Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Summary

Inspanningen om microglial functie in detail te begrijpen hebben belemmerd door het ontbreken van microglial cultuur modellen die de eigenschappen van volwassen in vivo microglia recapituleren. Dit protocol beschrijft een aanpak van het isolement en cultuur ontworpen om robuust voortbestaan van zeer vertakte volwassen rat microglia voorwaarden gedefinieerd-medium.

Abstract

Microglia vormen 5-10% van alle cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en zijn steeds meer aandacht als gevolg van hun bijdragen tijdens de ontwikkeling, homeostase en ziekte. Hoewel macrofagen zijn in detail bestudeerd voor decennia, speciale functies van microglia, de weefsel-ingezeten macrofagen van het centraal zenuwstelsel, gebleven grotendeels mysterieus, gedeeltelijk als gevolg van beperkingen in de mogelijkheid om te recapituleren volwassen microglial eigenschappen in cultuur. We illustreren hier, een eenvoudige procedure voor de snelle isolatie van pure microglia van de volwassen knaagdieren hersenen. Ook beschrijven we serumvrij kweekomstandigheden die ondersteuning bieden voor hoge niveaus van microglial levensvatbaarheid na verloop van tijd. Microglia gekweekt onder deze omstandigheden gedefinieerd-medium exposeren uitgebreide vertakte processen en dynamische toezicht gedrag. We illustreren sommige gevolgen van serum blootstelling voor gekweekte microglia en bespreken hoe deze serumvrij culturen te vergelijken met zowel serum-blootgesteld culturen evenals microglia in vivo.

Introduction

Als de macrofagen van de CNS parenchym, microglia interactie met een uitgebreid scala aan circuits van neuronale en gliale signalering netwerken. Ze spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en de homeostase van de hersenen via synaptic snoeien, apoptotic cel goedkeuring en voorbijgaande interacties met neuronale processen^1,2. Microglia zijn vroege responders aan neurologische letsels, uitbreiding van hun lange, dunne processen naar laesie sites beperken bloeden^3,4te coördineren van inflammatoire reacties. Veranderingen in microglial morfologie en functie zijn alomtegenwoordig in zowel acute als chronische CNS verwondingen en microglia tentoonstelling gewijzigd morfologie, lokalisatie en expressie van inflammatoire mediatoren in een breed scala aan ziekte staten¹. Menselijke genetische studies blijkt dat mutaties die veranderen van risico voor neurodegeneratieve ziekten vaak voornamelijk of uitsluitend worden uitgedrukt door microglia in het intact VNV, wijzend naar een cruciale rol voor microglia in de pathogenese van de ziekte of progressie⁵ . Gezien hun bekendheid bij letsel en ziekte, is bevordering van het begrip van microglial biologie een hoge prioriteit voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen.

Vele kritische voorschotten aan het begrip van microglial biologie gerezen door extrapolatie van de technieken en mechanismen in het onderzoek van de populaties van andere macrofaag waaronder kweekmethoden, gen expressieprofielen en definities van functionele ontdekt / morfologische Staten. Hoewel generalized macrofaag functies vaak op verrassende manieren binnen de CNS-landschap spelen, microglia zelf sterk gespecialiseerd, vertonen een vertakte morfologie en een unieke gen expressie handtekening dat hen onderscheidt van ander weefsel macrofagen⁶. Microglia hebben een afkomst die verschilt van de meeste andere macrofagen weefsel; ze koloniseren de CNS tijdens een vroege embryonale Golf van primitieve Haematopoiese en zelf vernieuwen gedurende het hele leven, onafhankelijk van de bijdragen van definitieve Haematopoiese⁷. De volwassen gen expressie ondertekening van volwassen microglia wordt niet bereikt tot de tweede postnatale week⁸. Milieu signalen uit het omringende weefsel spelen een belangrijke rol in het weefsel-specifieke macrofaag functies⁶, waarin in het VNV beperkte blootstelling aan bloed overgedragen factoren die worden verleend door de bloed - hersenbarrière⁹dicteren.

Een obstakel voor het volledig begrip van microglial bijdragen aan CNS homeostase en ziekte is de moeilijkheid van de gespecialiseerde eigenschappen van volwassen microglia gezien in vivo met gezuiverde cellen Recapitulerend in vitro. Veel methoden zijn ontwikkeld om te isoleren en cultuur intact microglia, maar de meeste benaderingen rekenen op serum ter ondersteuning van de overleving van de cel. We hebben aangetoond dat toevoeging van serum, dat is een inherent variabele reagens met een breed scala van biologische actieve moleculen, is met name problematisch wanneer werken met microglia omdat het bevordert een Wortelpotigen morfologie, verhoogd proliferatie, en verhoogde fagocytose⁹ vaak gezien in vivo wanneer microglia worden blootgesteld aan bloed gedragen factoren na de verstoring van de bloed - hersenbarrière. Door deze statistieken, serum-blootgesteld cellen lijken op microglia letsel of ziekte staten, maar dergelijke veranderingen worden verlaagd wanneer microglia worden gekweekt in de gedefinieerde groeimedium met CSF-1 (of IL-34), TGF-β, cholesterol en seleniet.

