Изоляции и культуры грызунов микроглии для поощрения динамичного разветвленная словотолкование в среде Serum-free

Summary

Усилия, чтобы понять микроглии функции подробно препятствовало отсутствие микроглии культуры моделей, которые пилки свойства зрелых в vivo микроглии. Этот протокол описывает изоляции и культуры подхода, призванного поддерживать надежные выживания микроглии весьма разветвленной зрелых крыс в условиях определенных средний.

Abstract

Микроглии представляют собой 5-10% от всех клеток центральной нервной системы (ЦНС) и все чаще обращают внимание из-за их вклад во время разработки, гомеостаза и болезни. Хотя макрофаги были изучены подробно на протяжении десятилетий, специализированные особенности микроглии, ткани резидентов макрофаги ЦНС, остаются во многом загадочный, отчасти из-за ограничений в способность резюмировать Зрелые микроглии свойства в культуре. Здесь мы иллюстрируем простой процедуры для быстрой изоляции чистого микроглии от зрелого грызун мозга. Мы также обсудим условия сыворотки свободной культуры, которые поддерживают высокий уровень жизнеспособности микроглии со временем. Микроглии, культивируемых в этих условиях определяется средний exhibit сложной разветвленной процессы и поведение динамического наблюдения. Мы иллюстрируют некоторые последствия воздействия сыворотки на искусственный микроглии и обсудить, как эти сыворотки свободной культуры по сравнению с сыворотка облученных культур, а также микроглии в естественных условиях.

Introduction

Как макрофаги паренхимы ЦНС микроглии взаимодействуют с огромным набором схем нейронов и глиальных сигнальной сети. Они играют жизненно важную роль в развитии и гомеостаза головного мозга через синаптических обрезки, Распродажа apoptotic клеток и переходных взаимодействия с нейрональные процессы^1,2. Микроглии являются раннего реагирования неврологических травм, расширяя их длинные, тонкие процессы для поражения сайтов для координации воспалительных реакций и ограничить кровотечение^3,4. Изменения в микроглии морфологии и функции являются вездесущими в острых и хронических травм ЦНС, и микроглии экспонат изменения морфологии, локализации и проявление воспалительных медиаторов в разнообразных заболеваний Штатов¹. Человеческие генетические исследования показывают, что мутации, которые изменяют риска для нейродегенеративные заболевания часто преимущественно или исключительно выражаются микроглии в неповрежденной ЦНС, указывая на важную роль для микроглии в патогенезе заболевания или прогрессирование⁵ . Учитывая их известность в травм и болезней, углубление понимания биологии микроглии является приоритетной для разработки новые терапевтические подходы.

Многие критические достижения понимания биологии микроглии возникли путем экстраполяции методы и механизмы, обнаружили в исследованиях других групп населения макрофагов, включая методы культуры, профили выражение гена и определения функциональных / Морфологические государств. Хотя обобщенные макрофагов, функции часто разыгрывают неожиданными способами в пределах ландшафта ЦНС, микроглии сами по себе являются узкоспециализированными, выставляют разветвленной морфологии и уникальный ген выражение подпись, которая отличает их от других тканей макрофаги⁶. Микроглии есть линия, которая отличается от большинства других тканевых макрофагов; они колонизировать ЦНС во время ранних эмбриональных волны примитивных кроветворения и самостоятельно обновить на протяжении всей жизни, независимо от взносов от окончательного кроветворения⁷. Полностью зрелые ген выражение подпись взрослого микроглии достигается не до второго послеродовой неделю⁸. Экологические сигналы от окружающих тканей играют важную роль в диктует макрофагов ткани специфических особенностей⁶, которая в ЦНС включает ограниченное воздействие факторов кровь, предоставленные blood - brain барьер⁹.

