Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero

Summary

Sforzi per comprendere la funzione di microglial in dettaglio sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli di cultura microglial che ricapitolano le proprietà di microglia maturo in vivo . Questo protocollo descrive un metodo di isolamento e coltura progettato per mantenere la sopravvivenza robusto di ratto maturo altamente ramificato microglia in condizioni definite e medie.

Abstract

Microglia rappresentano il 5-10% di tutte le cellule del sistema nervoso centrale (SNC) e sono di disegno sempre più attenzione grazie al loro contributo durante lo sviluppo, l'omeostasi e la malattia. I macrofagi sono stati studiati in dettaglio per decenni, caratteristiche specializzate di microglia, i macrofagi residenti in tessuto del SNC, sono rimaste in gran parte misterioso, in parte a causa di limitazioni nella capacità di ricapitolare microglial maturo Proprietà nella cultura. Qui, vi illustriamo una procedura semplice per l'isolamento rapido di microglia pura da roditore cervello maturo. Descriviamo anche condizioni di coltura privo di siero che supportano alti livelli di redditività microglial nel corso del tempo. Microglia coltivate in queste condizioni definite e medie mostre elaborati processi ramificati e comportamento dinamico sorveglianza. Illustriamo alcuni effetti di esposizione sierica sulla microglia coltivate ed discutere come queste culture senza siero confrontare culture siero-esposti così come il microglia in vivo.

Introduction

Come i macrofagi del parenchima CNS, microglia interagire con una vasta gamma di circuiti neuronali e gliali reti di segnalazione. Essi svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella omeostasi del cervello attraverso potatura sinaptica, liquidazione delle cellule apoptotiche e transitorie interazioni con processi neuronali^1,2. Le microglia sono primi radar-risponditore a lesioni neurologiche, estendendo le proprie procedure lunghe e sottili ai siti di lesione per coordinare le risposte infiammatorie e limitare il sanguinamento^3,4. Cambiamenti nella morfologia microglial e funzione sono onnipresenti nelle lesioni di CNS sia acute che croniche, e microglia espositivo alterata morfologia, localizzazione ed espressione dei mediatori infiammatori in una vasta gamma di Stati di malattia¹. Gli studi genetici umani indicano che le mutazioni che alterano il rischio per le malattie neurodegenerative sono espressi spesso prevalentemente o esclusivamente da microglia nel SNC intatto, che punta a un ruolo critico di microglia nella patogenesi della malattia o la progressione⁵ . Dato loro risalto nella ferita e nella malattia, favorire la comprensione della biologia microglial è una priorità per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.

Molti avanzamenti critici per la comprensione della biologia microglial sono sorti estrapolando meccanismi scoperti negli studi di altre popolazioni del macrofago, inclusi i metodi di coltura, profili di espressione genica e definizioni di funzionali e tecniche / morfologica degli Stati. Anche se generalizzato del macrofago funzioni spesso giocano fuori in modo sorprendente all'interno del paesaggio di CNS, microglia sono essi stessi altamente specializzata, che esibiscono una morfologia ramificata e una firma di espressione genetica unica che li distingue da altri tessuti macrofagi⁶. Microglia hanno un lignaggio che è distinto dalla maggior parte degli altri macrofagi dei tessuti; Essi colonizzano SNC durante un'ondata di embrionale precoce dell'emopoiesi primitivo e auto-rinnovarsi per tutta la vita, indipendente di contributi da ematopoiesi definitivo⁷. La firma di espressione genica pienamente matura di microglia adulta non viene raggiunta fino alla seconda settimana postnatale⁸. Stimoli ambientali dal tessuto circostante ha un ruolo importante nel dettare tessuto-specifica del macrofago caratteristiche⁶, che nel SNC comprende limitata esposizione ai fattori ematica concesso dalla barriera emato - encefalica⁹.

Un ostacolo alla piena comprensione microglial contributi al CNS omeostasi e malattia è la difficoltà di ricapitolare le proprietà specializzate di microglia maturo visto nel vivo con le cellule purificate in vitro. Sono stati sviluppati molti metodi per isolare e cultura intatta microglia, ma la maggior parte degli approcci si basano su siero per sostenere la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo dimostrato che l'aggiunta di siero, che è un reagente intrinsecamente variabile contenente una vasta gamma di molecole bioattive, è particolarmente problematico quando lavoro con microglia perché promuove una morfologia ameboide, aumento della proliferazione, e fagocitosi aumentata⁹ spesso visto in vivo quando microglia sono esposti a fattori di ematica dopo l'interruzione della barriera sangue - cervello. Di queste metriche, le cellule esposte al siero assomigliano microglia in lesioni o Stati di malattia, ma tali alterazioni sono ridotti quando microglia sono coltivate in mezzo di sviluppo definito contenente CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterolo e selenite.