Dit protocol biedt details voor het kweken van jonge rat microglia onder serumvrij voorwaarden, in verband met de onlangs gepubliceerde werk⁹. Dit protocol is gestroomlijnd voor ratten uit postnatale dag 21-30 (P21 - P30), maar kan worden aangepast aan het isoleren van microglia van ratten en muizen van elke leeftijd, hoewel opbrengst en algehele levensvatbaarheid is afhankelijk van de soort en de leeftijd van het dier. Maximale opbrengsten en optimale levensvatbaarheid wordt bereikt bij het gebruik van iets onvolwassen microglia (~ P9), met opbrengsten en levensvatbaarheid geleidelijk taps toelopende tot enigszins lagere niveaus in de volwassen dieren. Microglia kan ook geïsoleerd van muizen, maar we hebben gevonden dat de rat cellen tonen beduidend hogere opbrengsten, levensvatbaarheid en complexiteit van vertakte morphologies, in vergelijking met de muis cellen in serumvrij culturen. Dieren ouder groter is dan P50 zijn niet geëvalueerd met dit protocol. Deze immunopanning isolatie procedure is geoptimaliseerd om te minimaliseren van wijzigingen in microglial transcriptionele profielen tijdens isolatie en te maximaliseren downstream levensvatbaarheid van de cellen. Met behulp van deze technieken en media formuleringen, kunnen hoge-levensvatbaarheid primaire culturen weken worden volgehouden. Microglia gekweekt onder deze omstandigheden vertonen een zeer vertakte morfologie waarbij snelle uitbreiding en intrekking van processen en relatief lage tarieven van proliferatie. We wijzen op de betekenis van de serum-blootstelling op deze eigenschappen, en bespreken van de sterke punten en zwakheid van deze methode ten opzichte van andere benaderingen.

Protocol

Alle procedures waarbij knaagdieren voldaan aan Stanford University richtsnoeren, die in overeenstemming met nationale en staatswetten en beleid. Alle dierlijke procedures goedgekeurd door Stanford University's administratieve Panel op Laboratory Animal Care.

Opmerking: Alle composities van de oplossing en buffer vindt u in de Tabel van materialen.

1. Prepareer een petrischaal CD11b Immunopanning (dag 0)

Opmerking: 1 immunopanning schotel voorbereiden op elke 1-2 jonge rat hersenen.

1. Voeg 25 mL 50 mM Tris pH 9,5 oplossing aan een petrischaal 15 cm.
2. Geit-antimuis IgG (H + L-kettingen) toevoegen aan de schotel voor een eindconcentratie van 6 µg/mL. Swirl plaat gelijkmatig verdelen.
3. Incubeer de schotel voor 1-3 h bij 37 ° C.
4. Gerechten van de Spoel driemaal met DPBS⁺⁺ (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca^{2 +} en Mg^{2 +}), vervolgens vervangen door een oplossing van de buffer met 1 µg/mL OX42 antilichaam pannen. Laat de gerechten 's nachts bij kamertemperatuur op een vlakke ondergrond.

2. de weefsels collectie (dag 1)

Opmerking: Dit protocol moet ~ 3-4 uur duren.

1. Voordat u begint, moet u zorgen dat alle oplossingen zijn steriel en gekoeld op ijs. Chill alle instrumenten op ijs en steriliseren met ethanol voorafgaand aan gebruik.
2. Volgende passende regelgevende procedures, offeren een jonge laboratorium rat door kooldioxide verstikking.
   Opmerking: U kunt ook jongere dieren kunnen worden opgeofferd met een dodelijke dosis ketamine/xylazine (100-200 µL van 24 mg/mL ketamine, xylazine 2,4 mg/mL). Ketamine/xylazine moet worden gebruikt als dieren leeftijd van minder dan 14 dagen. Als u meerdere dieren, uittreksel van het weefsel van het ene dier en leg deze in vooraf gekoeld DPBS⁺⁺ op ijs voordat wij overgaan tot de volgende dieren.
3. Knijp een hindpaw en zorgt voor de volledige apathie van het dier voordat u verdergaat.
4. Transcardially perfuse het dier met 10-30 mL ijskoud perfusie buffer met behulp van een 27½-G naald, totdat de buffer loopt duidelijk.
   Opmerking: Volume van perfusie buffer zal variëren afhankelijk van de grootte/leeftijd van het dier.
5. Verwijder de kop van het dier onmiddellijk na perfusie. Vanuit het ruggenmerg snijd de occipital condyle aan beide zijden met een dissectie schaar, wees voorzichtig niet om de hersenen beschadigen. Na het snijden van weerskanten zorgvuldig, versneden één kant langs de pariëtale en voorhoofdsbeen richting het neusbeen. Met een tang voorzichtig terugtrekken van de bovenkant van de schedel, snel verwijderen van de hersenen (of CNS structuren van belang), en plaats in vooraf gekoeld DPBS⁺⁺ op ijs.
6. Herhaal voor alle resterende dieren.
   Opmerking: Alle stappen van de procedure moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow hood onder juiste steriele omstandigheden.

