उत्पादों के अध्ययन तेजी से प्रगति की है, मोटे तौर पर जबरदस्त विकास और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (HPLC) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) सहित पारंपरिक विश्लेषण तकनीकों के अनुकूलन के कारण । हालांकि, अभी भी कुछ इन विधियों, जैसे उनके जटिल pretreatment प्रोटोकॉल और संबंधित लागत के साथ जुड़े सीमाओं के साथ समय का संबंध है, श्रम/

हाल ही में, mAb-आधारित एंजाइम-लिंक्ड इमयूनोसोमोंट असयों (एलिसस) को गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से खाद्य और प्राकृतिक उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है । वास्तव में, इस विधि दोनों जैविक नमूनों विश्लेषण और नैदानिक परीक्षण के लिए लागू किया गया है और सही, संवेदनशील होना दिखाया गया है, और अत्यधिक कुशल जबकि भी थकाऊ pretreatment अंय विश्लेषण5के साथ जुड़े कदम से परहेज, 6.

जटिल प्राकृतिक उत्पादों का अध्ययन करने के लिए एमएबी आधारित एलिसस का उपयोग करते समय, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तैयारी मुख्य चरणों में से एक है । दुर्भाग्य से, छोटे bioactive पदार्थ के इन प्रकार में मौजूद घटकों के लिए विशेष mabs6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 अक्सर प्रोटीन एंटीजन की तुलना में सीमित हैं । इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, हम विशेष रूप से छोटे यौगिकों के खिलाफ mAbs उत्पंन करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकाल में कृत्रिम प्रतिजन संश्लेषण, माउस प्रतिरक्षण, कोशिका संलयन, अप्रत्यक्ष प्रतियोगी एलिसा, और मोनोक्लोनल हाइडोमा तैयार करना शामिल है ।

विशेष रूप से, हमारे अनुसंधान समूह के पारंपरिक चीनी दवाओं से छोटे bioactive यौगिकों के खिलाफ mAbs के गठन का अध्ययन किया गया है और वर्षों के लिए उनके अनुप्रयोगों के विकास । हमारे पर चल रहे अध्ययन में, हम बैकालीन16, puerarin17के खिलाफ mabs विकसित किया है, glycyrrhizic एसिड18, paeoniflorin19, जिनसेनोसाइड पुन:20, जिनसेनोसाइड Rh121, और कई अन्य छोटे अणुओं. इन mAbs पर आधारित हमारे ELISA प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है कई अध्ययनों में इन छोटे अणुओं के फार्माकोकोनेटिक्स का मूल्यांकन करने के साथ ही अन्य bioactive यौगिकों के साथ उनकी बातचीत. इसके अलावा, इन mAbs का उपयोग कर, हम भी epimers सहित संरचनात्मक analogues के पृथक्करण के लिए immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी विधियों का विकास किया है । हाल ही में, हम तैयार एक पार्श्व प्रवाह immunoassay हमारे विरोधी का उपयोग कर-puerarin mAb है कि बाद में तेजी के लिए इस्तेमाल किया गया था, इस परिसर का पता लगाने पर साइट । हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि हमारे mAb आधारित assays जीव विज्ञान और प्राकृतिक उत्पाद व्युत्पन्न यौगिकों की गुणवत्ता का अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य और सुविधाजनक उपकरण हैं, विशेष रूप से पारंपरिक चीनी दवाओं में इस्तेमाल किया उन ।

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Protocol

इस अध्ययन में प्रदर्शन पशु प्रक्रियाओं के सभी चीनी चिकित्सा के बीजिंग विश्वविद्यालय में एथिकल रिव्यू कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया है (अनुमोदन संख्या 2016BZYYL00109) ।

नोट: मादा BALB/c चूहों (8 सप्ताह पुराने) hapten वाहक प्रोटीन संयुग्म के साथ प्रतिरक्षित किया गया । जब अकेले इस्तेमाल किया, एक छोटा सा अणु (< 1000 डीए) एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त नहीं कर सकते । हालांकि, एक वाहक मैक्रोमोलेक्कुले के लिए छोटे अणु संयुग्मक प्रतिजन संश्लेषण में परिणाम है । इस संदर्भ में, छोटे अणु एक hapten लेबल है । Hapten संयुग्मन mAb उत्पादन के लिए एक आवश्यक और प्रभावी रणनीति है । क्रॉस जेट से बचने के लिए, दो अलग प्रोटीन वाहक, जैसे कि गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और ओवल्ब्युमिन (ओवा) या कीहोल लिम्पेट हेमोकैनाइन (KLH) और BSA, के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए immunogens (पशु प्रतिरक्षण के लिए) और कोटिंग एंटीजन (के लिए थाली कोट एंटी-सीरम डिटेक्शन) । BSA और OVA इस प्रोटोकॉल में एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है ।