Одним из препятствий для полного понимания микроглии вклад ЦНС гомеостаза и болезней является сложность изложив специализированные свойства зрелых микроглии видели в vivo с очищенной ячейки в пробирке. Многие методы были разработаны для изоляции и культуру нетронутыми микроглии, но большинство подходов полагаться на сыворотке поддержать выживание клетки. Мы показали, что добавление сыворотки, которая по своей сути переменной реагента, содержит широкий спектр биологически активных молекул, особенно проблематичным, когда работа с микроглии потому, что он способствует Саркодовые морфологии, увеличение распространения, и увеличение фагоцитоза⁹ часто видели в естественных условиях , когда Микроглия подвергаются воздействию факторов кровь после нарушения blood - brain барьер. От этих показателей, сыворотка подвергается клетки напоминают травмы или заболевания государств микроглии, но такие изменения уменьшаются когда Микроглии являются культивировали в определенный рост среднего, содержащий РСУ-1 (или IL-34), TGF-β, холестерин и селенит.

Этот протокол обеспечивает детали для культивирования несовершеннолетних крыса микроглии сыворотки свободных условиях, связанных с недавно опубликованной работе⁹. Этот протокол упрощен для крыс от послеродового день 21-30 (P21 - P30), но может быть адаптирована к изолировать микроглии от крыс и мышей, любого возраста, хотя доходности и общей жизнеспособности будет варьироваться в зависимости от вида и возраста животного. Максимальная урожайность и оптимальной эффективности достигается при использовании немного незрелых микроглии (~ P9), урожайность и жизнеспособности, постепенно сужающийся к несколько более низкого уровня в взрослых животных. Микроглии также могут быть изолированы от мышей, но мы обнаружили, что клетки крыс показывают значительно выше урожайность, жизнеспособность и сложности разветвленной морфологии, когда по сравнению с клетки мыши в сыворотке бесплатно культур. Животных в возрасте более чем P50 не были оценены с настоящим Протоколом. Эта процедура изоляции immunopanning была оптимизирована для сведения к минимуму изменения в микроглии транскрипционный анализ профиля при изоляции и максимального течению жизнеспособность клеток. С помощью этих методов и средств массовой информации формулировок, высокой жизнеспособности первичных культур может быть устойчивым на недели. Микроглии, культивируемых в этих условиях проявляют весьма разветвленная Словотолкование, быстрое расширение и втягивание процессов и относительно низкие показатели распространения. Мы подчеркнуть значимость сыворотки воздействия на эти свойства и обсудить сильные и слабость этого метода по сравнению с другими подходами.

Protocol

Все процедуры с участием грызунов соответствует Стэнфордского университета руководящие принципы, которые соответствуют национальных и государственных законов и политики. Все животные процедуры были одобрены Стэнфордского университета административной панели на лабораторных животных уход.

Примечание: В Таблице материалыпредоставляются все решения и буфера композиции.

1. Подготовьте чашку Петри для CD11b Immunopanning (день 0)

Примечание: 1 immunopanning блюдо готовиться каждые 1-2 несовершеннолетних крыса мозги.

1. Добавьте 25 мл 50 мм трис pH 9.5 раствора в чашке Петри 15-см.
2. Добавьте козье анти мыши IgG (H + L цепи) в блюдо для конечной концентрации 6 мкг/мл. Вихрем пластины равномерно распределить.
3. Инкубировать блюдо для 1-3 ч при 37 ° C.
4. Полоскания блюда три раза с DPBS⁺⁺ (фосфат амортизированное saline (PBS) с Ca^{2 +} и Mg^{2 +}), затем заменить раствором панорамирование буфер, содержащий 1 мкг/мл OX42 антител. Оставьте блюда на ночь при комнатной температуре на плоской поверхности.

2. ткани коллекции (1 день)

Примечание: Этот протокол должен взять ~ 3-4 ч.