3. mechanische dissociatie (dag 1)

1. Nadat alle hersenen zijn verzameld, hak een hersenen in 1 mm³ stukjes in een petrischaal op ijs met een koude scalpel mes, en overbrengen naar een ijskoude dounce homogenizer met 5-7 mL ijskoud douncing buffer. Één hersenen distantiëren tegelijk.
2. Het weefsel dat 10-20 zacht en onvolledige slagen met een wijde dounce homogenizer distantiëren. Wees voorzichtig niet te verpletteren direct het weefsel aan de onderkant van de homogenizer, maar in plaats daarvan impel het weefsel door de ruimte tussen de zijkanten van de zuiger en de homogenizer.
3. Verwijder voorzichtig de zuiger om insleep van luchtbellen te voorkomen. Slecht gedissocieerde weefsel brokken om af te wikkelen naar de onderkant van de homogenizer toestaan en supernatant overbrengen in een nieuwe gekoeld 50 mL conische buis.
4. Het verwijderde volume vervangen door verse douncing buffer en herhaalt u stap 3.2 en 3.3 voor een totaal van 3-4 rondes, of totdat alle weefsel heeft zijn losgekoppeld. Herhaal de procedure voor elke hersenen.

4. myeline verwijdering (dag 1)

Opmerking: Myeline verwijdering wordt gebruikt voor isolatie van microglia van dieren ouder dan P12.

1. Meten van de omvang van de celsuspensie in de conische buis van 50 mL, met behulp van een precisiepipet 25 mL, voeg dan ijskoude douncing buffer om het totale volume aan 33.5 mL.
2. Voeg 10 mL van myeline scheiding buffer (MSB) naar de celsuspensie en meng grondig door het omkeren van de buis meerdere malen. Dit zal resulteren in een 23% eindconcentratie van MSB in een volume van 43,5 mL.
3. Centrifugeer cellen gedurende 15 minuten staan bij 500 x g bij 4 ° C bij langzaam remmen.
   Opmerking: De centrifuge moet duren ongeveer 1,5-2 min vertragen. Hierdoor genereert u een bovenste laag van myeline en dode cel puin, een enigszins troebele supernatant en een kleinere pellet die is verrijkt voor levende cellen.
4. Verwijder de bovenste laag van myeline/puin en de bovendrijvende substantie met een pipet. Wees voorzichtig bij het verwijderen van de bovenste laag om ervoor te zorgen, aangezien veel van het zoveel mogelijk is verwijderd.
5. Resuspendeer de pellet cel in 12 mL buffer pannen. Zachtjes triturate de celsuspensie te breken klontjes van cellen die kunnen blijven.