1. Immunogen और कोटिंग प्रतिजन की तैयारी

नोट: कृत्रिम एंटीजेन संश्लेषण के लिए, वाहक प्रोटीन के साथ सहसंयोजी बाइंडिंग के लिए साइड आर्म के रूप में उपयुक्त कार्यात्मक समूह (उदा., हाइड्रॉक्सिल, सल्फहाइड्रेट कार्बोक्सिल अम्ल, या अमीनो) का उपयोग करें । संयुग्मन विधियों में periodate ऑक्सीकरण, कार्बोडाइइमाइड विधि, मिश्रित ऐनहाइड्राइड्स अभिक्रिया, ग्लूटारऐल्डिहाइड अभिक्रिया, और सक्सिनेट विधि शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है naringin (नार), एक अच्छी तरह से ज्ञात flavanone ग्लाइकसाइड, एक उदाहरण के यौगिक के रूप में. नार एक छोटा सा यौगिक (५८१ Da) खट्टे फल के साथ ही विभिन्न पारंपरिक चीनी दवाओं में मौजूद है ।

  1. NAR-BSA और नार-OVA संयुग्म संश्लेषी करने के लिए एक periodate ऑक्सीकरण प्रक्रिया का उपयोग करें ।
    1. 1 मिलीग्राम/एमएल22की एक अंतिम एकाग्रता पर पानी में ५० मिलीग्राम के नार को भंग ।
    2. नए सिरे से तैयार सोडियम periodate समाधान के १०० μL जोड़ें (०.१ एम) को नार समाधान के 5 मिलीलीटर । 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण हलचल ।
  2. ५० मिमी कार्बोनेट बफर (पीएच ९.६) के २.० मिलीलीटर में BSA और OVA के 4 मिलीग्राम भंग । इस प्रोटीन घोल को नार/सोडियम periodate अभिक्रिया मिश्रण में डालें ।
  3. 1 एम एनए2सीओ3 समाधान के साथ 9 पीएच के मिश्रण को समायोजित करने और 6-8 एच के लिए कमरे के तापमान पर हलचल ।
  4. एक डायलिसिस झिल्ली (MWCO 10 केडीए) का उपयोग करने के लिए सीबीएस का आदान-प्रदान करने के लिए फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) में प्रतिक्रिया मिश्रण Dialyze ।
  5. Hapten-वाहक संयुग्मी का उपयोग करके मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर विशोषण/उड़ान के ionization समय (माल्डी-तोक) का विश्लेषण-MS ।
    1. मिश्रण 1-10 एक जलीय घोल में सिनापिनिक अम्ल की 103-गुना मोलर अतिरिक्त के साथ संयुग्मी के pmol ०.१५% trifluoroacetic एसिड (tfa) युक्त । मिश्रण को हवा में एक नमूना प्लेट पर सुखा लीजिये ।
    2. एक माल्डी-TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर एक स्पंदित नाइट्रोजन लेजर ३३७ एनएम पर संचालित से सुसज्जित का उपयोग कर विश्लेषण करते हैं । मास रेंज (एम/जेड) के भीतर रैखिक मोड में सकारात्मक आयन मालदी मास स्पेक्ट्रा प्राप्त 15000-100000 के रूप में पहले से वर्णित22

2. प्रतिरक्षण

नोट: कुल 5 BALB/c मादा चूहों (8 सप्ताह पुराने) का उपयोग किया गया था: 4 नार संयुग्मी प्रतिरक्षण और 1 नियंत्रण (पीबीएस) प्रतिरक्षण के लिए ।

