Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Summary

Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.

Abstract

Mikroglia repräsentieren ca. 5-10 % aller Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) und sind immer mehr Aufmerksamkeit durch ihre Beiträge während der Entwicklung, Homöostase und Krankheit. Obwohl Makrophagen im Detail für Jahrzehnte, spezielle Funktionen der Mikroglia, die Gewebe-Bewohner Makrophagen des ZNS untersucht wurden, blieben weitgehend geheimnisvoll, teilweise aufgrund von Einschränkungen in der Fähigkeit, Reife Mikroglia rekapitulieren Unterkünfte in Kultur. Hier zeigen wir ein einfaches Verfahren für die schnelle Lokalisierung der reinen Mikroglia aus dem Reifen Nagetier Gehirn. Wir beschreiben auch serumfreien Kulturbedingungen, die hohe Rentabilität der Mikroglia im Laufe der Zeit unterstützen. Mikroglia, die unter diesen Bedingungen definiert-Medium kultiviert weisen aufwändige verzweigte Prozesse und dynamische Überwachung Verhalten. Wir veranschaulichen einige Auswirkungen der Serum-Exposition auf kultivierten Mikroglia und besprechen, wie diese serumfreien Kulturen im Vergleich zu Serum-exponierten Kulturen sowie Mikroglia in Vivo.

Introduction

Als Makrophagen CNS Parenchym Mikroglia interagieren mit einer Vielzahl von neuronalen Schaltkreise und Glia Signalisierung Netzwerke. Sie spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Homöostase des Gehirns durch synaptische Rebschnitt, apoptotische Zelle Abfertigung und transiente Interaktionen mit neuronalen Prozessen^1,2. Mikroglia sind frühe Responder zu neurologischen Verletzungen, erweitern ihre langen, dünnen Prozesse Läsionsorte zu Entzündungsreaktionen zu koordinieren und Blutungen^3,4zu begrenzen. Veränderungen in der Mikroglia Morphologie und Funktion sind allgegenwärtig in akuten und chronischen Verletzungen der CNS und Mikroglia Ausstellung verändert, Morphologie, Lokalisierung und Ausdruck von Entzündungsmediatoren in einem breiten Spektrum von Krankheit Staaten¹. Menschliche genetische Studien zeigen, dass Mutationen, die Gefahr für Neurodegenerative Erkrankungen verändern oft überwiegend oder ausschließlich von Mikroglia im intakten ZNS, Hinweis auf eine entscheidende Rolle für die Mikroglia in der Pathogenese der Krankheit oder das Fortschreiten^{5 ausgedrückt werden} . Da ihre Prominenz bei Verletzungen und Krankheit, ist fördern das Verständnis der Mikroglia Biologie einen hohen Stellenwert für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.

Viele wichtige Fortschritte für das Verständnis der Mikroglia Biologie entstanden durch Extrapolation Techniken und Mechanismen, die in Studien von anderen Makrophagen Populationen einschließlich Kulturmethoden, gen Expressionsprofile und Definition der funktionalen entdeckt / morphologischen Staaten. Obwohl generalisiert Makrophagen Funktionen oft auf überraschende Weise in der CNS-Landschaft spielen, Mikroglia selbst sind hochspezialisiert, ausstellenden eine verzweigte Morphologie und eine einzigartige gen Ausdruck Signatur, die sie von anderem Gewebe unterscheidet Makrophagen-⁶. Mikroglia haben eine Linie, die sich von den meisten anderen Gewebe Makrophagen unterscheidet; Sie besiedeln die CNS während einer frühen embryonalen Welle der primitiven Hämatopoese und selbst im gesamten Leben, unabhängig von der definitiven Hämatopoese⁷Beiträge zu erneuern. Die vollreifen gen Ausdruck Unterschrift des Erwachsenen Mikroglia wird nicht bis die zweite postnatalen Woche⁸erreicht. Ökologische Hinweise aus dem umliegenden Gewebe Rolle diktieren gewebespezifischen Makrophagen Funktionen⁶, die im ZNS beschränkt Belastung durch Blut übertragbare Faktoren gewährt durch die Blut - Hirn-Schranke⁹beinhaltet eine wichtige.