Questo protocollo fornisce dettagli per la coltura di microglia giovanile del ratto nelle circostanze senza siero, relazionati al lavoro recentemente pubblicato⁹. Questo protocollo è stato ottimizzato per i ratti da giorno postnatale 21-30 (P21 - P30), ma può essere adattato per isolare microglia da ratti e topi di qualsiasi età, anche se resa e redditività complessiva varia a seconda della specie e l'età dell'animale. Maximal cede e redditività ottimale è raggiunta quando si utilizza un po' immatura microglia (~ P9), con rendimenti e vitalità si assottiglia gradualmente per un po ' i livelli più bassi negli animali adulti. Microglia può anche essere isolata dai topi, ma abbiamo trovato che le cellule del ratto mostrano significativamente più alti rendimenti, attuabilità e la complessità delle morfologie ramificate, rispetto alle cellule di topo in culture senza siero. Gli animali di età compresa tra maggiore di P50 non sono state valutate con questo protocollo. Questa procedura di isolamento di immunopanning è stata ottimizzata per minimizzare i cambiamenti nei profili trascrizionali microglial durante l'isolamento e per massimizzare a valle vitalità delle cellule. Utilizzando queste tecniche e formulazioni di media, alta redditività colture primarie possono essere sostenuti per settimane. Microglia in coltura in queste condizioni presentano una morfologia altamente ramificata che coinvolgono rapida estensione e retrazione dei processi e relativamente basso tasso di proliferazione. Evidenziamo il significato di siero-esposizione su queste proprietà e discutere i punti di forza e di debolezza di questo metodo rispetto altri approcci.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono roditori conformano alle linee guida della Stanford University, conformi alle politiche e nazionali e le leggi dello stato. Tutte le procedure di animali sono state approvate dal pannello di amministrazione dell'Università di Stanford sulla cura degli animali di laboratorio.

Nota: Tutte le composizioni di soluzione e buffer sono fornite nella Tabella materiali.

1. preparare una piastra di Petri per CD11b Immunopanning (giorno 0)

Nota: Preparare 1 immunopanning piatto per ogni cervello di ratto giovanile di 1-2.

1. Aggiungere 25 mL di 50 mM Tris soluzione pH 9.5 a una capsula di Petri 15 cm.
2. Aggiungere anti-topo di capra IgG (catene di H + L) al piatto per una concentrazione finale di 6 µ g/mL. Turbinio piastra per distribuire uniformemente.
3. Incubare il piatto per 1-3 h a 37 ° C.
4. Piatti di lavare tre volte con DPBS +⁺ (tampone fosfato salino (PBS) con Ca^{2 +} e Mg^{2 +}), quindi sostituire con una soluzione di panning tampone contenente 1 µ g/mL OX42 anticorpo. Lasciare i piatti durante la notte a temperatura ambiente su una superficie piana.

2. tessuto collezione (giorno 1)

Nota: Questo protocollo dovrebbe prendere circa 3-4 h.

1. Prima di iniziare, verificare che tutte le soluzioni sono sterili e refrigerati sul ghiaccio. Tutti gli strumenti sul ghiaccio di chill e sterilizzare con etanolo prima dell'uso.
2. Seguenti procedure regolamentari appropriate, sacrificare un topo di laboratorio giovanile da asfissia di anidride carbonica.
   Nota: In alternativa, gli animali più giovani possono essere sacrificati con una dose letale di chetamina/xilazina (100-200 µ l di 24 mg/mL di ketamina, xilazina 2,4 mg/mL). Chetamina/xilazina deve essere utilizzato se gli animali sono meno di 14 giorni di età. Se si utilizza più animali, estrarre il tessuto da un animale e inserirlo pre-refrigerati DPBS +⁺ sul ghiaccio prima di procedere alla successivi animali.
3. Pizzicare un hindpaw e garantire l'apatia completa dall'animale prima di procedere.
4. Via irrorare l'animale con 10-30 mL di buffer di aspersione ghiacciata utilizzando un ago 27½-G fino a quando il buffer viene eseguito chiaro.
   Nota: Il Volume di tampone di aspersione variano a seconda la dimensione/età dell'animale.
5. Subito dopo aspersione rimuovere la testa dell'animale. Provenienti dal midollo spinale tagliato il condilo occipitale su ogni lato con le forbici di dissezione, fare attenzione a non danneggiare il cervello. Dopo aver tagliato attentamente ogni lato, tagliare un lato lungo parietali e osso frontale verso l'osso nasale. Con il forcipe attentamente tirare indietro la parte superiore del cranio, rimuovere rapidamente il cervello (o strutture CNS di interesse) e mettere in pre-refrigerati DPBS +⁺ sul ghiaccio.
6. Ripetere per tutti gli animali restanti.
   Nota: Tutte le fasi del procedimento dovrebbero essere eseguite in una cappa a flusso laminare in adeguate condizioni di sterilità.