1. Перед началом, убедитесь, что все решения стерильных и охлажденные на льду. Холод все документы на льду и стерилизовать с этанолом, перед использованием.
2. После соответствующих нормативных процедур жертву несовершеннолетних Лаборатория Крыса удушение углекислого газа.
   Примечание: Кроме того, молодых животных могут быть принесены в жертву с смертельной дозы кетамина/Ксилазина (100-200 мкл рабочего раствора кетамина 24 мг/мл, Ксилазина 2,4 мг/мл). Кетамин/Ксилазина должен использоваться, если животных не менее 14 дней. При использовании нескольких животных, экстракт тканей из одного животного и поместить его в предварительно охлажденные DPBS⁺⁺ на льду, прежде чем приступить к последующим животных.
3. Щепотка hindpaw и обеспечить полное отсутствие отклика от животного перед продолжением.
4. Transcardially perfuse животное с 10-30 мл ледяной перфузии буфера с помощью иглы 27½-G, до тех пор, пока буфер работает четко.
   Примечание: Объем перфузии буфера будет варьироваться в зависимости от размера и возраста животного.
5. Сразу же после перфузии удалите голову животного. Поступающие из спинного мозга вырезать затылочного мыщелка на каждой стороне Рассечение ножницами, будьте осторожны, чтобы не повредить мозг. После резки каждой стороны тщательно, разрезать одну сторону вдоль теменной и лобной кости к носовой кости. С щипцами осторожно тянуть обратно в верхней части черепа, быстро удалить мозга (или структуры ЦНС интерес) и поместить в предварительно охлажденные DPBS⁺⁺ на льду.
6. Повторите для всех остальных животных.
   Примечание: Все разбирательства шаги должны выполняться в Ламинарный шкаф в надлежащих условиях стерильности.

3. механические диссоциации (1 день)

1. После того, как были собраны все мозги, нарезать 1 мм³ куски в чашке Петри, на льду одного мозга с лезвием скальпеля холодной и передавать гомогенизатор ледяной dounce с 5-7 мл ледяной douncing буфера. Отделить один мозг одновременно.
2. Отделить ткани с помощью 10-20 нежный и неполной штрихи с гомогенизатор dounce свободную. Будьте осторожны не непосредственно раздавить ткани на нижней части гомогенизатор, но вместо этого Импел ткани через пространство между сторонами поршень и гомогенизаторы.
3. Осторожно выньте поршень для предотвращения появления пузырьков воздуха. Разрешить плохо диссоциированных ткани куски поселиться в нижней части гомогенизатор и передачи супернатант новой охлажденные 50 мл Конические трубки.
4. Замените удаленные тома свежие douncing буфера и повторите шаги 3.2 и 3.3 для в общей сложности 3-4 раундов, или до тех пор, пока отделить все ткани. Повторите процедуру для каждой мозга.

4. миелина удаления (1 день)

Примечание: Миелина удаления используется для изоляции микроглии от животных старше P12.

1. Измерить объем суспензии клеток в 50-мл Конические трубки с помощью пипетки 25 мл, а затем добавить ледяной douncing буфер для регулировки объема до 33,5 мл.
2. Добавьте 10 мл миелина разделения буфера (MSB) суспензии клеток и смесь тщательно, инвертирование трубке несколько раз. Это приведет к 23% конечной концентрации MSB в объеме 43,5 мл.
3. Центрифуга для ячейки 15 мин на 500 x g при 4 ° C с медленным торможения.
   Примечание: Центрифуги должен занять примерно 1,5-2 мин замедляться. Это будет генерировать верхний слой миелина и мертвые клетки мусора, несколько темных супернатант и меньше Пелле, который обогащен для живых клеток.
4. Снять верхний слой миелина/мусора и супернатант с пипеткой. Будьте осторожны при удалении верхнего слоя для обеспечения как большая его часть удаляется как можно.
5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 12 мл панорамирование буфера. Аккуратно нарезанных суспензию клеток разрушить любой скопления клеток, которые могли остаться.