  1. पहले टीकाकरण के लिए, ५० μg संयुग्मी मिश्रण (पीबीएस के १०० μl में पतला) के साथ एक समान मात्रा में है freund पूर्ण सहायक (सीएफए) और पूरी तरह से पायसी । इस मिश्रण के १०० μL प्रत्येक माउस को पृष्ठीय उपचर्म इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासन ।
  2. दो सप्ताह बाद, अपूर्ण सहायक (IFA) के साथ मिश्रित संयुग्मी की एक ही राशि के साथ उपचर्म इंजेक्शन के माध्यम से एक बूस्टर टीकाकरण (१०० μl) उद्धार ।
  3. सीरम प्राप्त करने के लिए 7 दिन बाद हर माउस की पूंछ नस से रक्त की २०० μL निकालें ।
    1. सेंट्रीफ्यूज ३,००० x g पर 10 मिनट के लिए रक्त. सीरम supernatant एक ताजा ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    2. एक ELISA का उपयोग कर के रूप में पहले21वर्णित सीरम का विश्लेषण करें । सेल फ्यूजन के लिए उपयोग करने के लिए उच्चतम सीरम टीट्यूड के साथ माउस चुनें ।
  4. सेल फ्यूजन के लिए तैयार करने में, संयुग्मी के ५० μg के intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से एक स्पंदित प्रतिरक्षा के लिए चयनित माउस को प्रशासित करता है बिना सहायक pbs के ३०० μl में 3 दिन के विलय से पहले ।
    नोट: यदि टीटर काफी ऊंचा है तो इस चरण का लोप किया जा सकता है ।

3. सेल फ्यूजन के लिए तैयारी

  1. सेल फ्यूजन मीडियम की तैयारी
    1. Hypoxanthine के लिए-aminopterin-थायमिडीन (HAT) चयनात्मक माध्यम: RPMI के 10 मिलीलीटर में 50x HAT मीडिया के पूरक भंग-१६४० और RPMI के ५०० मिलीलीटर के लिए इस मिश्रण को जोड़ने-१६४० 20% FBS युक्त ।
      नोट: जब 50x ध्यान के 10 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम के ५०० मिलीलीटर में पतला कर रहे हैं, hypoxanthine, aminopterin के अंतिम सांद्रता, और थायमिडीन क्रमशः १०० μM, ०.४ μM, और 16 μM हैं ।
    2. Hypoxanthine के लिए-थायमिडीन (एचटी) मीडिया: RPMI के 10 मिलीलीटर में 50x एचटी मीडिया के पूरक भंग-१६४० और RPMI के ५०० मिलीलीटर के लिए इस मिश्रण को जोड़ने-१६४० 20% FBS युक्त । हाइपोजैन्टाइन और थाइमिडीन के अंतिम सांद्रता क्रमशः १०० μM और 16 μM हैं ।
  2. Culture Sp2/0-Ag14 कक्ष ।
    1. संलयन से कम 7 दिन पहले, गर्म पानी में तरल नाइट्रोजन जम SP2/0-Ag14 मायलोमा कोशिकाओं की एक शीशी तेजी से गल ।
    2. सेल समाधान ताजा संस्कृति मध्यम (RPMI-१६४०) के 5 मिलीलीटर में स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज १००० एक्स जी पर ।
    3. अपकेंद्रण के बाद, संस्कृति मध्यम निकालें और ताजा RPMI में कोशिकाओं resuspend-१६४० 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक ।
    4. 5% सह2के वातावरण में एक 25 सेमी2 कुप्पी और ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते में कोशिकाओं और मध्यम स्थानांतरण ।
    5. फ्यूजन से पहले 3 या ४ ७५ सेमी2 बोतल करने के लिए कोशिकाओं का विस्तार करें ।
  3. उदर फीडर परत कोशिकाओं की तैयारी
    1. बलिदान एक 12 सप्ताह पुराने सेल फ्यूजन से पहले 1 दिन गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा ICR माउस और यह ७५% इथेनॉल में डूब ।
    2. हेमोस्टैटिक forceps के साथ पेट से फर को हटाने के बाद, ७५% इथेनॉल के साथ क्षेत्र कीटाणुरहित । उदर गुहा को बेनकाब करने के लिए बाहरी त्वचा को काटें । पेट में बाँझ RPMI के 3 मिलीलीटर इंजेक्शन-१६४० मध्यम और समाधान में अतिरिक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए पेट की मालिश । एक 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फीडर सेल निलंबन महाप्राण ।
    3. १००० x g पर 10 मिनट के लिए सेल निलंबन के बाद, supernatant छोड़ें और HAT चयनात्मक माध्यम के 20 मिलीलीटर में फीडर कोशिकाओं resuspend ।
    4. कोशिकाओं ९६ में स्थानांतरण-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट्स (१०० μL/ ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2पर रात भर प्लेटे सेते ।