3. meccanica dissociazione (giorno 1)

1. Dopo tutti i cervelli sono stati raccolti, tritare un cervello tocchetti³ a 1 mm in una capsula Petri sul ghiaccio con un bisturi freddo e trasferire a un omogeneizzatore lisata ghiacciata con 5-7 mL di tampone douncing ghiacciata. Dissociare un cervello alla volta.
2. Dissociare il tessuto usando tratti di dolce e incomplete di 10-20 con un omogeneizzatore lisata larghi. Fare attenzione a non schiacciare direttamente il tessuto nella parte inferiore dell'omogeneizzatore, ma invece spingono il tessuto attraverso lo spazio tra i lati del pistone e l'omogeneizzatore.
3. Rimuovere delicatamente il pistone per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Consenti blocchi di tessuto scarsamente dissociato a stabilirsi a fondo l'omogeneizzatore e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da refrigerata 50 mL.
4. Sostituire il volume rimosso con buffer di douncing fresco e ripetere i passaggi 3.2 e 3.3 per un totale di 3-4 giri, o fino a quando tutto il tessuto è stato dissociato. Ripetere la procedura per ogni cervello.

4. mielina rimozione (giorno 1)

Nota: Rimozione di mielina è utilizzato per l'isolamento di microglia da animali più vecchi di P12.

1. Misurare il volume della sospensione cellulare in tubo conico da 50 mL utilizzando una pipetta 25 mL, quindi aggiungere tampone douncing ghiacciata per regolare il volume totale di 33,5 mL.
2. Aggiungere 10 mL di tampone di separazione della mielina (MSB) sospensione cellulare e mescolare accuratamente capovolgendo la provetta diverse volte. Questo si tradurrà in una concentrazione finale di 23% di MSB in un volume di 43,5 mL.
3. Centrifugare le cellule per 15 min a 500 x g a 4 ° C con frenata lenta.
   Nota: La centrifuga dovrebbe prendere circa 1.5-2 min per decelerare. Questo genererà uno strato superiore di mielina e detriti cellulari morti, un surnatante un po' torbida e una più piccola a pellet che si arricchisce di cellule vive.
4. Rimuovere lo strato superiore di residui del myelin e il surnatante con una pipetta. Fare attenzione quando si rimuove lo strato superiore per garantire come gran parte di essa viene rimosso come possibile.
5. Risospendere il pellet cellulare in 12 mL di tampone di panning. Delicatamente e triturare la sospensione cellulare per rompere eventuali grumi di cellule che potrebbero rimanere.