5. Immunopanning (1 день)

1. Передайте суспензию клеток через стрейнер ячейки 70 мкм для удаления больших мусор или скопления клеток.
2. Промойте с покрытием OX42 сдвига блюдо три раза с DPBS⁺⁺. Не позволяйте пластину для полностью сухой между моет.
3. Слить последний DPBS⁺⁺ мыть и применить отфильтрованные клеток подвеска для панорамирования блюдо. Аккуратно водоворот пластину для распространения клеток, а затем инкубировать пластину на плоской поверхности при комнатной температуре для 20 минут, чтобы позволить клетки присоединиться. Не дольше 20 минут инкубации или клетки станет очень трудно оправиться от блюдо.
4. Промойте панорамирования блюдо с DPBS⁺⁺ 10 раз для удаления не сторонник клеток. Микроглии будет настолько прочно прикреплены к плите, вихрем пластины с каждого полоскания для обеспечения удаления других клеток не сторонник.
5. Слить последний DPBS⁺⁺ мыть и заменить 15 мл DPBS⁺⁺ и 200 мкл трипсина (1,25% раствор).
6. Инкубируйте блюдо крупностью до 10 минут при 37 ° C с 10% CO₂ в trypsinize.
   Примечание: Не продолжаться дольше, чем 10 мин или микроглии станет трудно удалить.
7. После 10 минут trypsinization будет по-прежнему застрял микроглии к пластине. Слить трипсина/DPBS⁺⁺ и осторожно промыть 2 x с DPBS⁺⁺ удалить трипсина, заменить 12 мл ледяной микроглии роста средних (MGM).
8. Место, панорамирование блюдо на льду на 2 мин, чтобы помочь ослабить взаимодействия клеток/подложки и убедитесь, что блюдо плоские, чтобы предотвратить высыхание областях сдвига блюдо.
9. Пипетка энергично, с 10-мл пипетки и пипетки контроллером на высокой скорости для восстановления клеток от сдвига блюдо. Нарисуйте сетку 16 x 16 с потоком жидкости из пипетки попытаться удалить все клетки.
10. Проверьте клетки под микроскопом, при 20-кратном чтобы убедиться, что клетки отсоединяется от пластины. Марк пятна на вершине блюдо, где клетки все еще застряли и повторить, дозирование в этих областях.
11. Собирайте суспензию клеток и аликвота 3-4 мл супернатант в 15 мл Конические трубки. Спина на 15 мин на 500 x g при 4 ° C с медленным торможения.
    Примечание: Спиннинг микроглии через небольшой объем позволяет для максимального восстановления клеток.
12. Аспирационная супернатанта, оставляя 0,5 мл MGM с Пелле ячейки.
13. Ресуспензируйте каждой гранулы в оставшихся MGM и объединить клетки от всех трубок.
14. Подсчет количества ячеек с Горяева.
15. Плита клетки, как описано в шагах 6 - 7 в зависимости от приложения.
16. Культура клетки при 37 ° C с 10% CO₂.
    Примечание: Клетки могут быть культуры до 3-4 недель с регулярные СМИ изменений или одной недели без изменения средств массовой информации.

6. пятно покрытие культуры ткани пластины/Coverslips (1 день)

1. Плиты 15 мкл коллаген IV покрытия непосредственно в центре пластины 24-ну анионные/Катионный покрытием культуры тканей (подробную информацию см. в Таблице материалы ) и инкубировать в течение 15 минут при 37 ° C с 10% CO₂.
2. После подсчета клеток с Горяева разбавляют клетки 2.3 x 105/мл в MGM. Аспирационная коллаген IV место и сразу же пластины 15 мкл суспензии клеток в этом месте; Это даст 3.5 x 10³ клеток/спот. Инкубируйте 5-10 мин при 37 ° C с 10% CO₂ разрешить клетки, чтобы присоединиться, добавить 500 мкл CO_2-достижение равновесного уровня TGF-β2/Ил-34/холестерин, содержащий роста среднего (TIC) осторожно к колодцу.
3. Если покрытие на coverslips, первый слой стерильных стеклянных coverslips с 10 мкг/мл уловки D-Лизин (PDL) H₂O 1 h на RT, промойте H₂O 3 раза и пусть высыхает в капюшоне под УФ светом. После coverslips сухой, продолжите пятно покрытие на coverslips, как описано в шаге 6.2.

7. покрытие для изоляции RNA/белков

1. День 1, пальто всей области 24-ну анионные/катионных покрытием культуры ткани пластины с покрытием коллаген IV и инкубировать на 10 мин - 1 ч при 37 ° C с 10% CO₂, затем удалить и сразу же пластины 3-5 x 10⁴ клетки/колодец в CO₂ достижение равновесного уровня ТИЦ СМИ.
2. На 2 день выполните изменения 50% средств массовой информации для каждого хорошо на следующий день после приготовления. Мертвые клетки, как правило, кластер в центре хорошо, так что СМИ от там.
3. Выполните изменения СМИ 50% каждые 2-3 дня для поддержания культур. Если средства массовой информации изменения ввести ненужные переменной для культур, клетки могут выжить в течение приблизительно 1 неделю без изменений средств массовой информации, в отличие от более чем 3 недели регулярного технического обслуживания.