5. Immunopanning (dag 1)

1. De celsuspensie passeren door een zeef cel 70-µm groot puin of cel bosjes te verwijderen.
2. Spoel de OX42 beklede panning schotel driemaal met DPBS⁺⁺. Niet toestaan dat de plaat naar volledig droog tussen wast.
3. Giet af de laatste DPBS⁺⁺ wassen en de gefilterde celsuspensie van toepassing op de panning schotel. Zachtjes swirl van de plaat om te verspreiden van de cellen en Incubeer de plaat op een vlakke ondergrond bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om cellen te houden. Doen niet langer dan 20 min Incubeer of cellen wordt zeer moeilijk om te herstellen van de schotel.
4. Spoel de panning schotel met DPBS⁺⁺ 10 keer voor het verwijderen van niet-aanhanger cellen. Microglia zal worden stevig gekoppeld aan de plaat, zodat de plaat met elke spoelen om verwijdering van andere niet-aanhanger cellen wervelen.
5. Giet af de laatste DPBS⁺⁺ wassen en vervangen door 15 mL DPBS⁺⁺ en 200 μl trypsine (1,25% stockoplossing).
6. Incubeer de schotel voor ≤10 min bij 37 ° C met 10% CO₂ te trypsinize.
   Opmerking: Blijven niet langer dan 10 min of microglia zal worden moeilijk te verwijderen.
7. Na 10 min van trypsinebehandeling, zal microglia nog steeds worden geplakt op plaat. Giet af trypsine/DPBS⁺⁺ en 2 x met DPBS⁺⁺ vervangen met 12 mL ijskoud microglia groeimedium (MGM) te verwijderen van trypsine voorzichtig te wassen.
8. Plaats pannen schotel op het ijs gedurende 2 minuten om te helpen verzwakken cel/substraat interactie, en zorg ervoor dat de schotel is vlak om te voorkomen dat gebieden van de panning schotel uitdrogen.
9. Pipetteer krachtig met een 10 mL pipet en Pipetteer controller op hoge snelheid om te herstellen van cellen van de panning schotel. Tekent een raster van 16 x 16 met de stroom van de vloeistof uit de pipet te proberen en te verwijderen van alle cellen.
10. Controleer de cellen onder een microscoop op 20 X vergroting om ervoor te zorgen dat cellen hebben losgemaakt van de plaat. Mark plekken op de top van het gerecht waar de cellen nog steeds vast, en herhaal pipetteren in die gebieden.
11. Verzamelen celsuspensie en aliquoot 3-4 mL van het supernatans dat per 15 mL conische buis. Spin voor 15 min bij 500 x g bij 4 ° C bij langzaam remmen.
    Opmerking: Spinning microglia door middel van een klein volume zorgt voor de maximale herstel van cellen.
12. De bovendrijvende substantie, 0,5 mL van MGM verlaten met de cel pellet gecombineerd.
13. Resuspendeer elke pellet in resterende MGM en bundelen van de cellen van alle de buizen.
14. Cellen tellen met hemocytometer.
15. De cellen van de plaat zoals beschreven in stap 6 - 7 afhankelijk van de toepassing.
16. De cellen van de cultuur bij 37 ° C met 10% CO₂.
    Opmerking: Cellen kunnen cultuur voor maximaal 3-4 weken met veranderingen in de reguliere media of een week met geen wijzigingen van de media.

6. ter plaatse Coating weefselkweek platen/Coverslips (dag 1)

1. Plaat 15 µL van collageen IV coating direct in het centrum van een 24-well anionogene/kationische gecoate weefselkweek plaat (Zie Tabel van materialen voor details) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C met 10% CO₂.
2. Na het tellen van cellen met verdunde cellen van de hemocytometer aan 2.3 x 10⁵/mL in MGM. Gecombineerd collageen IV spot en onmiddellijk plaat 15 µL celsuspensie naar deze plek; Dit geeft 3.5 x 10³ cellen/plek. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C met 10% CO₂ cellen houden, voeg 500 µL van CO_{2 -}geëquilibreerd TGF-β2/IL-34/cholesterol met groeimedium (TIC) toestaan zachtjes naar de waterput.
3. Als plating op coverslips, eerste vacht steriele glazen coverslips met 10 µg/mL truc-D-lysine (PDL) in H₂O gedurende 1 uur bij RT, 3 keer wassen met H₂O en laten drogen in een kap onder UV-licht. Zodra de coverslips zijn droog, doorgaan met plek plating op de coverslips zoals beschreven in stap 6.2.

7. plating voor RNA/eiwit isolatie

1. Op dag 1, jas het gehele grondgebied van een 24-well anionogene/kationische gecoat weefselkweek plaat met collageen IV coating en incubeer voor 10 min - 1 uur bij 37 ° C met 10% CO₂, haal hem eruit en onmiddellijk plaat 3-5 x 10⁴ cellen per putje in CO₂ geëquilibreerd TIC media.
2. Uitvoeren op dag 2, een wijziging van de 50% media voor elk goed de dag na bereiding. Dode cellen de neiging om het cluster in het midden van de put, dus neem media vanaf daar.
3. Uitvoeren van een 50% media veranderen elke 2-3 dagen om te handhaven de culturen. Als media aangebrachte een ongewenste variabele voor de culturen introduceren, kunnen cellen overleven voor ongeveer 1 week zonder enige veranderingen van de media, in tegenstelling tot de meer dan 3 weken met regelmatig onderhoud.