Ein Hindernis für die Mikroglia Beiträge zu CNS-Homöostase und Krankheit vollständig zu verstehen ist die Schwierigkeit, die speziellen Eigenschaften der Reifen Mikroglia gesehen in Vivo mit gereinigten Zellen Rekapitulation in-vitro-. Viele Methoden wurden entwickelt, um zu isolieren und Kultur intakt Mikroglia, aber die meisten Ansätze setzen auf Serum, Überleben der Zellen zu unterstützen. Wir haben gezeigt, dass die Zugabe von Serum, das ist ein von Natur aus Variable Reagenz enthält eine breite Palette von bioaktiven Moleküle, ist besonders problematisch, wenn arbeiten mit Mikroglia weil es eine amöboiden Morphologie fördert Verbreitung erhöht, und erhöhte Phagozytose⁹ oft gesehen in Vivo bei Mikroglia blutübertragbaren Faktoren nach der Unterbrechung der Blut - Hirn-Schranke ausgesetzt sind. Durch diese Metrik Serum-exponierten Zellen Microglia Verletzungen oder Krankheiten ähneln, aber derartige Veränderungen reduziert wenn Mikroglia in definierten Wachstumsmedium mit CSF-1 (oder IL-34), TGF-β, Cholesterin und Selenit kultiviert werden.

Dieses Protokoll enthält Details zur Kultivierung juvenile Ratte Mikroglia unter serumfreien Bedingungen im Zusammenhang mit kürzlich veröffentlichtes Werk⁹. Dieses Protokoll wurde für Ratten von postnatale Tag 21-30 (P21 - P30) gestrafft, aber an Microglia von Ratten und Mäusen jeden Alters isolieren angepasst werden kann, obwohl der Ertrag und die gesamte Tragfähigkeit abhängig von der Art und dem Alter des Tieres variiert. Maximale Erträge und optimale Rentabilität ist erreicht, wenn etwas unreif Mikroglia verwenden (~ P9), mit Erträgen und Lebensfähigkeit allmählich verjüngt sich zu etwas niedrigere Ebenen bei erwachsenen Tieren. Mikroglia kann auch von Mäusen isoliert sein, aber wir haben festgestellt, dass die Rattenzellen deutlich höhere Erträge, Rentabilität und Komplexität der verzweigten Morphologien, zeigen im Vergleich zu Mauszellen in serumfreien Kulturen. Tiere im Alter von mehr als P50 mit diesem Protokoll nicht ausgewertet wurden. Dieses Immunopanning-Isolierung-Verfahren wurde optimiert, um Veränderungen der Mikroglia transcriptional Profile bei Isolierung zu minimieren und nachgelagerten Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Mit diesen Techniken und Medien Formulierungen, können hohe Rentabilität Primärkulturen wochenlang aufrecht erhalten werden. Unter diesen Bedingungen kultiviert Mikroglia weisen eine stark verzweigte Morphologie mit schnellen ein- und Ausfahren der Prozesse und relativ niedrige Rate der Verbreitung. Wir unterstreichen die Bedeutung der Serum-Exposition auf diese Eigenschaften und stärken und Schwächen dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen zu diskutieren.

Protocol

Alle Verfahren, die Nagetiere entsprach Stanford University Richtlinien, welche nationalen und staatlichen Gesetze und Richtlinien einhalten. Stanford University Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care stimmten alle tierische Verfahren.

Hinweis: Alle Lösung und Puffer Kompositionen sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt.

1. bereiten Sie eine Petrischale für CD11b Immunopanning (Tag 0)

Hinweis: Bereiten Sie 1 Immunopanning Gericht für jeden 1-2 juvenile Ratten Gehirne.

1. Eine 15 cm Petrischale 25 mL 50 mm Tris pH 9.5 Lösung hinzufügen.
2. Fügen Sie Ziege Anti-Maus IgG (H + L-Ketten hinzu), die Schüssel für eine Endkonzentration von 6 µg/mL. Wirbel-Platte zu verteilen.
3. Inkubieren Sie die Schale für 1-3 h bei 37 ° c
4. Spülen Geschirr dreimal mit DPBS⁺⁺ (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca^{2 +} und Mg^{2 +}), dann mit einer Lösung aus schwenken Puffer mit 1 µg/mL OX42 Antikörper zu ersetzen. Lassen Sie die Gerichte über Nacht bei Raumtemperatur auf einer flachen Oberfläche.

(2) Gewebe Sammlung (Tag 1)

Hinweis: Dieses Protokoll dauert ca. 3-4 h.