Representative Results

Этот протокол описывает метод для культуры высокой чистоты разветвленное микроглии от несовершеннолетних крыс. Аналогичные результаты можно получить с помощью незрелых, перинатальной и взрослых животных, как описано ниже. Поскольку ячейки изоляции часто включают в себя тонкие нюансы и множество возможностей для клетки, чтобы умереть, мы использовали контрольно-пропускные пункты контроля качества для определения успеха на различных этапах. Мы обычно контролируется клеточных суспензий, с помощью Горяева на несколько шагов в протоколе изоляции (рис. 1A). Успешной изоляции должна принести 2,5-5 x 10⁵ клеток/несовершеннолетних животного. Животные из P7 - P15 шоу урожай ближе к 5 x 10⁵ клеток/животное, тогда как клетки изолированы от животных старше P30 Показать доходность ближе к 2,5 x 10⁵ клеток/животное. Помимо мониторинга ячейке рассчитывает на протяжении протокол, важно определить общее состояние здоровья изолированных клеток, которые могут быть трудным, потому что микроглии изолированы таким образом имеют округлые или биполярной морфологией в течение первых нескольких дней в культуре . Здесь мы включили изображения фазы P25 микроглии в культуре в первые 6 дней после изоляции в ТИЦ и TIC, содержащие 10% плода телячьей сыворотки (FCS) (рис. 1B).

Рисунок 1: Оценка состояния клеток во время Протокол изоляции и в течение 6 дней культуры. (A) фазово контрастной фото иллюстрирующие контроля качества контрольно-пропускные пункты на назначенный шаги процедуры изоляции клеток. Путем смешивания 9 мкл сотовых подвеска с 1 мкл 0,4% Трипановый синий перед загрузкой на Горяева были образы клеточных суспензиях. Другие изображения показывают панорамирования блюдо само по себе, и все изображения показываются как одно поле при 20-кратном. Шкалы бар, 200 мкм. MGM, микроглии среднего роста. (B) время курс микроглии морфологических изменений и распространения более 6 дней культуры в сыворотке бесплатно ТИЦ среднего или TIC плюс 10% плода теленка сыворотки роста (FCS). CD11b-immunopanned клетки были на месте покрытием на табличке коллаген покрытием анионные/Катионный покрытием тканевой культуры (см. Таблицу материалов для деталей), и то же поле было imaged при фазово контрастной каждые 24 ч. Шкала бар, 100 мкм. TIC, TGF-β2/Ил-34 / Холестерин содержащие среднего роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обычной оценки здоровья и жизнеспособности изолированных клеток имеет важное значение для успешного проведения экспериментов и повторяемость. Здесь мы покажем микроглии изолированы от животного P21, культивируемых в MGM, ТИЦ или TIC, дополнена FCS 10% после 7 дней в пробирке (DIV) с assay жизнеспособности. Если изоляция была успешной, культур показывают между 80-90% жизнеспособность в ТИЦ после 7 DIV. клетки культивировали в присутствии сыворотки в конечном итоге подняться почти 100% жизнеспособность этой мерой, однако это искусственно раздувается как быстрое распространение Сыворотка облученных клеток и быстрого фагоцитоза мертвых клеток в пределах этих культур (рис. 2A). В дополнение к надежной выживания TIC культивируемых клеток также показывают, разветвленная Словотолкование, когда по сравнению с FCS лечение клеток (рис. 2B, C).