5. Immunopanning (giorno 1)

1. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 70 µm per rimuovere detriti di grandi dimensioni o grumi di cellule.
2. Risciacquare il piatto panning rivestite con OX42 tre volte con DPBS +⁺. Non fate la piastra completamente asciutto tra i lavaggi.
3. Versare fuori l'ultimo lavaggio DPBS +⁺ e applicare la sospensione cellulare filtrata al piatto panning. Delicatamente la piastra per distribuire le cellule di turbinio, quindi incubare la piastra su una superficie piana a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire alle cellule di aderire. Incubare per non più di 20 min o cellule diventerà molto difficile recuperare dal piatto.
4. Risciacquare il piatto panning con DPBS +⁺ 10 volte per rimuovere le cellule non-aderenti. Microglia sarà così saldamente fissato alla piastra, agitare la piastra con ogni risciacquo per garantire la rimozione di altre cellule non aderenti.
5. Versare fuori l'ultimo lavaggio DPBS +⁺ e sostituire con 15 mL DPBS +⁺ e 200 μL tripsina (1,25% soluzione di riserva).
6. Incubare il piatto per ≤ 10 min a 37 ° C con 10% CO₂ per tripsinizzano.
   Nota: Non continuare più di 10 min o microglia diventerà difficile da rimuovere.
7. Dopo 10 min di trypsinization, microglia sarà ancora bloccata alla piastra. Versare fuori tripsina/DPBS +⁺ e lavare delicatamente 2x con DPBS +⁺ per rimuovere la tripsina, sostituire con 12 mL di terreno di coltura di microglia ghiacciata (MGM).
8. Posto panning piatto sul ghiaccio per 2 min per indebolire l'interazione cellula/substrato e assicurarsi che il piatto è piatto per evitare zone del panning piatto dall'asciugarsi.
9. Pipettare vigorosamente con un controller di pipetta e dispensare 10 mL ad alta velocità per recuperare le cellule dal piatto panning. Disegnare una 16x16 griglia con il flusso di liquido dalla pipetta per cercare di rimuovere tutte le cellule.
10. Controllare le cellule al microscopio a 20 ingrandimenti per assicurarsi che le cellule siano staccate dalla piastra. Mark macchie sulla parte superiore del piatto dove le cellule sono ancora bloccate e ripetere il pipettaggio in quelle zone.
11. Raccogliere la sospensione cellulare e aliquota 3-4 mL di surnatante per provetta conica da 15 mL. Spin per 15 min a 500 x g a 4 ° C con frenata lenta.
    Nota: Microglia attraverso un piccolo volume di filatura consente il massimo recupero delle cellule.
12. Aspirare il supernatante, lasciando 0,5 mL di MGM con il pellet cellulare.
13. Ogni risospendere in MGM rimanenti e le cellule da tutti i tubi della piscina.
14. Contare le celle con un emocitometro.
15. Cellule di piastra come descritto nei passaggi 6 - 7 a seconda dell'applicazione.
16. Cellule di coltura a 37 ° C con 10% CO₂.
    Nota: Le cellule possono essere cultura per fino a 3-4 settimane con le modifiche di supporto regolare o una settimana senza modifiche di media.

6. posto rivestimento piastre/lamelle di coltura tissutale (giorno 1)

1. Piastra 15 µ l di rivestimento di collagene IV direttamente nel centro di una piastra di coltura del tessuto rivestito 24 pozzetti anionici/cationici (per dettagli, vedere Tabella materiali ) e incubare per 15 min a 37 ° C con 10% CO₂.
2. Dopo il conteggio di cellule con un emocitometro diluire le cellule a 2.3 x 105/ml in MGM. Aspirare il collagene IV spot e immediatamente piastra 15 µ l di sospensione cellulare fino a questo punto; Questo vi darà 3,5 x 10 cellule/spot³ . Incubare per 5-10 min a 37 ° C con 10% CO₂ per consentire alle cellule di aderire, aggiungere 500 µ l di CO_{2 -}equilibrata contenente il mezzo di crescita TGF-β2/IL-34/colesterolo (TIC) delicatamente al pozzo.
3. Se placcatura sulle lamelle, primo cappotto sterile vetrini coprioggetti con 10 µ g/mL stratagemma-D-lisina (PDL) in H₂O per 1h a RT, lavare 3 volte con H₂O e lasciare asciugare in una cappa sotto luce UV. Una volta che le lamelle sono asciutte, procedere con spot placcatura su lamelle come descritto al punto 6.2.

7. placcatura per isolamento di RNA/proteine

1. Il giorno 1, cappotto l'intera area di un 24 pozzetti anionici/cationici rivestite in lamiera di coltura del tessuto con rivestimento in collagene IV e incubare per 10 min - 1 h a 37 ° C con 10% CO₂, quindi rimuovere e immediatamente piastra 3-5 x 10⁴ cellule/pozzetto in CO₂ equilibrato Media TIC.
2. Il giorno 2, eseguire una variazione media del 50% per ogni bene il giorno dopo la preparazione. Le cellule morte tendono a cluster al centro del pozzo, così prendono i media da lì.
3. Eseguire una modifica di media 50% ogni 2-3 giorni per mantenere le culture. Se le modifiche di supporto introducano una variabile di indesiderate per le culture, le cellule possono sopravvivere per circa una settimana, senza alcuna modifica di media, al contrario di oltre 3 settimane con una manutenzione regolare.