Representative Results

Dit protocol wordt een methode beschreven om cultuur hoge zuiverheid vertakt microglia van jonge ratten. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met behulp van onrijpe, perinatale en volwassen dieren, zoals hieronder besproken. Omdat cel isolatie vaak bevatten subtiele nuances en veel mogelijkheden voor cellen om te sterven, wij gewend kwaliteitscontrole controlepunten helpen bepalen succes op verschillende stappen. Wij gecontroleerd meestal schorsingen van de cel met behulp van een hemocytometer op meerdere stappen in het protocol van de isolatie (figuur 1A). Succesvolle isolatie moeten opleveren van 2,5-5 x 10⁵ cellen/juveniele dieren. Dieren uit de P7 - P15 Toon opbrengsten dichter tot en met 5 x 10⁵ cellen/dier, overwegende dat cellen van dieren ouder dan P30 geïsoleerd Toon opbrengsten dichter naar 2.5 x 10⁵ cellen/dier. Dan alleen het toezien van de cel totaal graven in het gehele protocol, is het belangrijk om te bepalen van de algehele gezondheid van geïsoleerde cellen, die kan moeilijk zijn omdat microglia geïsoleerd op deze manier hebben een afgeronde of bipolaire morfologie tijdens de eerste paar dagen in cultuur . We hebben hier, fase beelden van P25 microglia opgenomen in cultuur gedurende de eerste 6 dagen na isolatie in TIC en TIC met 10% foetaal kalfsserum (FCS) (figuur 1B).

Figuur 1: evaluatie van cell gezondheid tijdens het protocol van de isolatie en meer dan 6 dagen cultuur. (A) fase-contrast beelden ter illustratie kwaliteitscontrole controleposten op de aangewezen stappen in de procedure van de isolatie van de cel. Cellulaire schorsingen werden door het mengen van 9 µL van de cellulaire ophanging met 1 µL van 0,4% trypan blauwe vóór het laden op een hemocytometer beeld. Andere beelden tonen de panning schotel zelf, en alle afbeeldingen worden weergegeven als één veld bij 20 X vergroting. Schaal bar, 200 µm. MGM, microglia groeimedium. (B) tijdsverloop van microglial morfologische wijzigingen en proliferatie over 6 dagen van de cultuur in serumvrij TIC groei medium of TIC vermeerderd met 10% foetaal kalfsserum (FCS). CD11b-immunopanned cellen werden ter plaatse verguld op anionogene en kationogene gecoate weefselkweek collageen beklede plaat (Zie Tabel van materialen voor details), en hetzelfde veld was beeld door fase contrast elke 24 h. schaal bar, 100 µm. TIC, TGF-β2/IL-34 / Cholesterol met groeimedium. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Evaluatie van de routine van de gezondheid en levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen is belangrijk voor de reproduceerbaarheid en het succes van experimenten. Hier laten we microglia geïsoleerd uit een P21 dier gekweekte in MGM, TIC of TIC aangevuld met 10% FCS na 7 dagen in vitro (DIV) met een test van de levensvatbaarheid. Als de isolatie succesvol was, Toon culturen tussen 80-90% levensvatbaarheid in TIC na 7 DIV. cellen gekweekt in het bijzijn van serum uiteindelijk klimmen in de buurt van 100% levensvatbaarheid door deze maatregel, maar dit is zowel door de snelle verspreiding van kunstmatig opgeblazen serum-blootgesteld cellen en snelle fagocytose van dode cellen binnen deze culturen (figuur 2A). Naast robuuste overleving weergeven TIC gekweekte cellen ook een vertakte morfologie in vergelijking met FCS behandeld cellen (figuur 2B, C).

Figuur 2: voortbestaan van microglia in MGM, TIC of TIC + FCS meer dan zeven dagen cultuur. (A) cellen werden geïsoleerd uit P21 ratten en gekweekt in microglia groeimedium (MGM), TGF-β2/IL-34/Cholesterol met groeimedium (TIC), of TIC + 10% foetaal kalfsserum (FCS). Op elk tijdstip, werd kweekmedium aangevuld met calceïne AM (1,33 µM def.) en ethidium homodimer (2,5 µM definitieve) gedurende 15 minuten op het etiket van levende cellen en dode cellen respectievelijk. Cellen werden geteld in elk veld met behulp van een geautomatiseerd script ImageJ. (B en C) na 7 DIV, met geen media veranderingen, cellen gekweekt in TIC (B) of TIC aangevuld met 10% FCS (C) werden gebeitst om levende en dode cellen zoals hierboven van een label. Representatieve beelden werden genomen met behulp van een 10 X (links) of 40 X (rechts) doelstelling. Schaal bar, 40 µm. foutbalken vertegenwoordigen standaardfout van het gemiddelde (SEM). Dit cijfer werd vanaf Bohlen et al. gewijzigd ⁹ en met toestemming gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Om aan te tonen van succesvolle isolatie en cultuur van zeer zuivere microglia, we microglia van P21 ratten geïsoleerd en gekweekt deze cellen in TIC of TIC aangevuld met 10% FCS voor 8 dagen. Cellen werden vervolgens vast en gekleurd met microglial markeringen (Iba-1 en CD11b) en proliferatie marker (Ki67, figuur 3A). In aanvulling op de kleuring voor cel markeringen, RNA-seq op vers geïsoleerde cellen kunt biedt een krachtige en gevoelige instrument voor de beoordeling van het RNA-Profiel van de cellen, en kan helpen bij het informeren van de startende zuiverheid van culturen. CD11b immunopanning resulteert meestal in een klein percentage van de CD11b⁺ neutrofielen/monocyt overdracht naast CD11b⁺ microglia (figuur 3B). Deze cellen zullen sterven in TIC na een paar dagen, maar analyses van eerdere tijdstippen kunnen bemoeilijken.