Рисунок 2: выживание микроглии в MGM, ТИЦ или ТИЦ + FCS в культуры в течение семи дней. (A) клетки были изолированы от P21 крыс и культивировали в микроглии среднего роста (MGM), TGF-β2/Ил-34/холестерин, содержащий роста среднего (ТИЦ), или ТИЦ + 10% плода телячьей сыворотки (FCS). В каждый момент времени культуры среднего была дополнена Флуорексон AM (1,33 мкм финал) и ethidium Антуану (окончательный 2,5 мкм) для 15 мин для обозначения живых клеток и мертвые клетки соответственно. Клетки были подсчитаны в каждом поле, используя автоматизированный скрипт ImageJ. (B и C) после DIV 7 без изменений СМИ, клетки выращивают в Тиц (B) или TIC, дополнена 10% FCS (C) окрашивали маркировать живые и мертвые клетки, как указано выше. Представитель изображения были взяты с помощью 10 X (слева) или 40 X (справа) цели. Линейки, 40 µm. погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Эта цифра была изменена с Боленом и др. ⁹ и используется с ее разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для того чтобы продемонстрировать успешные изоляции и культуры высоки чисто микроглии, мы изолированы микроглии P21 крыс и культивировали эти клетки в ТИЦ или TIC, дополнена 10% FCS на 8 дней. Клетки были затем фиксированной и витражи с маркерами микроглии (Iba-1 и CD11b) и маркер распространения (Ki67, рис. 3A). В дополнение к пятная для клеток маркеры РНК seq свежевыделенных клеток может обеспечивает мощный и чувствительных инструмент для оценки РНК профиль клеток и может помочь информировать начиная чистоту культур. CD11b immunopanning обычно приводит к небольшой процент CD11b⁺ нейтрофилов/Моноцит переходящий в дополнение к CD11b⁺ микроглии (рис. 3B). Эти клетки умрут в тик спустя несколько дней, но может усложнить анализ более ранние моменты времени.

Рисунок 3: чистота культивируемых клеток как начисленных иммуногистохимии и РНК след (A) микроглии были изолированы от крыс P21, покрытие на PDL/коллагена покрытием стекла coverslips и культивировали в TGF-β2/Ил-34/холестерин, содержащий роста среднего (ИТК) за 8 дней. Клетки были исправлены с параформальдегида 4% (PFA) для 10 мин при комнатной температуре и иммунной окрашенных с Iba-1 (1: 500), CD11b (1: 1500) и Ki67 (1: 500). Вкратце, фиксированные клетки были прегражены с 0,1% моющего средства (см. таблицу методов для подробной информации) и 10% нормальной осла сыворотки (НГС) за 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали с первичных антител в 0,1% моющего средства с 1%, которые NGS на ночь при 4 ° C. Клетки были смыты три раза за 5 мин в PBS. Затем клетки инкубировали с вторичные антитела все 1: 500 в 0,1% моющего средства с 1% NGS за 1 ч при комнатной температуре. Клетки были снова промывают три раза в PBS и смонтированы с DAPI-содержащих монтажа средних. Представитель изображения были взяты на 40 кратном. Шкалы, 50 мкм. (Б) выражение представитель типа клеток конкретных стенограммы клетками свежезаваренным изолированные и культивировали. Микроглии были изолированы от P21 крыс и лизированы непосредственно из immunopanning блюдо для изоляции РНК и РНК след маркеры других основных типов клеток ЦНС (астроциты, нейроны, олигодендроциты и эндотелиальных клеток) показывают минимальное загрязнение CD11b-immunopanned клеток. Нейтрофильные маркеры обнаруживаются в свеже изолированных клеток (черный), но теряются в сыворотке бесплатно культур (серый). Культивируемых клеток выразить высокий уровень общей макрофагов маркеров, но определение специализированных микроглии подписи маркеров являются быстро downregulated культивируемых клеток. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Данные изменяются от Болена и др. ⁹ и используется с ее разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Пятнать для жизнеспособности и ячейки маркеры позволяет для определения выживания и чистоты клеток, но предоставляет ограниченную информацию о динамике культуры. Здесь мы предоставили покадровой фильм P21 крыса микроглии после 14 DIV в ИТК. После двух недель, сыворотка свободной культуры Показать поведение динамического наблюдения, быстрый процесс расширения и опровержения на протяжении блюдо (см. фильм 1). Кроме того мы ранее нашли что воздействия сыворотки превращает эти отдыхая свойства государств микроглии, результате прочного изменения морфологических и фагоцитарной. Мы включали фильм микроглии культивировали в течение 5 дней в ИТК, затем подвергается 10% FCS (см. фильм 2).