1. Sicherzustellen Sie bevor Sie beginnen, dass alle Lösungen sind steril und gekühlt auf Eis. Entspannen Sie alle Instrumente auf Eis und mit Ethanol vor Gebrauch sterilisieren.
2. Nach entsprechenden behördlichen Verfahren Opfere eine juvenile Laborratte durch Kohlendioxid ersticken.
   Hinweis: Alternativ können jüngere Tiere mit einer letalen Dosis von Ketamin/Xylazin (100-200 µL 24 mg/mL Ketamin, 2,4 mg/mL Xylazin) geopfert werden. Ketamin/Xylazin muss verwendet werden, wenn Tiere weniger als 14 Tage alt sind. Wenn mehrere Tiere zu verwenden, extrahieren Sie das Gewebe von einem Tier zu und in vorgekühlt DPBS⁺⁺ auf dem Eis vor der nachfolgenden Tiere.
3. Klemmen Sie ein Hindpaw und sorgen für komplette Teilnahmslosigkeit des Tieres, bevor Sie fortfahren.
4. Transcardially Durchspülen des Tieres mit 10-30 mL eiskaltes Perfusion Puffer mit einer 27½-G-Nadel bis Puffer klar ist.
   Hinweis: Volumen der Perfusion Puffer variiert je nach Größe/Alter des Tieres.
5. Entfernen Sie sofort nach der Perfusion der Kopf des Tieres. Aus das Rückenmark der occipital-Kondylus auf jeder Seite mit Dissektion Schere schneiden, achten Sie darauf, das Gehirn schädigen. Nach dem Schneiden Schneiden jeder Seite sorgfältig, einseitig entlang der parietalen und Stirnbein auf dem Nasenbein. Mit einer Pinzette vorsichtig zurückziehen Sie der Spitze des Schädels, schnell entfernen Sie das Gehirn (oder CNS Strukturen von Interesse), und in vorgekühlt DPBS⁺⁺ auf Eis.
6. Wiederholen Sie für alle verbleibenden Tiere.
   Hinweis: Alle Schritte des Verfahrens sollte in einem Laminar-Flow-Abzug unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

3. mechanische Dissoziation (Tag 1)

1. Nachdem alle Gehirne gesammelt haben, ein Gehirn in 1 mm³ Stücke in einer Petrischale auf Eis mit einem kalten Skalpellklinge hacken und transfer zum einen eiskalten Dounce-Homogenisator mit ca. 5-7 mL eiskaltes Douncing Puffer. Ein Gehirn zu einem Zeitpunkt zu distanzieren.
2. Distanzieren Sie das Gewebe mit 10-20 sanft und unvollständige Strichen mit eine locker sitzende Dounce-Homogenisator. Achten Sie darauf, nicht direkt das Gewebe am unteren Rand der Homogenisator zu zerquetschen, aber stattdessen drängen des Gewebes durch den Raum zwischen den Seiten des Kolbens und der Homogenisator.
3. Entfernen Sie vorsichtig den Kolben um Einführung von Luftblasen zu verhindern. Können Sie schlecht dissoziierten Gewebe Stücke sich am unteren Rand der Homogenisator und übertragen Sie überstand auf eine neue gekühlte 50 mL konische Rohr.
4. Ersetzen Sie den entfernten Datenträger mit frischen Douncing Puffer, und wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 für eine Gesamtmenge von ca. 3-4 Runden oder bis alle Gewebe getrennt worden. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Gehirn.

4. Myelin Entfernung (Tag 1)

Hinweis: Myelin Abbau dient zur Isolierung der Mikroglia von Tieren, die älter als P12.

1. Messen Sie das Volumen der Zellsuspension in der 50 mL konische Röhre mit einer 25 mL-Pipette, dann fügen Sie eiskalte Douncing Puffer, um das Gesamtvolumen auf 33,5 mL einstellen.
2. 10 mL Myelin Trennung Puffer (MSB) am Zellsuspension und fügen Sie Mischung gründlich durch Umdrehen der Röhre mehrere Male hinzu. Dadurch wird eine 23 % Endkonzentration von MSB in einem Volumen von 43,5 mL.
3. Zentrifugieren Sie Zellen für 15 min bei 500 X g bei 4 ° C mit langsamen Bremsen.
   Hinweis: Die Zentrifuge dauert ca. 1,5-2 min zu verlangsamen. Dies generiert eine obere Schicht von Myelin und tote Zelle Schutt, einen etwas düsteren überstand und eine kleinere Pellets, die für lebende Zellen angereichert ist.
4. Entfernen Sie die obere Schicht des Myelin/Schutt und der Überstand mit einer Pipette. Vorsicht beim Entfernen der obersten Schicht sicherzustellen, wie viele davon wie möglich entfernt wird.
5. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 12 mL Puffer schwenken. Genannte sanft die Zellsuspension zu brechen Klumpen von Zellen, die bleiben könnte.