Representative Results

Questo protocollo descrive un metodo di cultura elevata purezza ramificata microglia da ratti giovani. Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando animali immaturi, perinatali e adulti, come discusso di seguito. Poiché gli isolamenti delle cellule includono spesso sottili sfumature e molte opportunità per cellule di morire, abbiamo usato i punti di controllo di controllo di qualità per aiutare a determinare il successo alle varie fasi. Abbiamo controllato in genere sospensioni cellulari utilizzando un emocitometro a più passaggi nel protocollo di isolamento (Figura 1A). Gli isolamenti di successo dovrebbero produrre 2,5-5 x 10⁵ animali di cellule/giovanile. Animali da P7 - P15 mostrano rendimenti più vicino a 5 x 10⁵ cellule/animale, mentre le cellule isolate da animali più vecchi di P30 mostrano rendimenti più vicino a 2,5 x 10⁵ cellule/animale. Oltre il monitoraggio totale delle cellule conta in tutto il protocollo, è importante determinare la salute generale delle cellule isolate, che può essere difficile perché microglia isolata in questo modo hanno una morfologia arrotondata o bipolare durante i primi giorni nella cultura . Qui, abbiamo incluso immagini di fase di P25 microglia in coltura durante i primi 6 giorni dopo l'isolamento in TIC e TIC contenente 10% di siero fetale di vitello (FCS) (Figura 1B).

Figura 1: valutazione di salute delle cellule durante il protocollo di isolamento e in 6 giorni di cultura. (A) contrasto di fase immagini illustrando i punti di controllo di controllo di qualità presso i designato fasi della procedura di isolamento delle cellule. Sospensioni cellulari erano imaged mescolando 9 µ l di sospensione cellulare con 1 µ l di 0,4% trypan blu prima di caricarla su un emocitometro. Altre immagini mostrano il panning piatto stesso, e tutte le immagini vengono visualizzate come un campo a 20 ingrandimenti. Barra di scala, 200 µm. MGM, coltura di microglia. (B) corso di tempo dei cambiamenti morfologici microglial e proliferazione in 6 giorni di cultura in privo di siero TIC crescita media o TIC più 10% di siero fetale di vitello (FCS). Le cellule CD11b-immunopanned erano esatte placcato sulla piastra di coltura di tessuto collagene-rivestito anionici/cationici rivestito (Vedi Tabella materiali per i dettagli), e lo stesso campo era imaged di contrasto di fase ogni 24 h. scala bar, 100 µm. TIC, TGF-β2/IL-34 / Terreno di coltura contenente colesterolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La valutazione sistematica della salute e la vitalità delle cellule isolate è importante per il successo degli esperimenti e riproducibilità. Qui indichiamo microglia isolata da un animale di P21 coltivato in MGM, TIC o TIC completati con 10% FCS dopo 7 giorni in vitro (DIV) con un'analisi di attuabilità. Se l'isolamento è stata completata, culture mostrano tra 80-90% redditività in TIC dopo 7 DIV. cellule coltivate in presenza di siero alla fine salire a quasi 100% redditività da questa misura, tuttavia questo è gonfiato artificialmente sia di rapida proliferazione di le cellule esposte al siero e rapida fagocitosi delle cellule morte all'interno di queste culture (Figura 2A). Oltre alla sopravvivenza robusto, TIC coltivate cellule mostrano anche una morfologia ramificata rispetto al FCS trattato le cellule (Figura 2B, C).

Figura 2: sopravvivenza di microglia in MGM, TIC o TIC + FCS più di sette giorni nella cultura. (A) le cellule sono state isolate dai ratti P21 e coltivate in terreno di coltura di microglia (MGM), contenente il mezzo di crescita TGF-β2/IL-34/colesterolo (TIC), o TIC + 10% siero fetale del vitello (FCS). In ogni punto del tempo, terreno di coltura è stata completata con calceina (finale 1.33 µM) e omodimero di etidio (2,5 µM finale) per 15 min etichettare le cellule vive e cellule morte, rispettivamente. Le cellule sono state contate in ogni campo usando uno script automatico di ImageJ. (B e C) dopo 7 DIV, con nessun cambiamento di media, cellule cresciute in TIC (B) o TIC completati con 10% FCS (C) sono state macchiate per marcare le cellule vivi e morte come sopra. Immagini rappresentative sono state scattate con un 10 X (sinistra) o 40x (a destra). Barra della scala, 40 µm. barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). Questa figura è stata modificata da Bohlen et al. ⁹ e usato con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per dimostrare il successo isolamento e coltura di microglia altamente pura, abbiamo isolato la microglia dai ratti P21 e coltivato queste cellule in TIC o TIC completati con 10% FCS per 8 giorni. Le cellule erano quindi fissi e macchiate con marcatori microgliali (Iba-1 e CD11b) e indicatore di proliferazione (Ki67, Figura 3A). In aggiunta alla macchiatura per gli indicatori delle cellule, RNA-seq sulle cellule di recente isolate possono fornisce uno strumento potente e sensibile per valutare il profilo di RNA delle cellule e possono aiutare ad informare la purezza iniziale delle culture. CD11b immunopanning in genere comporta una piccola percentuale di CD11b⁺ riporto neutrofili/monociti oltre CD11b⁺ microglia (Figura 3B). Queste cellule moriranno in TIC dopo pochi giorni, ma possono complicare l'analisi dei punti di tempo precedenti.