4. सेल फ्यूजन

  1. के बाद चुना प्रतिरक्षित माउस सेल फ्यूजन के लिए तैयार किया गया है (२.४ कदम देखें), 10% क्लोरल हाइड्रेट (anesthetic) के एक intraperitoneal इंजेक्शन प्रशासन और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा प्रतिरक्षित माउस बलिदान ।
  2. दिल (1 मिलीलीटर) से अतिरिक्त रक्त ले लीजिए, और 2.3.1 कदम में वर्णित के रूप में तैयार करने के लिए संकर का चयन के दौरान एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें ।
  3. त्वचा और मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए तिल्ली बेनकाब कैंची का उपयोग ।
  4. चिमटी के साथ प्लीहा को अलग ध्यान से और RPMI के साथ तिल्ली धो-१६४० । तिल्ली को टुकड़ों में काटें और धीरे से तिल्ली को तराशी करने के लिए पाउंड करें । एक ८०० मेष सेल छलनी के माध्यम से तिल्ली ऊतक एक ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में दबाकर एक तिल्ली सेल निलंबन तैयार करें ।
  5. तिल्ली सेल निलंबन के साथ rpmi-१६४० मध्यम धो लें । (१००० x जी, 10 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस) केंद्रापसारक द्वारा तिल्ली कोशिकाओं फसल, और फिर supernatant त्यागने । इस वाशिंग स्टेप को तीन बार दोहराएं ।
  6. मशीन से खेती और प्रवर्धित मायलोमा कोशिकाओं को निकालें और धीरे से नल/एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए बोतल हिला । FBS को हटाने के लिए RPMI-१६४० मीडियम से दो बार इस सस्पेंशन को धोएं ।
    नोट: यह एक आवश्यक कदम के रूप में FBS सेल फ्यूजन को प्रभावित कर सकता है ।
  7. कोशिकाओं गिनती और प्लीहा कोशिकाओं के साथ मिश्रण से पहले एकाग्रता को समायोजित. मायलोमा कोशिकाओं के लिए प्लीहा कोशिकाओं के अंतिम अनुपात 1:5 और 1:10 के बीच होना चाहिए ।
  8. प्लीहा सेल निलंबन और मायलोमा कोशिकाओं को मिलाएं । सेंट्रीफ्यूज सेल मिश्रण (१००० x g, 10 min, और 4 ° c), और supernatant हटा दें ।
  9. कोशिकाओं को ५०% पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे 1 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर हलचल । 30 एस के लिए खड़े चलो ।
    नोट: इस चरण में प्रयुक्त खूंटी समाधान में कैल्शियम (Ca2 +) के बिना pbs में ५०% (w/v) पॉलीथीन ग्लाइकोल १५०० और 10% (v/v) डाइमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO) शामिल होना चाहिए ।
  10. RPMI के 2 मिलीलीटर जोड़ें-2 मिनट के लिए १६४० मध्यम प्रतिक्रिया समाप्त करने के लिए । एक और 1 मिनट के लिए RPMI-१६४० मध्यम के एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर जोड़ें, और फिर RPMI के एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर-१६४० मध्यम जोड़ें ।
  11. सेंट्रीफ्यूज ८०० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं । सुपरनैटंट को खारिज करने के बाद हैट सॉल्यूशन जोड़ें और कोशिकाओं की खेती जारी रखें । फिर फीडर लेयर प्लेटों के प्रत्येक कूप में सेल सस्पेंशन के १०० μL को जोड़ें और 7 दिनों के लिए प्लेट्स को ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2पर सेने ।
    नोट: इन शर्तों के तहत, जब तक कि संकर कोशिकाओं को टोपी माध्यम में विकसित करने के लिए जारी रहेगा यूटयूम मायलोमा कोशिकाओं मर जाएगा । 7 दिनों के बाद, मोनोक्लोनल संकर कूप में कोशिकाओं के एकल समूह के रूप में होगा, जबकि polyclonal संकर युक्त कुओं कोशिकाओं के कई समूहों होगा ।
  12. विश्लेषण के लिए supernatant महाप्राण और एचटी माध्यम के साथ माध्यम की जगह ।
    नोट: सीधे unअनुपूरक माध्यम के लिए स्विचन के रूप में एचटी माध्यम के साथ टोपी मध्यम स्थानापन्न करने के लिए सुनिश्चित हो संकर के लिए हानिकारक है ।

5. अप्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी एलिसा (icELISA)