5. Immunopanning (Tag 1)

1. Durchlaufen Sie die Zellsuspension ein 70 µm Zelle Sieb, großen Trümmer oder Zelle Klumpen zu entfernen.
2. Spülen Sie die OX42-beschichtete panning Schale dreimal mit DPBS⁺⁺. Lassen Sie nicht die Platte trocken zwischen den Waschgängen.
3. Die letzten DPBS⁺⁺ waschen abgießen und panning Gericht die gefilterte Zellsuspension zuweisen. Vorsichtig schwenken Sie die Platte, um die Zellen zu verteilen, dann inkubieren Sie die Platte auf einer flachen Oberfläche bei Raumtemperatur für 20 min damit Zellen halten. Nicht länger als 20 min inkubieren oder Zellen werden sehr schwierig, aus der Schale zu erholen.
4. Spülen Sie das panning Gericht mit DPBS⁺⁺ 10 Mal, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Mikroglia werden fest mit der Platte verbunden, so schwenken Sie die Platte mit jedem abspülen, um sicherzustellen, dass andere nicht anhaftende Zellen entfernt.
5. Gießen Sie die letzten DPBS⁺⁺ waschen und ersetzen durch DPBS⁺⁺ 15 mL und 200 μL Trypsin (1,25 % Stammlösung).
6. Inkubieren Sie die Schüssel für ≤10 min bei 37 ° C mit 10 % CO₂ zu trypsinize.
   Hinweis: Nicht länger als 10 min weiter oder Mikroglia wird nur schwer zu entfernen.
7. Nach 10 min Trypsinization wird die Mikroglia noch auf Platte geklebt werden. Trypsin/DPBS⁺⁺ Gießen Sie ab und waschen Sie vorsichtig 2 X mit DPBS⁺⁺ Trypsin zu entfernen, ersetzen mit 12 mL eiskaltes Mikroglia Wachstumsmedium (MGM).
8. Ort schwenken Gericht für 2 min auf Eis zur Zelle/Substrat Interaktion zu schwächen, und sicherstellen, dass die Schale ist flach bis Bereiche der Schwenk Schale Austrocknen verhindert wird.
9. Pipette kräftig mit einem 10 mL Pipette und Pipettieren Controller auf high-Speed Zellen aus der Schwenk Schale wiederherstellen. Zeichnen Sie ein 16 x 16-Gitter mit dem Strom der Flüssigkeit aus der Pipette zu versuchen, und entfernen alle Zellen.
10. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei 20 X Vergrößerung, um sicherzustellen, dass Zellen von Platte losgelöst haben. Mark-Flecken auf der Schale, wo Zellen sind immer noch fest, und wiederholen Sie in diesen Bereichen pipettieren.
11. Sammeln Sie Zellsuspension und aliquoten 3-4 mL überstand pro 15 mL konische Röhrchen. Spinnen Sie für 15 min bei 500 X g bei 4 ° C mit langsamen Bremsen.
    Hinweis: Spinning Mikroglia durch ein kleines Volumen ermöglicht die maximale Regeneration der Zellen.
12. Aspirieren des Überstands, 0,5 mL von MGM mit der Pellet-Zelle zu verlassen.
13. Aufschwemmen Sie jedes Pellet im übrigen MGM und bündeln Sie die Zellen von den Schläuchen.
14. Anzahl Zellen mit Hemocytometer.
15. Platte Zellen wie in Schritt 6 - 7 je nach Anwendung beschrieben.
16. Zellkulturen bei 37 ° C mit 10 % CO₂.
    Hinweis: Zellen können für bis zu 3-4 Wochen mit regelmäßigen Medien Änderungen oder eine Woche mit unveränderten Medien Kultur sein.

6. Ort Beschichtung Gewebekultur Platten/Deckgläsern (Tag 1)

1. Platte 15 µL Kollagen IV Beschichtung direkt in der Mitte einer 24-Well anionischen/kationischen beschichtete Gewebe-Kultur-Platte (siehe Tabelle der Materialien für Details) und inkubieren Sie für 15 min bei 37 ° C mit 10 % CO₂.
2. Nach dem zählen von Zellen mit Hemocytometer verdünnen Sie Zellen auf 2,3 x 10⁵/mL im MGM. Aspirieren Sie Kollagen IV-Stelle und sofort Platte 15 µL Zellsuspension zu dieser Stelle; Dadurch erhalten 3,5 x 10³ Zellen/Spot. 5-10 min bei 37 ° C mit 10 % CO₂ erlauben Zellen zu halten, fügen Sie 500 µL der CO_{2 -}TGF-β2/IL-34/Cholesterin enthaltenden Wachstumsmedium (TIC) equilibriert inkubieren Sie sanft zum Brunnen.
3. Wenn auf Deckgläsern, erste Mantel sterile Glasdeckgläser mit 10 µg/mL Trick-D-Lysin (PDL) in H₂O 1 h bei RT, Beschichtung mit H₂O 3 Mal waschen und trocknen in eine Haube unter UV-Licht. Sobald Deckgläsern trocken sind, fahren Sie mit vor Ort-Beschichtung auf den Deckgläsern, wie in Schritt 6.2 beschrieben.