Фильм 1: определяется средний микроглии культур показывают разветвленная словотолкование с динамических процессов. Микроглии были изолированы от крыс P21, пятно покрытие на коллаген покрытием анионные/Катионный покрытием тканевой культуры пластин и культивировали на 14 дней в ИТК. На 14 DIV изображения были собраны каждые 3 мин. Фильма играет на 6 кадров/с, и отметка времени в правом нижнем углу обозначает длительность изображений в h:min. фильм воспроизводится с Боленом и др. ⁹ и используется с ее разрешения. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Фильм 2: Сыворотка воздействие вызывает быстрое морфологические изменения в определен средний микроглии культур. Микроглии были изолированы от крыс P21, пятно покрытие на коллаген покрытием анионные/Катионный покрытием тканевой культуры пластин и культивировали на 5 дней в ИТК. На 5 DIV изображения были собраны каждые 5 мин базовых моторики/морфология был записан, затем в 2:55 (2 ч, 55 мин), 50% средств массовой информации изменения была выполнена для добавления FCS в конечной концентрации на 10%. Клетки были образы для дополнительных 7 h. Фильма играет на 6 кадров/с, и отметка времени в правом нижнем углу обозначает длительность визуализации в h:min. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Discussion

Потому что микроглии служат дозорных иммунные клетки ЦНС, они являются очень реагировать на экологические изменения; Таким образом для сведения к минимуму воспалительных реакций в клетках во время их изоляции и культуры⁸требуется большой осторожностью. Это достигается в этом протоколе через скорости и температуры. Сохраняя клетки на льду или на 4 ° C, всякий раз, когда возможно значительно снижает активации, так что все шаги центрифугирования занять место на 4 ° C, животных увлажненную с ледяной перфузии буфера, и протокол была упорядочена, чтобы свести к минимуму время между ткани Добыча и культивирования клеток. Если оценки картин выражения гена свежезаваренным изолированных клеток, урожай lysates клетки непосредственно из immunopanning блюдо CD11b до trypsinization сохранить изоляции индуцированные изменения как минимум. Следует отметить, что даже тщательно изолированы микроглии выполнить воспалительной реакции сразу же после его поместили в тепле, предположительно из-за признания повреждения связанные сигналов, неразрывно связанные с процедурой изоляции. Если протокол была выполнена успешно, 2.5-5 x 10⁵ клеток/несовершеннолетних крысы, как ожидается.

Протокол изоляции клетки предоставленная здесь весьма специфический для изоляции CD11b + клетки от перфузии ЦНС⁹. Хотя эта популяция клеток состоит преимущественно из микроглии, он также содержит низкий уровень других миелоидного населения как периваскулярной макрофагов, менингеальные макрофагов, сосудистое сплетение макрофагов, моноцитов и нейтрофилов¹⁰. Хориоидея связанные миелоидных клеток могут быть по существу устранены путем распознавания и удаления сосудистое сплетение до диссоциации ткани. Мозговые оболочки также могут быть удалены в некоторой степени, но полная ликвидация всех менингеальные ткани не практично в сроки, предназначенных для быстрого изоляции, описанных здесь. Таким образом чтобы ограничить изменчивость из-за неполного удаления мозговых оболочек, мы не удаляем мозговых оболочек. Чтобы свести к минимуму количество циркулирующих моноцитов/нейтрофилов в изолированных материала, важно также иметь чистый перфузии, и отбросить как правило, плохо увлажненную ткань. Даже с отличным перфузии Распродажа крови не является абсолютным, как будет видно наличие небольшого количества эритроцитов в ячейке гранулы во всем очистки. Таким образом небольшие уровни моноцитов и нейтрофилов совместно очищаются и внести свой собственный подпись в транскриптомики профили свежезаваренным изолированных клеток. Однако циркулирующих клеток быстро умрут в сыворотке бесплатно ТИЦ СМИ и не представляют стойкие загрязнители, хотя они могут продолжать выжить и размножаться в сыворотке, содержащих культур.

Другим важным моментом для достижения здоровой, жизнеспособной культуры является заботиться во время действия механических диссоциации. В то время как douncing убивает многих нейронов, глии и другие клетки ЦНС, микроглии выжить этой диссоциации, относительно невредимыми (хотя микроглии также могут быть убиты за douncing). Если все сделано правильно, этот протокол результатов в ячейке доходности сопоставимы с результатами, полученными с помощью протеолитических диссоциации, тогда как потенциально спутывающих переменных из ткани воспалительной реакции при повышенных температурах избегаются. Выполняя последовательных раундов неполной механических тканей диссоциации, отдельные клетки могут быть собраны из подвески при сведении к минимуму количество механических напряжений на общей культуры.