  1. कोट एक ९६-well थाली के साथ नार-ओवा (1 μg/mL, १०० μL/well) और 1 एच के लिए सेते ३७ डिग्री सेल्सियस पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ।
  2. गैर-विशिष्ट अधिशोषण को रोकने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए ३०० μL के साथ प्लेट को ब्लॉक करें (PBS 1% m/v जिलेटिन युक्त) ।
  3. थाली धोने TPBS के साथ तीन बार (PBS ०.०५% v/v Tween-20 से युक्त) ।
  4. 10% मेथनॉल के साथ सांद्रता की एक श्रृंखला में अननुजुटेड नर तनु । इन डिल्यूटियों में से ५० μL को अलग कुएं में डालें । अन्य कुओं में, एंटी-सीरम या संकर डोमा (mAbs युक्त) के ५० μL जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए थाली सेते ।
  5. Peroxidase के १०० μL जोड़ें-लेबल विरोधी माउस IgG प्रत्येक अच्छी तरह से और एक अतिरिक्त 1 एच के लिए सेते ।
  6. थाली धोने के बाद tpbs के साथ तीन बार, सब्सट्रेट समाधान के १०० μl जोड़ें (०.१ मीटर साइट्रेट बफर (4) ०.०१५% v/v एच22 और 2 मिलीग्राम/एमएल 3, 3 ', 5, 5 '-टेट्रामेथिल बेन्जिडीन (tmb)) प्रत्येक अच्छी तरह से और 15 मिनट के लिए सेते ।
  7. 1 एम एच2के ५० μl जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से4
  8. ४५० एनएम पर एक microplate रीडर का उपयोग कर absorbance उपाय । संकर है कि आगे की तैयारी के लिए अपने supernatant में नार एंटीबॉडी के उच्चतम सांद्रता स्रावित चुनें ।

6. मोनोक्लोनल हाइपरडोस की तैयारी

  1. मोनोक्लोनल हाइब्रिड तैयार करने के लिए सीमित तनुकरण विधि का प्रयोग करें ।
    1. चयनित हाइब्रिड (अर्थात, नार एंटीबॉडी स्राव के लिए उन सकारात्मक) से एचटी मीडियम को हटाने के बाद, RPMI-१६४० में कोशिकाओं resuspend और उन्हें गिनती.
    2. 1 सेल, 2 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को पतला, और अच्छी तरह से प्रति 4 कोशिकाओं १०० μL में RPMI-१६४० एक ९६-well थाली में. ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते, 5% सह2
    3. 7-10 दिनों के बाद, icELISA प्रोटोकॉल (चरण 5) का उपयोग कर संस्कृति supernatant में नार एंटीबॉडी का पता लगाने । संकर से कोशिकाओं हस्तांतरण कि नार एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक 24-well प्लेट्स, 25 सेमी2 बोतल है, और ७५ सेमी2 खेती के लिए बोतल है ।
  2. मोनोक्लोनल हाइडोमोस को Cryopreserve ।
    1. फसल कोशिकाओं और उन्हें सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के लिए स्थानांतरण.
    2. कोशिकाओं (८०० x जी, 10 मिनट) अपकेंद्रण के बाद, supernatant हटाने और ठंड मध्यम (rpmi-१६४०, 20% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), और 10% dmso) में कोशिकाओं resuspend । सेल निलंबन cryotubes के लिए स्थानांतरण ।
    3. 24 ज के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर एक ढाल शीतलक बॉक्स में cryotubes स्टोर । फिर लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए cryotubes हस्तांतरण ।

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Representative Results

मोनोक्लोनल हाइडोमोस का उत्पादन

Hapten वाहक संयुग्मी के आणविक वजन की पुष्टि मालदी-TOF-MS विश्लेषण द्वारा की गई थी । BSA और नार दोनों के आणविक भार के रूप में जाना जाता है, BSA के साथ संयुग्मित छोटे अणुओं की संख्या की गणना की जा सकती है । चित्रा 1 नार-bsa22, जो एम/जेड ७७,०५८ पर एक व्यापक चोटी प्रदर्शित करता है के लिए प्रतिनिधि स्पेक्ट्रल परिणाम से पता चलता है । के रूप में BSA के औसत आणविक वजन ६६,४३० है, ऐसा लगता है कि कम से 18 नार अणु (मेगावाट ५८१) BSA (मोलर युग्मन अनुपात (नार: BSA) = 18:1) के साथ संयुग्मित थे ।

आईसीएलएसए माउस प्रतिरक्षण22के बाद एंटी-सीरम टिटर्स का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन किया गया. ऐसा प्रतीत होता है कि सीरम एंटीबॉडी चार चूहों के नार-BSA संयुग्मी के साथ टीके से काफी अधिक है कि नियंत्रण माउस के लिए मनाया (चित्रा 2) थे । उच्चतम अनुमापांक (1:5000) के साथ माउस सेल फ्यूजन के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