(7) Überzug für RNS/Protein isoliert

1. Am Tag 1, Mantel, das gesamte Gebiet von einer 24-Well anionischen/kationischen Gewebekultur Platte mit Kollagen IV Beschichtung beschichtet und inkubieren Sie für 10 min - 1 h bei 37 ° C mit 10 % CO₂, dann entfernen und sofort Platte 3-5 x, equilibriert 10⁴ Zellen/Brunnen in CO₂ TIC-Medien.
2. Am 2. Tag führen Sie ein Medienwechsel von 50 % für jede gut am Tag nach der Zubereitung. Abgestorbenen Zellen neigen dazu, in der Mitte des Brunnens cluster, so nehmen Medien von dort.
3. Führen Sie eine 50 % Medienwechsel alle 2-3 Tage um die Kulturen zu erhalten. Wenn Medien Änderungen eine unerwünschte Variable für die Kulturen einführen, können Zellen für ca. 1 Woche ohne Medien Änderungen, im Gegensatz zu über 3 Wochen bei regelmäßiger Wartung überleben.

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultur hochreine verzweigt Mikroglia von jungen Ratten. Ähnliche Ergebnisse können mit unreifen, perinatale und Erwachsene Tiere, wie weiter unten besprochen. Da Zelle Isolationen oft beinhalten subtilen Nuancen und viele Möglichkeiten für Zellen sterben verwendet wir Qualitätskontrolle Kontrollpunkte um Erfolg in verschiedenen Schritten zu ermitteln. Wir überwacht in der Regel Zellsuspensionen mit einer Hemocytometer in mehreren Schritten in die Isolation-Protokoll (Abbildung 1A). Erfolgreiche Isolationen sollte 2,5-5 x 10⁵ Zellen/Juvenile Tiere ergeben. Tiere von P7 - P15 zeigen Erträge näher bis 5 x 10⁵ Zellen/Tier, während Zellen isoliert von Tieren, die älter als P30 Erträge näher auf 2,5 x 10⁵ Zellen/Tier zeigen. Über die Überwachung der gesamten Zelle hinaus zählt im gesamten Protokoll, ist es wichtig, den Gesamtzustand der isolierten Zellen bestimmen, die schwierig sein kann, weil Mikroglia isoliert auf diese Weise haben eine abgerundete oder bipolare Morphologie in den ersten Tagen in der Kultur . Hier haben wir Phasenbilder von P25 Mikroglia in Kultur während der ersten 6 Tage nach der Isolation in TIC sowie TIC mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS) (Abbildung 1 b) aufgenommen.

Abbildung 1: Bewertung der Zellgesundheit während des Protokolls isoliert und in 6 Tagen Kultur. (A) Phasenkontrast-Bilder zur Veranschaulichung Qualitätskontrolle Kontrollstellen in die dafür vorgesehenen Schritte des Verfahrens Zelle isoliert. Zelluläre Suspensionen wurden durch das Mischen von 9 µL der Zellsuspension mit 1 µL 0,4 % Trypan blau vor Verladung auf ein Hemocytometer abgebildet. Andere Bilder zeigen das panning Gericht selbst, und alle Bilder als ein Feld mit 20 X Vergrößerung angezeigt werden. Maßstabsleiste, 200 µm. MGM, Mikroglia Wachstumsmedium. (B) zeitlichen Verlauf der Mikroglia morphologische Veränderungen und Verbreitung über 6 Tage Kultur in serumfreien TIC Wachstum Mittel- oder TIC plus 10 % fetalen Kälberserum (FCS). CD11b-Immunopanned Zellen wurden vor Ort auf Kollagen-beschichtete anionischen/kationischen beschichtete Gewebekultur Platte vergoldet (siehe Tabelle der Materialien für Details), und das gleiche Feld wurde durch Phasenkontrast-alle 24 h. Skala bar, 100 µm. TIC, TGF-β2/IL-34 abgebildet / Cholesterin enthaltenden Wachstumsmedium. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Regelmäßige Bewertung der Gesundheit und Lebensfähigkeit der isolierten Zellen ist wichtig hinsichtlich Reproduzierbarkeit und der Erfolg der Experimente. Hier zeigen wir Mikroglia isoliert aus einem P21 Tier im MGM oder TIC TIC ergänzt mit 10 % FCS nach 7 Tagen in Vitro (DIV) mit einer Tragfähigkeit-Assay. Wenn die Isolierung erfolgreich war, zeigen Kulturen zwischen 80-90 % Lebensfähigkeit in TIC nach 7 DIV. Zellen kultiviert in Anwesenheit von Serum schließlich Anstieg um 100 % Lebensfähigkeit durch diese Maßnahme in der Nähe von, aber dies sowohl durch die rasante Verbreitung von künstlich aufgebläht ist Serum-exponierten Zellen und schnelle Phagozytose von abgestorbenen Zellen innerhalb dieser Kulturen (Abbildung 2A). Neben robusten überleben zeigen TIC kultivierten Zellen auch eine verzweigte Morphologie im Vergleich zu FCS Zellen (Abb. 2 b, C) behandelt.