Протокол immunopanning, описанный здесь надежных и воспроизводимых способ изолировать микроглии, но другие сопоставимые методы доступны. Мы получили аналогичные результаты, используя магнитные изоляции с магнитной активации клеток, сортировка миелина истощения и CD11b выбор. Здесь мы сосредоточились на методе immunopanning потому, что он предоставил культур высочайшего качества на сегодняшний день, требует менее специализированное оборудование и не требует введения оксида железа конъюгированных антител к клеткам непосредственно перед культуры. Другой подход, обычно используемый для изоляции микроглии является проточной цитометрии, которая имеет значительное преимущество над нынешний подход в том, что протоколы существуют для очистки микроглии bona fide от других CD11b + миелоидных загрязнений с поверхности антитела против подписания маркеров, например TEMEM119⁸. Хотя сортировки активирован флуоресценции клеток приводит к чрезвычайно чистым клеток населения, он также налагает дополнительных напряжений в клетки и может привести к нижней жизнеспособности культур или снижение урожайности. В целом мы сосредоточены на методы, основанные на антитела над лейбл бесплатно плотность центрифугирования и трясти офф препараты для максимальной чистоты популяции клеток и повторяемость.

Хотя этот протокол оптимизирован для культуры микроглии несовершеннолетних крыса, она может использоваться для культуры микроглии от разных возрастов; ячейке урожайность максимального от 1 - 2-недели старый крыс, после того, как прошел пик микроглии расширения и до структурных перестроек, которые мешают восстановлению клеток от старых тканей. Микроглии может быть изолированным и культивировали от мыши и тканей человека, заменив CD11b антитела с соответствующей моноклональных антител, специфичных для мыши или человека epitopes. Хотя как мышь, так и человеческой микроглии выжить в этих условиях культуры, они показывают морфологические различия по сравнению с клетки крыс. Клетки мыши сохранить разветвленная Словотолкование, но имеют меньше разработать процессы, в то время как человеческие клетки имеют почти равномерное Саркодовые морфологии, когда изолированные и культивировали в соответствии с этой процедурой.

Изолированные микроглии может быть покрытием различными способами в зависимости от необходимых анализов. Для получения оптимальных результатов (как показано в жить/мертвые анализов и морфологических фильмы, показанный здесь) 3.5 x 10³ клеток были «спот» покрытием в центре хорошо 24-ну анионные/Катионный покрытием культуры ткани пластины после 10-мин покрытие коллаген IV как описано в протоколе выше. Кроме того для экспериментов, требующих большого числа клеток, таких как РНК изоляции, 3-5 х 10⁴ клетки могут покрытием за хорошо 24-ну плиты после 10 мин до 1 часа коллаген IV покрытия. Клетки покрытие в более высокой плотности, показал немного ниже жизнеспособности и менее сложную морфологию по сравнению с клетки, которые были на месте лечение, возможно из-за последствий воспалительных сигналов, секретируемых в ответ на изоляции. Для иммуногистохимии или изображений, требующих стекла coverslips клетки демонстрируют лучшие выживания и морфологии, когда впервые были coverslips покрытием с PDL, то покрытием в коллаген IV, как описано выше. Для анализов требуется большое количество условий жизнеспособность клеток также является высоким в 96-луночных или 384-ну коллаген покрытием пластин. Во всех условиях клетки начинают круглой или биполярного, начинают приобретать процессы вокруг дней 3-4 и 5-10 дней выставить максимально разветвленной морфологии, показано на рисунке 1 и 1 кино.

Хотя этот протокол результатов в культуре, которая демонстрирует поведение динамического наблюдения и морфология аналогичны отдыха микроглии в естественных условиях, эти клетки не полностью сохранить специализированные ген выражение подпись микроглии в естественных условиях. Многие из стойких гена изменения, наблюдаемые в культивируемых клеток отражают изменения, как правило, рассматривается в эмбриональных или воспаление CNS⁹. Таким образом этот протокол представляет собой шаг вперед в понимании условий микроглии требуют чтобы выжить в культуре и сыворотки вызвали изменения, но необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять внешние сигналы, предоставляемые ЦНС, которые точной микроглии выражения свойств и ген.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.