Figura 3: purezza delle cellule coltivate come valutato da immunohistochemistry e RNA-seq. Microglia (A) sono stati isolati dai ratti di P21, piastrate su PDL/collagene rivestito vetrini coprioggetti e coltivate in terreno di coltura contenente TGF-β2/IL-34/colesterolo (TIC) per 8 giorni. Le cellule erano fissate con paraformaldeide al 4% (PFA) per 10 min a temperatura ambiente e immunitario-macchiati con Iba-1 (1: 500), CD11b (1: 1500) e Ki67 (1: 500). Brevemente, celle fisse sono state bloccate con 0,1% detergente (Vedi tabella di metodi per i dettagli) e 10% di siero normale asino (NGS) per 1 h a temperatura ambiente. Le cellule sono state quindi incubate con anticorpi primari in 0,1% detergente con 1% NGS durante la notte a 4 ° C. Le cellule sono state lavate tre volte per 5 minuti ciascuno in PBS. Le cellule poi sono state incubate con anticorpi secondari tutti 1: 500 in 0,1% detergente con 1% NGS per 1 h a temperatura ambiente. Le cellule erano nuovamente lavate tre volte in PBS e montate con DAPI-contenente mezzo di montaggio. Immagini rappresentative sono state prese a 40 ingrandimenti. Barra della scala, 50 µm. (B) espressione di specifici trascritti cellula-tipo rappresentativo dalle cellule appena isolato e coltivate. Microglia sono stati isolati dai ratti P21 e lisate direttamente dal piatto immunopanning per isolamento del RNA e RNA-seq. marcatori di altri tipi di cellulari principali CNS (astrociti, neuroni, oligodendrociti e cellule endoteliali) mostrano contaminazione minima del Cellule CD11b-immunopanned. Marcatori del neutrofilo vengono rilevati nelle cellule appena isolato (nero), ma si perdono nelle culture privo di siero (grigio). Cellule coltivate esprimono alti livelli di marcatori del macrofago comuni, ma marcatori definisce la firma specializzata microglial sono rapidamente downregulated dalle cellule coltivate. Barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). I dati vengono modificati da Bohlen et al. ⁹ e usato con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Macchiando per redditività e gli indicatori delle cellule consente di determinare la sopravvivenza e la purezza delle cellule, ma fornisce informazioni limitate sulle dinamiche della cultura. Qui abbiamo fornito un filmato time-lapse di P21 ratto microglia dopo 14 DIV in TIC. Dopo due settimane, senza siero culture mostrano comportamento dinamico sorveglianza, con rapido processo estensioni e retrazioni in tutto il piatto (Vedi Movie 1). Inoltre, precedentemente abbiamo trovato che l'esposizione del siero trasforma questi riposo proprietà dello stato di microglia, con conseguente cambiamenti morfologici e fagocitici della durata. Abbiamo incluso un filmato di microglia coltivate per 5 giorni in TIC, poi esposti a 10% FCS (Vedi film 2).

Movie 1: culture microglia definito e medie mostrano morfologia ramificata con processi dinamici. Le microglia sono stati isolati da un ratto P21, spot piastrate su piastre rivestite con collagene anionici/cationici coltura di tessuti rivestiti e coltivate per 14 giorni in TIC. A 14 DIV, immagini sono stati raccolti ogni 3 min. Il filmato viene riprodotto a 6 fotogrammi/s, e il timestamp nell'angolo inferiore destro indica la durata dell'imaging in h:min. film è riprodotto da Bohlen et al. ⁹ e usato con permesso. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Movie 2: l'esposizione del siero provoca un rapido cambiamento morfologico in colture microgliali definito medio-. Le microglia sono stati isolati da un ratto P21, spot piastrate su piastre rivestite con collagene anionici/cationici coltura di tessuti rivestiti e coltivate per 5 giorni nel TIC. Alle 5 DIV, immagini sono stati raccolti ogni 5 min Baseline motilità/morfologia è stata registrata, quindi alle 02:55 (2 h e 55 min), un cambiamento di media di 50% è stato effettuato per aggiungere FCS a una concentrazione finale di 10%. Le cellule erano imaged per ulteriori 7 h. Il filmato viene riprodotto a 6 fotogrammi/s e il timestamp nell'angolo inferiore destro indica la durata di imaging in h:min. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Discussion