Abbildung 2: Überleben der Mikroglia im MGM, TIC oder TIC + FCS an sieben Tagen in der Kultur. (A) Zellen wurden von P21 Ratten isoliert und kultiviert in Mikroglia Wachstumsmedium (MGM), TGF-β2/IL-34/Cholesterin enthaltenden Wachstumsmedium (TIC) oder TIC + 10 % fetalen Kälberserum (FCS). Zu jedem Zeitpunkt wurde Kulturmedium mit Calcein AM (1,33 µM Final) und Interkalation Homodimer (2,5 µM final) für 15 min auf lebende Zellen und abgestorbenen Zellen bzw. Beschriften ergänzt. Zellen wurden in jedem Feld mit einem automatisierten Skript ImageJ gezählt. (B und C) nach 7 DIV, mit unveränderten Medien Zellen gewachsen in TIC (B) oder TIC ergänzt mit 10 % FCS (C) waren voller Flecken, um lebende und tote Zellen wie oben beschrieben zu beschriften. Repräsentative Bilder wurden mit einem 10 X (links) oder 40 X (rechts) Ziel. Maßstabsleiste, repräsentieren 40 µm. Fehlerindikatoren Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Diese Zahl wurde von Bohlen Et Al. modifiziert. ⁹ und mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Nachweis der erfolgreichen Isolierung und Kultur von hochreinen Mikroglia wir Mikroglia von P21 Ratten isoliert und kultiviert diese Zellen in TIC oder TIC ergänzt mit 10 % FCS für 8 Tage. Zellen wurden dann fixiert und gefärbt mit Mikroglia Marker (Iba-1 und CD11b) und Verbreitung Marker (Ki67, Abb. 3A). Zusätzlich zu beflecken für Zelle Marker RNA-Seq auf frisch isolierte Zellen kann bietet eine leistungsstarke und sensible Tool zur Bewertung der RNA-Profil der Zellen und kann helfen, die Ausgangspunkt Reinheit der Kulturen zu informieren. CD11b Immunopanning führt in der Regel bei einem kleinen Prozentsatz von CD11b⁺ Neutrophilen/Monocyte Übertrag neben CD11b⁺ Mikroglia (Abb. 3 b). Diese Zellen werden in TIC nach ein paar Tagen sterben, aber können Analysen von früheren Zeitpunkten erschweren.