Figuur 3: zuiverheid van de gekweekte cellen als beoordeeld door immunohistochemistry en RNA-volgende (A) Microglia werden geïsoleerd uit P21 ratten, vergulde op PDL/collageen gecoat glas coverslips en gekweekt in TGF-β2/IL-34/Cholesterol met groeimedium (TIC) voor 8 dagen. Cellen werden vastgesteld met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en immuun-gekleurd met Iba-1 (1:500), CD11b (1:1500), en Ki67 (1:500). Kort, vaste cellen werden geblokkeerd met 0,1% wasmiddel (Zie methoden tabel voor details) en 10% normale ezel serum (NGS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Cellen werden vervolgens geïncubeerd met primaire antilichamen in 0,1% wasmiddel met 1% NGS bij 4 ° C. overnacht Cellen werden drie keer, gedurende 5 min in PBS gewassen. Cellen werden vervolgens geïncubeerd met secundaire antilichamen alle 1:500 in 0,1% wasmiddel met 1% NGS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Cellen waren weer drie keer in PBS gewassen en gemonteerd met DAPI-bevattende montage medium. Representatieve beelden werden genomen bij 40 X vergroting. Schaal bar, 50 µm. (B) uitdrukking van representatieve celtype-specifieke transcripties door vers-geïsoleerde en gekweekte cellen. Microglia werden geïsoleerd van P21 ratten en lysed rechtstreeks vanuit de immunopanning schotel voor RNA isolatie en RNA-seq. Markers van andere grote CNS soorten cellen (astrocyten, neuronen, oligodendrocyten en endotheliale cellen) Toon minimale besmetting van CD11b-immunopanned cellen. Neutrofiele markeringen worden gedetecteerd in de vers-geïsoleerde cellen (zwart), maar gaan verloren in serumvrij culturen (grijs). Gekweekte cellen express hoge niveaus van gemeenschappelijke macrofaag markers, maar markeringen definiëren de gespecialiseerde microglial handtekening zijn snel werden door gekweekte cellen. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Gegevens zijn gewijzigd van Bohlen et al. ⁹ en met toestemming gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Kleuring voor levensvatbaarheid en de cel markeringen voorziet in de bepaling van het voortbestaan en de zuiverheid van de cellen, maar beperkte informatie over de dynamiek van de cultuur. Wij hebben hier een time-lapse film van P21 rat microglia verstrekt na 14 DIV in de TIC. Na twee weken, serumvrij culturen Toon dynamische toezicht gedrag, met snelle proces extensies en intrekken gedurende de schotel (Zie film 1). Daarnaast hebben we eerder gevonden dat serum blootstelling transformeert deze rust staat eigenschappen van microglia, wat resulteert in duurzame morfologische en fagocytische veranderingen. We hebben een film van microglia gekweekte voor 5 dagen opgenomen in TIC, dan blootgesteld aan 10% FCS (Zie Movie 2).

Film 1: gedefinieerd-medium microglia culturen weergeven waarvoor morfologie met dynamische processen. Microglia werden geïsoleerd uit een P21 rat, ter plaatse vergulde op anionogene en kationogene gecoate weefselkweek collageen beklede platen, en gekweekte voor 14 dagen in TIC. Op 14 DIV, werden beelden verzameld elke 3 min. De film speelt bij 6 kaders/s, en de tijdstempel in de rechterbenedenhoek duidt de duur voor imaging in h:min. film is gereproduceerd van Bohlen et al. ⁹ en met toestemming gebruikt. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Movie 2: Serum blootstelling veroorzaakt een snelle morfologische veranderingen in culturen gedefinieerd-medium microglial. Microglia werden geïsoleerd uit een P21 rat, ter plaatse vergulde op anionogene en kationogene gecoate weefselkweek collageen beklede platen, en gekweekte voor 5 dagen in de TIC. Op 5 DIV, beelden werden verzameld elke 5 min. basislijn motiliteit/morfologie werd opgenomen, dan om 2:55 (2 h, 55 min), een 50% media verandering werd uitgevoerd om het FCS toevoegen om een eindconcentratie van 10%. Cellen werden voor een extra 7 h beeld. De film speelt bij 6 kaders/s, en de tijdstempel in de rechterbenedenhoek geeft de duur van de beeldvorming in h:min. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