के बाद इस माउस से प्लीहा कोशिकाओं उदर फीडर परत कोशिकाओं को संगलित थे, संकर 7 दिन inselection माध्यम के लिए बड़े हो गए थे । आईसीएलएसए का प्रयोग करते हुए सेल कल्चर सुपरनैटंट का परीक्षण किया गया था, और एनएएस मबों के लिए संहाइडोस पॉजिटिव थे और उनका विस्तार हुआ । चित्रा 3 में छवियों स्थिर मोनोक्लोनल और polyclonal संकर कोशिका लाइनों के लिए पारंपरिक परिणामों को दर्शाते हैं ।

जांच और विरोधी के आवेदन-नार mAb

इस प्रयोग के महत्वपूर्ण बिंदु mAb विशिष्टता की स्क्रीनिंग है । तालिका 1 में परिणाम प्रदर्शित करता है कि इस प्रयोग में mab के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की लेकिन नहीं अवरुद्ध बफर या वाहक प्रोटीन22। इसके अलावा, mAb की विशिष्टता और संरचनात्मक रूप से संबंधित यौगिकों के साथ अपने पार जेट परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया था । तालिका 2 परिकलित क्रॉस-जेट दर दिखाता है । के रूप में अंय flavonoids परीक्षण के लिए पार जेट की दर सभी 2% से भी कम थे, यह स्पष्ट है कि इस mAb22नार के लिए विशिष्ट है ।

एक icELISA विरोधी नार mAb का उपयोग कर विकसित किया गया था और इस पद्धति के आवेदन पर प्रकाश डाला गया. नार के ज्ञात सांद्रता युक्त समाधान का उपयोग करना, एक मानक वक्र इन समाधानों के अवशोषण का उपयोग कर प्लॉट किया गया था और एस मॉडल वक्र की रैखिक सीमा (ऊपरी-सही आंकड़ा इनसेट में दिखाया गया) की गणना की गई थी । रेखीय प्रतीपगमन समीकरण (y =-०.१७६ ln (x) + १.१२४३, R2 = ०.९९७८) इस वक्र के लिए परिकलित अज्ञात नमूनों के मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

उत्पादन और glycyrrhizic एसिड के खिलाफ एक mAb के लक्षण वर्णन

इस शानदार का उपयोग कर/myeloma सेल फ्यूजन प्रोटोकॉल, एक मोनोक्लोनल संकर स्राव विरोधी glycyrrhizic एसिड mAb, नाम DF5, भी स्थापित किया गया था18। इस DF5 mAb के उपप्रकार एक कप्पा प्रकाश श्रृंखला (तालिका 3) के साथ IgG1 के रूप में पहचाना गया था । इसके बाद के संस्करण के विश्लेषण के लिए इसी तरह, mAb अतिरिक्त स्क्रीनिंग और अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था, जबकि प्रतिजन विशिष्ट मोनोक्लोनल संकर तरल नाइट्रोजन में लंबी अवधि के भंडारण के लिए andcryopreserved का विस्तार किया गया ।

कोटिंग पदार्थ A४५० मान क्रॉस-जेट (%)
नार-ओवा ०.९७ १००
Ova ०.०५६ < 0.01
Bsa ०.०६८ < 0.01
जिलेटिन ०.०५३ < 0.01
स्किम मिल्क ०.०५ < 0.01

तालिका 1. नर-OVA और वाहक प्रोटीन के साथ एंटी-नार mAb की जेट ।

वर्गीकरण यौगिक क्रॉस-जेट (%)
Flavonoids Naringin १००%
प्यूराइन १.२६%
नियोहेपरिनिडाइन १८.८०%
रुटीन १.९५%
Baicalein < 0.09%
Hyperoside < 0.09%
Terpenes जिनसेनोसाइड Rg2 < 0.09%
जिनसेनोसाइड Rb1 < 0.09%
जिनसेनोसाइड री < 0.09%
नोटोजिनसेनोसाइड < 0.09%
ग्लाइसिआरहाइजिक अम्ल < 0.09%
ग्लाइसिररहेटिक अम्ल < 0.09%
साइकोस्पोनइन < 0.09%
पाएनिफ्लोरेन < 0.09%
जेन्टोपिरिन < 0.09%
स्टेराइडस चोलिक अम्ल < 0.09%
डिऑक्सीचोलिक अम्ल < 0.09%
Anthraquinones रुमैमोडीन < 0.09%
रिइनिक अम्ल < 0.09%
अन्य सेलविऐनोलिक अम्ल < 0.09%
Curcumin < 0.09%
गैजराइडिन < 0.09%
Amygdalin < 0.09%