Poiché microglia fungono da cellule immunitarie sentinella del SNC, sono altamente sensible a reagire ai cambiamenti ambientali; di conseguenza, molta cura è necessaria per ridurre le risposte infiammatorie all'interno delle cellule durante il loro isolamento e cultura⁸. Questa operazione viene eseguita in questo protocollo attraverso velocità e temperatura. Ogni qualvolta possibile riduce notevolmente l'attivazione, quindi tutte le fasi di centrifugazione prendere posto a 4 ° C, mantenendo le cellule in ghiaccio o a 4 ° C, gli animali sono perfusi con buffer di aspersione ghiacciata, e il protocollo è stato ottimizzato per ridurre al minimo il tempo fra il tessuto estrazione e coltura delle cellule. Se valutare il pattern di espressione genica delle cellule appena isolato, raccolto lisati cellulari direttamente dal piatto immunopanning CD11b prima del trypsinization per mantenere i cambiamenti indotti da isolamento minimo. Dovrebbe essere notato che anche accuratamente isolato microglia eseguire una risposta infiammatoria immediatamente dopo essere poste nelle temperature calde, presumibilmente a causa di riconoscimento di segnali di danno-collegata intrinsecamente connesso con la procedura di isolamento. Se il protocollo è stato effettuato con successo, 2,5-5 x 10 il ratto⁵ cellule/giovanile sono attesi.

Il protocollo di isolamento cellulare fornito qui è altamente specifico per l'isolamento di cellule CD11b + dal CNS irrorato⁹. Nonostante questa popolazione cellulare è composto prevalentemente da microglia, custodisce anche bassi livelli di altre popolazioni mieloide quali i macrofagi perivascolari, macrofagi meningei, plesso coroideo macrofagi, monociti e neutrofili¹⁰. Cellule mieloidi coroide-collegato possono eliminarsi essenzialmente dal riconoscimento e rimozione del plesso coroidico prima della dissociazione del tessuto. Meningi possono anche essere rimossa in una certa misura, ma l'eliminazione completa di tutto il tessuto meningeo non è pratico nei tempi mirati per isolamento rapido descritto qui. Di conseguenza, per limitare la variabilità a causa di una rimozione incompleta dei meninges, non rimuoviamo meningi. Per ridurre al minimo il numero di monociti/neutrofili nel materiale isolato di circolazione, è anche importante avere un'aspersione pulita e scartiamo in genere del tessuto che è scarsamente irrorato. Anche con aspersione eccellente, clearance del sangue non è assoluta, come sarà evidente dalla presenza di una piccola quantità di eritrociti in palline delle cellule durante la purificazione. Così, piccoli livelli di monociti e neutrofili sono co-purificati e contribuire con una firma distinta nei profili di trascrittomica delle cellule appena isolato. Tuttavia, fare circolare le cellule moriranno rapidamente in media TIC senza siero e non rappresentano contaminanti persistenti, anche se possono continuare a sopravvivere e proliferare in siero contenente culture.

Un altro punto importante per raggiungere una sana, vitale cultura è prendersi cura durante le fasi di dissociazione meccanica. Mentre douncing uccide molti neuroni, glia e altre cellule di CNS, microglia sopravvivono questa dissociazione relativamente illesa (sebbene microglia possono anche essere uccisi da over-douncing). Se fatto correttamente, questo protocollo si traduce in cella rendimenti comparabili a quelli ottenuti utilizzando proteolitici dissociazione, mentre potenzialmente variabili dal tessuto infiammatorio di confusione sono evitate risposte alle temperature elevate. Eseguendo giri consecutivi incompleti di dissociazione meccanica del tessuto, singole cellule possono essere raccolte dalla sospensione, riducendo al minimo la quantità di stress meccanico sulla cultura generale.