Omdat microglia dienen als sentinel immuuncellen van het centraal zenuwstelsel, zijn ze zeer soepel reageren op veranderingen in het milieu; Daarom is zorgvuldig vereist om te minimaliseren van inflammatoire reacties binnen de cellen tijdens hun isolement en de cultuur⁸. Dit wordt bereikt in dit protocol door snelheid en temperatuur. Het houden van de cellen op ijs of bij 4 ° C wanneer mogelijk sterk activering, vermindert zodat alle centrifugeren stappen bij 4 ° C plaatsvinden, de dieren zijn geperfundeerd met ijskoude perfusie buffer, en het protocol is gestroomlijnd om te minimaliseren van de tijd tussen weefsel Extractie en kweken van de cellen. Als beoordeling van gen expressiepatronen van vers-geïsoleerde cellen, oogst cel lysates rechtstreeks vanuit de schotel immunopanning CD11b voorafgaand aan de trypsinebehandeling te houden van isolatie-geïnduceerde veranderingen tot een minimum. Opgemerkt moet worden dat zelfs zorgvuldig-geïsoleerde microglia een ontstekingsreactie onmiddellijk na wordt geplaatst in warme temperaturen, vermoedelijk als gevolg van de erkenning van schade-geassocieerde signalen intrinsiek verbonden met de isolatie-procedure uitvoeren. Als het protocol werd met succes uitgevoerd, worden 2.5-5 x 10⁵ cellen/juveniele rat verwacht.

De cel isolatie-protocol bedoeld hier is zeer specifiek voor het isoleren van CD11b + cellen uit de perfused CNS-⁹. Hoewel de bevolking van deze cel voornamelijk uit microglia bestaat, bevat het ook lage niveaus van andere myeloïde populaties zoals gerelateerde macrofagen, meningeal macrofagen, plexus choroideus macrofagen, monocyten en neutrofielen¹⁰. Vaatvlies-geassocieerde myeloïde cellen kunnen hoofdzakelijk worden geëlimineerd door erkenning en verwijdering van de plexus choroideus voorafgaand aan weefsel dissociatie. Hersenvliezen kunnen ook tot op zekere hoogte worden verwijderd, maar volledige eliminatie van alle meningeal weefsel is niet praktisch binnen de termijnen die voor snelle isolatie hier beschreven wordt gericht. Daarom, als u wilt beperken variabiliteit als gevolg onvolledige verwijdering van hersenvliezen, we niet verwijdert hersenvliezen. Om te minimaliseren van het aantal van circulerende monocyten/neutrofielen in het geïsoleerde materiaal, het is ook belangrijk dat een schone perfusie en we doorgaans negeren weefsel dat is slecht geperfundeerd. Zelfs met uitstekende perfusie is Goedkeuringvande bloed niet absoluut, zoals door de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid erytrocyten in cel pellets gedurende de zuivering blijken zal. Dus, kleine monocyten en neutrofielen zijn mede gezuiverd en dragen een duidelijke handtekening in transcriptomic profielen van vers-geïsoleerde cellen. Echter, circulerende cellen zal snel sterven in serumvrij TIC media en vertegenwoordigen niet persistent contaminanten, hoewel ze blijven kunnen om te overleven en zich verspreiden in het serum met culturen.

Een ander belangrijk punt aan het bereiken van een gezonde, goed functionerende cultuur is het verzorgen tijdens de mechanische dissociatie stappen. Terwijl douncing vele neuronen, glia en andere doodt overleven CNS cellen, microglia deze dissociatie relatief ongedeerd (hoewel microglia kan ook worden gedood door over-douncing). Indien correct gedaan, dit protocol resulteert in cel opbrengsten vergelijkbaar zijn met die verkregen met behulp van Proteolytische dissociatie, overwegende dat potentieel verstorende variabelen uit weefsel inflammatoire reacties bij verhoogde temperaturen zijn vermeden. Door het uitvoeren van opeenvolgende onvolledig rondes van mechanische weefsel dissociatie, kunnen afzonderlijke cellen geoogst worden uit de suspensie terwijl het minimaliseren van de hoeveelheid mechanische belasting op de algemene cultuur.