तालिका 2. क्रॉस-जेट (%) नार और उसके संबंधित यौगिकों के खिलाफ विरोधी नार mAb की ।

समप्ररूप भारी शृंखला प्रकाश शृंखला समप्ररूप
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 Iga आईजीएम कापा लैम्ब्डा
DF5

तालिका 3. MAb के Isotype विश्लेषण DF5 ।

Figure 1
चित्रा 1: माल्डी-TOF-एमएस विश्लेषण के नार-bsa संयुग्मी । [M + H] + और [M + 2h]2 + क्रमशः नार-bsa के एकल और दोहरे-protonated अणुओं को इंगित करते हैं । इस आंकड़े को Qu एट अल., २०१६22 से संशोधित किया गया है 

Figure 2
चित्रा 2 : IcELISA द्वारा एंटी सीरम टीटर का विश्लेषण. चूहों 1-4 नार-BSA संयुग्मी के साथ प्रतिरक्षित थे, जबकि नियंत्रण वाहन (PBS) के साथ प्रतिरक्षित किया गया था । डेटा माध्य ± मानक विचलन (SD) (n = 3) का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े को Qu एट अल., २०१६22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 3
चित्रा 3 : के प्रतिनिधि छवियां स्थिर मोनोक्लोनल (A) और पॉलीक्लोनल (B) संकर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 4
चित्रा 4 : एक icELISA में विरोधी नार mAb के आवेदन । नार की विभिन्न सांद्रता को नार-ओवा (1 एमजी/एमएल) से पूर्व कोटेड कुओं में एमएबी के साथ इनयूबेटेड किया गया था । क-नार की उपस्थिति में अवशोषक होता है, जबकि अ0 न्र की अनुपस्थिति में अवशोषक होता है । डेटा माध्य ± मानक विचलन (SD) (n = 3) का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े को Qu एट अल., २०१६22से संशोधित किया गया है । 

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Discussion

यहां, हम प्राकृतिक उत्पाद के खिलाफ mAbs के सफल उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत-छोटे अणुओं व्युत्पंन । प्रक्रिया में आवश्यक कदम को रेखांकित किया गया है, और हम एक उदाहरण छोटे अणु के रूप में नार का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है । उदाहरण स्पेक्ट्रा, अभिक्रियाशीलता विश्लेषण, और icELISA परिणाम सभी प्रतिनिधि प्रयोगात्मक और नियंत्रण डेटा है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त की है दिखाओ । उदाहरण के संकरे की छवियां एक विज़ुअल प्रस्तुतिकरण प्रदान करती हैं कि शोधकर्ता को मोनोक्लोनल और पॉलीक्लोनल हाइब्रिड के बीच अंतर करने के लिए क्या देखना चाहिए । एक साथ लिया, हम का प्रदर्शन किया है कि mAb उत्पादन, लक्षण वर्णन, और आवेदन रणनीति यहां प्रस्तुत एक छोटे से अणु के खिलाफ एक प्रभावी mAb के निर्माण में परिणाम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशेष mAb है कि परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर आधारित एक उपंयास ELISA अन्य प्राकृतिक उत्पादों में लक्ष्य अणु की अभिव्यक्ति ।

एंटीबॉडी के किसी भी प्रकार के साथ काम करना, इस प्रक्रिया के दौरान पैदा हो सकता है कि सबसे आम मुद्दा mAb की संवेदनशीलता के साथ जुड़ा हुआ है । वास्तव में, वहां एक उच्च जोखिम है कि mAb के रूप में कम संवेदनशीलता, उच्च क्रॉस-जेट, या अंय कारकों की वजह से उंमीद काम नहीं करेगा । पूरी प्रक्रिया को पूर्ण रूप से पूरा करने में 4 महीने लगते हैं, इसलिए हाइब्रिड से स्रावित mAbs की आरंभिक स्क्रीनिंग के दौरान ध्यान रखना महत्वपूर्ण है । एक आवश्यक पहलू एक अप्रभावी mAb बनाने से बचने के लिए सेल फ्यूजन से पहले icELISA द्वारा विरोधी सीरम स्क्रीन के साथ पुष्टि प्रतिक्रियाशील लेकिन वाहक नहीं है । यह दो अलग प्रोटीन वाहक का उपयोग करके किया जाता है (इस मामले में BSA और OVA) immunogen और कोटिंग antigen वाहक के रूप में क्रमशः । Hapten-BSA संयुग्मी के साथ प्रतिरक्षण के दौरान, जानवरों दोनों hapten (जैसे, नार) और bsa के खिलाफ एंटीबॉडी का उत्पादन होगा । इस प्रकार, स्क्रीनिंग के दौरान विरोधी BSA एंटीबॉडी के झूठे-सकारात्मक पता लगाने से बचने के लिए, hapten-OVA विशेष रूप से विरोधी hapten एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इन दो प्रोटीन वाहक के निर्माण के साथ ही जब उंहें उपयोग करने के लिए स्पष्ट रूप से प्रोटोकॉल में प्रकाश डाला है ।