Abbildung 3: Reinheit des kultivierten Zellen als bewertet von Immunohistochemistry und RNA-f (A) Mikroglia wurden isoliert von P21 Ratten, vernickelt auf Glasdeckgläser PDL/Kollagen beschichtet und im TGF-β2/IL-34/Cholesterin enthaltenden Wachstumsmedium (TIC) für 8 Tage kultiviert. Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur fest und immun-gefärbt mit Iba-1 (1: 500), CD11b (1:1500) und Ki67 (1: 500). Kurz, feste Zellen wurden mit 0,1 % Waschmittel blockiert (Methoden Details siehe Tabelle) und 10 % normale Esel Serum (NGS) für 1 h bei Raumtemperatur. Zellen wurden dann mit Primärantikörper in 0,1 % Waschmittel mit 1 % inkubiert, die NGS bei 4 ° c über Nacht Zellen wurden drei Mal für 5 min in PBS gewaschen. Zellen wurden dann mit Sekundärantikörper inkubiert, alle 1: 500 in 0,1 % Waschmittel mit 1 % NGS für 1 h bei Raumtemperatur. Zellen waren wieder dreimal mit PBS-Puffer gewaschen und mit DAPI-haltigen Eindeckmedium montiert. Repräsentative Bilder wurden bei 40 X Vergrößerung. Skala bar, 50 µm. (B) Ausdruck der repräsentativen Zelltyp-spezifische Transkripte von frisch isoliert und kultivierten Zellen. Mikroglia wurden isoliert von P21 Ratten und lysiert direkt aus der Immunopanning Schale für die Isolierung von RNA und RNA-FF Marker für andere großen CNS Zelltypen (Astrozyten, Neuronen, Oligodendrozyten und Endothelzellen) zeigen nur minimale Verschmutzung der CD11b-Immunopanned Zellen. Neutrophilen-Marker sind in frisch isolierte Zellen (schwarz) erkannt, aber verlieren sich in serumfreien Kulturen (grau). Kultivierte Zellen ausdrücken hohes Maß an gemeinsamen Makrophagen Marker, aber Marker definieren die spezialisierten Mikroglia Signatur sind schnell herunterreguliert durch kultivierten Zellen. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Daten werden aus Bohlen Et Al. geändert. ⁹ und mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Färbung für Rentabilität und Zelle Marker ermöglicht die Bestimmung des Überlebens und Reinheit der Zellen, sondern bietet nur begrenzte Informationen über die Dynamik der Kultur. Hier haben wir einen Zeitraffer-Film von P21 Ratte Mikroglia nach 14 DIV in TIC zur Verfügung gestellt. Nach zwei Wochen serumfreien Kulturen zeigen dynamische Überwachung Verhalten, mit schnellen Prozess Erweiterungen und Einziehungen in die Schüssel (siehe Film 1). Darüber hinaus haben wir zuvor festgestellt, dass Serum Exposition verwandelt diese ruhenden Zustandeigenschaften der Mikroglia, was zu dauerhaften phagocytic und morphologische Veränderungen. Wir haben einen Film von Mikroglia kultivierten für 5 Tage im TIC enthalten, dann 10 % FCS ausgesetzt (siehe Movie 2).

Movie 1: definierte Medium Mikroglia Kulturen zeigen verzweigte Morphologie mit dynamischer Prozesse. Mikroglia wurden isoliert von P21 Ratte, vor Ort auf Kollagen-beschichtete anionischen/kationischen beschichtete Gewebekultur Teller vernickelt und für 14 Tage in TIC kultiviert. Bei 14 DIV sammelten Bilder alle 3 Minuten. Der Film spielt in 6 Bilder/s, und der Zeitstempel in der rechten unteren Ecke steht für die Dauer der Bildgebung in H:min. Film reproduziert nach Bohlen Et Al. ⁹ und mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Movie 2: Serum Belichtung löst eine schnelle morphologische Änderung definiert Medium Mikroglia Kulturen. Mikroglia wurden isoliert von P21 Ratte, vor Ort auf Kollagen-beschichtete anionischen/kationischen beschichtete Gewebe-Kultur-Platten beschichtet, und für 5 Tage im TIC kultiviert. 5 DIV Bilder gesammelt wurden alle 5 min. Baseline Motilität/Morphologie, dann bei 02:55 (2 h, 55 min aufgenommen wurde), ein 50 % Medienwechsel wurde durchgeführt, um eine Endkonzentration von 10 % FCS hinzufügen. Zellen wurden für weitere 7 h abgebildet. Der Film spielt auf 6 Bilder/s und der Zeitstempel in der rechten unteren Ecke steht für die Dauer der Bildgebung in H:min. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

Discussion

Da Mikroglia als Sentinel immunen Zellen des ZNS dienen, sind sie sehr ansprechend auf Veränderungen der Umwelt; Daher ist großer Sorgfalt erforderlich, um entzündliche Reaktionen in den Zellen während ihrer Isolation und Kultur⁸zu minimieren. Dies geschieht in diesem Protokoll durch Geschwindigkeit und Temperatur. Die Zellen auf Eis oder bei 4 ° C zu halten, wann immer möglich Aktivierung, reduziert so dass alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C erfolgen, die Tiere sind mit eiskalten Perfusion Puffer durchblutet, und das Protokoll wurde gestrafft, die Zeit zwischen Gewebe zu minimieren Extraktion und Kultivierung der Zellen. Wenn gen Expressionsmuster von frisch isolierte Zellen Beurteilung, ernten Sie Zelle Lysates direkt aus der CD11b Immunopanning Schale vor Trypsinization Isolierung-induzierte Veränderungen auf ein Minimum zu halten. Es sei darauf hingewiesen, dass auch sorgfältig isoliert Mikroglia ausführen eine entzündliche Reaktion sofort auf bei warmen Temperaturen, vermutlich aufgrund der Anerkennung der Schaden verbunden sind Signale, die untrennbar mit der Trennung verbundene gelegt. Wenn das Protokoll erfolgreich durchgeführt wurde, sind 2,5-5 x 10⁵ Zellen/Juvenile Ratte erwartet.