Het protocol van de immunopanning hier beschreven is een betrouwbare en reproduceerbare manier isoleren microglia, maar andere vergelijkbare methoden zijn beschikbaar. We hebben bereikt soortgelijke resultaten met behulp van magnetische isolatie met magnetische-geactiveerde cel sorteren van myeline uitputting en CD11b selectie. We hebben hier gericht op de immunopanning-methode, omdat het de culturen van de hoogste kwaliteit tot op heden heeft verstrekt, minder gespecialiseerde apparatuur vereist en geen inleiding van ijzeroxide-geconjugeerde antilichamen aan de cellen onmiddellijk voorafgaand aan de cultuur vereist. Een andere benadering vaak gebruikt voor microglial isolatie is cytometry van de stroom, die een groot voordeel ten opzichte van de huidige aanpak heeft in die protocollen bestaan voor zuivering van bona fide microglia uit andere CD11b + myeloïde verontreinigingen met behulp van oppervlak antilichamen tegen handtekening markeringen zoals TEMEM119⁸. Hoewel de fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren resulteert in een zeer zuivere celpopulatie, ook legt extra benadrukt aan de cellen en kan resulteren in lagere levensvatbaarheid culturen of lagere opbrengsten. Over het algemeen richten we ons op antilichamen gebaseerde methoden over label-vrije dichtheid centrifugeren en shake-off preparaten te maximaliseren de reproduceerbaarheid en de zuiverheid van de celpopulatie.

Terwijl dit protocol is geoptimaliseerd voor de cultuur van jonge rat microglia, kan het worden gebruikt om cultuur microglia van verschillende leeftijden; cel Totaal opbrengsten zijn maximale uit 1 - 2-week-oude ratten, nadat de piek van de expansie van de microglial is verstreken en vóór structurele herschikkingen die met herstel van de cellen uit oudere weefsel interfereren. Microglia kan ook worden geïsoleerd en gekweekt van muis en menselijk weefsel door het antilichaam CD11b vervangen door een passende monoklonaal antilichaam specifiek voor muis of menselijke epitopes. Terwijl zowel de muis en de mens microglia onder de voorwaarden van deze cultuur overleven, tonen ze morfologische verschillen in vergelijking met rat cellen. Muis cellen behouden een vertakte morfologie maar hebben minder werken van processen, terwijl menselijke cellen een bijna uniforme Wortelpotigen morfologie hebben bij geïsoleerd en volgens deze procedure gekweekt.

Geïsoleerde microglia kan op verschillende manieren afhankelijk van de vereiste tests worden verguld. Voor een optimaal resultaat (zoals geïllustreerd in de live/dead testen en morfologische films die hier vertoond) waren 3.5 x 10³ cellen "spot" in het midden van de put van een 24-well anionogene/kationische gecoate weefselkweek plaat na een 10-min-coating van collageen IV als verguld beschreven in het bovenstaande protocol. Als alternatief voor experimenten die grote aantallen cellen, zoals RNA isolatie, kunnen 3-5 x 10⁴ cellen worden verguld per putje van de plaat van een 24-well na 10 min tot 1 h van collageen IV coating. Cellen uitplaten aan hogere dichtheden bleek iets lager levensvatbaarheid en minder complexe morfologie in vergelijking met cellen die ter plaatse werden behandeld, mogelijk als gevolg van de impact van inflammatoire signalen uitgescheiden in reactie op de isolatie. Voor immunohistochemistry of imaging glas coverslips vereisen, cellen vertonen het beste overleven en morfologie toen coverslips eerste bekleed met PDL dan gecoat in collageen IV, zoals hierboven beschreven. Voor tests waarbij een groot aantal voorwaarden, is de levensvatbaarheid van de cellen ook hoog in 96-Wells of 384-well collageen beklede platen. In alle omstandigheden, de cellen beginnen uit ronde of bipolaire, beginnen te verwerven van de processen rond dag 3-4, en 5-10 dagen om de maximaal vertakte morfologie geïllustreerd in Figuur 1 en film 1tentoon te stellen.

Terwijl dit protocol in een cultuur die exposities van toezicht op dynamische gedrag en morfologie vergelijkbaar rusten microglia in vivo resulteert, deze cellen niet volledig behouden de gespecialiseerde gen expressie Handtekeningvan microglia in vivo. Veel van de veranderingen van de voortdurende gen waargenomen in gekweekte cellen weerspiegelen de wijzigingen meestal gezien in de embryonale of ontstoken CNS-⁹. Zo, dit protocol betekent een stap voorwaarts in het begrip van de voorwaarden microglia nodig heeft om te overleven in de cultuur en de serum-opgeroepen wijzigingen, maar verder onderzoek is nodig om te begrijpen de extrinsieke signalen geboden door de CNS, die microglial verfijnen eigenschappen en gen-expressie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.