यह भी ध्यान देने की बात है कि मोनोक्लोनल हाइब्रिड की तैयारी के दौरान, सीमित तनुकरण विधि अक्सर कई बार दोहराया जाने की जरूरत है जब तक कि मोनोक्लोनल कोशिकाओं से युक्त कुओं के सभी सकारात्मक हैं. इस पुनरावृत्ति की पुष्टि करने के लिए कि हर क्लोन stably विशिष्ट एंटीबॉडी रहस्य में मदद करता है ।

इस विधि की सीमाओं में संकर पीढ़ी की जटिल प्रक्रिया और वांछित एंटीबॉडी-उत्पादक संकर के चयन के लिए आवश्यक समय शामिल है । हालांकि, एक बार mAb प्राप्त है और icELISA विकसित की है, प्राकृतिक उत्पादों में लक्ष्य यौगिक का पता लगाने जल्दी और कुशलता से किया जा सकता है । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल अंय विश्लेषण तकनीकों के साथ जुड़े लागत में से कुछ से बचने के लिए और हर प्राकृतिक उत्पाद का परीक्षण के लिए लगातार महंगे उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है ।

एक बार उत्पादित और जांच की, hapten mAb व्यापक रूप से विश्लेषण की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक elisa में mab के उपयोग पर ध्यान केंद्रित पद्धति है कि छोटे अणु के जीव विज्ञान के रूप में अच्छी तरह से अपनी फार्माकोकइनेटिक बातचीत20,22के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस प्रोटोकॉल के साथ बनाए गए अंय mAbs भी संरचनात्मक analogues18epimers सहित, के पृथक्करण के लिए एक mabs आधारित immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी विधि स्थापित करने केलिए इस्तेमाल किया गया है, साथ ही साथ एक पार्श्व प्रवाह immunoaffinity23 लक्ष्य अणु का तेजी से और साइट पर पता लगाने के लिए । इन अध्ययनों को यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पादित mAbs के व्यापक आवेदन पर प्रकाश डाला । इस प्रकार, इस प्रक्रिया, और mAbs बनाया, विभिंन लक्ष्य Mabs आधारित immunoassays है कि प्रभावी ढंग से मूल्यांकन और प्रकृति उत्पादों के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है के विकास के लिए एक नींव के रूप में कार्य करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या ८१५७३५७३, ८१४७३३३८, और ८१५०३३४४) और चीनी चिकित्सा के बीजिंग विश्वविद्यालय में शास्त्रीय पर्चे बुनियादी अनुसंधान टीम द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
800 mesh (40 μm nylon) filter  FALCON 352340
24 well culture plate NUNC 119567
25 cm2 Flask Labserv 310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) Sigma Aldrich 860336 1G
75 cm2 Flask Corning 430720
96 well culture plate NUNC 117246
bovine serum albumin AMRESCO 332
cell strainer FALCON 352340
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
cryotubes, 1 mL  Sigma Aldrich V7384-1CS
cultivator DRP-9082  Samsung
dialysis membrane (10kDa) Heng Hui 45-10000D
dimethylsulfoxide Sinopharm Chemical DH105-10
electronic balance  BS124-S  Sartorius
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
ethanol, 96% Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
fetal calf serum Invitrogen 10270106
Freund´s adjuvant, complete Sigma Aldrich SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete Sigma Aldrich SLBL0210V
Gelatin AMRESCO 9764-500g
Gradient cooler container Nalgene 5100-0001
HAT media supplement Sigma Aldrich H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
HT media supplement Sigma Aldrich H0137-10VL
Inverted Microscope IX73 Olympus 
keyhole limpet hemocyanin Sigma Aldrich H8283
MALDI-TOF-MS  Axima-CFR  plus   Axima 
Microplate Reader BioTex ELX-800 
mouse Vital River  BALB/c
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG Sigma Aldrich RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution Hyclone SV30010
Pipette 10 mL COSTAR 4488
Pipette 25 mL FALCON 357525
RPMI 1640 Corning 10-040-CVR
skim milk applygen P1622
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021

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References

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प्राकृतिक उत्पादों के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन
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Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).More

Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).

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