Il protocollo di immunopanning descritto qui è un modo affidabile e riproducibile per isolare la microglia, ma sono disponibili altri metodi comparabili. Abbiamo ottenuto risultati simili con isolamento magnetico magnetico attivato cella ordinamento lo svuotamento della mielina e CD11b selezione. Qui ci siamo concentrati sul metodo immunopanning perché ha fornito le culture di qualità più elevata fino ad oggi, richiede attrezzature meno specializzate e non richiede l'introduzione di anticorpi coniugati di ossido di ferro alle cellule immediatamente prima della coltura. Un altro approccio comunemente usato per l'isolamento di microglia è citometria a flusso, che ha un grande vantaggio rispetto all'attuale approccio in quanto esistono protocolli di purificazione di bona fide microglia da altri contaminanti CD11b + mieloide con superficie anticorpi contro i marcatori di firma come TEMEM119⁸. Anche se l'ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule si traduce in una popolazione delle cellule estremamente puro, inoltre impone ulteriori sollecitazioni alle cellule e può provocare bassa redditività culture o diminuzione della resa. Nel complesso, ci concentriamo sui metodi basati su anticorpi nei preparativi di centrifugazione e shake-off di densità privo di etichetta per ottimizzare la riproducibilità e la purezza della popolazione cellulare.

Mentre questo protocollo è ottimizzato per la cultura della microglia ratto giovanile, può essere utilizzato alla cultura microglia di diverse epoche; cellulare totale rendimenti sono massimi da 1 - 2-settimana-vecchi ratti, dopo il picco dell'espansione microglial è passato e prima di riarrangiamenti strutturali che interferiscono con il recupero delle cellule dal tessuto più anziane. Microglia può anche essere isolata e coltivata dal mouse e tessuto umano, sostituendo l'anticorpo di CD11b con un appropriato anticorpo monoclonale specifico per mouse o epitopi umani. Mentre sia il mouse che il microglia umana sopravvivere in queste condizioni di coltura, mostrano differenze morfologiche rispetto alle cellule del ratto. Cellule di topo mantengono una morfologia ramificata ma meno elaborare processi, mentre le cellule umane hanno una morfologia ameboide quasi uniforme quando isolato e coltivato secondo questa procedura.

Microglia isolata può essere placcata in modi diversi a seconda le analisi necessarie. Per risultati ottimali (come illustrato nel live/dead saggi e morfologici filmati mostrati qui), 3,5 x 10³ celle erano «spot» placcato al centro del pozzetto di una piastra di coltura del tessuto rivestito 24 pozzetti anionici/cationici dopo un rivestimento di 10 min di collagene IV come descritto nel protocollo di cui sopra. In alternativa, per gli esperimenti che richiedono un numero elevato di cellule, come isolamento del RNA, 3-5 x 10⁴ celle può essere placcato per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti dopo 10 min a 1 h di rivestimento di collagene IV. Cellule placcato a densità superiori ha mostrata vitalità leggermente inferiore e meno complessa morfologia rispetto alle cellule che erano esatte trattato, possibilmente a causa dell'impatto dei segnali infiammatori secernuta in risposta all'isolamento. Per immunoistochimica o imaging che richiedono di vetrini coprioggetti, le cellule presentano la migliore sopravvivenza e morfologia quando le lamelle sono stati prime rivestito con PDL quindi rivestito in collagene IV come descritto sopra. Per i dosaggi che richiedono un gran numero di condizioni, la vitalità cellulare è inoltre alta in 96 pozzetti o 384 pozzetti piastre rivestite con collagene. In tutte le condizioni, le cellule iniziano rotondo o bipolare, cominciano ad acquisire processi intorno giorno 3-4 e 5-10 giorni ad esporre la morfologia al massimo ramificata illustrata nella Figura 1 e 1 film.

Mentre questo protocollo si traduce in una cultura che esibisce comportamento dinamico sorveglianza e morfologia simile al riposo microglia in vivo, queste cellule non riescono a mantenere completamente la firma di espressione genica specializzati di microglia in vivo. Molti dei cambiamenti persistenti genica osservati in cellule coltivate riflettono alterazioni tipicamente osservate nel CNS⁹embrionali o infiammata. Come tale, questo protocollo rappresenta un passo avanti nella comprensione delle condizioni microglia richiedono per sopravvivere in cultura e modifiche del siero-evocato, ma ulteriore studio è necessario capire i segnali estrinseci forniti dal sistema nervoso centrale che perfezionare microglial Proprietà e l'espressione genica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.