Die Zelle-Isolierung-Protokoll zur Verfügung gestellt, hier ist hochspezifisch für die Isolierung von CD11b +-Zellen aus dem perfundierten CNS-⁹. Obwohl diese Zellpopulation vorwiegend der Mikroglia besteht, enthält es auch geringe Mengen an anderen myeloischen Populationen z. B. perivaskuläre Makrophagen meningealen Makrophagen, choroid Plexus Makrophagen, Monozyten und Neutrophile¹⁰. Aderhaut-assoziierte myeloische Zellen können im Wesentlichen durch Erkennung und Entfernung von choroid Plexus vor Gewebe Dissoziation beseitigt werden. Hirnhaut können auch zu einem gewissen Grad entfernt werden, aber vollständige Beseitigung aller meningealen Gewebes ist nicht innerhalb des Zeitrahmens für schnelle Isolierung hier beschriebenen gezielt praktische. Daher, um Variabilität aufgrund unvollständiger Entfernung der Hirnhäute beschränken, entfernen wir kein Hirnhaut. Um die Anzahl der zirkulierenden Monozyten/Neutrophile im isolierten Material zu minimieren, ist es auch wichtig, eine saubere Perfusion zu haben, und wir entsorgen in der Regel Gewebe, das schlecht durchblutet ist. Sogar mit ausgezeichneten Perfusion ist Clearance von Blut nicht absolut, wie offensichtlich durch die Anwesenheit einer kleinen Menge der Erythrozyten in Zelle Pellets während der Reinigung werden. So kleine Ebenen von Monozyten und Neutrophile Co gereinigt und eine eindeutige Signatur in transkriptomischen Profile von frisch isolierte Zellen beitragen. Allerdings zirkulierenden Zellen sterben Sie schnell in serumfreien TIC Medien und vertreten Sie hartnäckige Verunreinigungen nicht, obwohl sie weiterhin überleben und vermehren sich im Serum mit Kulturen.

Ein weiterer wichtiger Punkt zur Erreichung einer gesunden, lebensfähigen Kultur ist während der mechanischen Dissoziation Schritte zu kümmern. Während Douncing viele Neuronen, Glia und andere tötet überleben ZNS-Zellen, Mikroglia diese Dissoziation relativ unversehrt (obwohl Mikroglia auch durch über-Douncing getötet werden kann). Wenn es richtig gemacht, dieses Protokoll führt Zelle Erträge vergleichbar mit denen, die mit proteolytischen Dissoziation, während potenziell verwirrende Variablen aus Gewebe entzündliche Reaktionen bei erhöhten Temperaturen vermieden werden. Ausführen in Folge unvollständige runden mechanischen Gewebe Dissoziation, können einzelne Zellen aus der Suspension bei gleichzeitiger Minimierung der Menge von mechanischem Stress auf die allgemeine Kultur geerntet werden.

Die hier beschriebene Immunopanning-Protokoll ist eine zuverlässige und reproduzierbare Möglichkeit, Mikroglia zu isolieren, aber andere vergleichbaren Methoden stehen zur Verfügung. Wir haben ähnliche Ergebnisse mit magnetischen Isolierung mit magnetisch aktivierte Zelle Sortierung Myelin Erschöpfung und CD11b Auswahl erhalten. Wir haben hier auf der Immunopanning-Methode konzentriert, denn es die qualitativ hochwertigsten Kulturen bis heute lieferte, weniger spezialisierten Ausrüstung erfordert und bedarf keiner Einführung von Eisenoxid-konjugierten Antikörpern in den Zellen unmittelbar vor der Kultur. Ein weiterer Ansatz häufig verwendet für die Mikroglia Isolierung ist Durchflusszytometrie, hat einen großen Vorteil gegenüber dem aktuellen Ansatz, dass Protokolle für die Reinigung der Bona Fide Mikroglia aus anderen CD11b + myeloischen Verunreinigungen mit Oberfläche gibt es Antikörper gegen Unterschrift Markierungen wie z. B. TEMEM119⁸. Obwohl Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung ergibt sich eine extrem reine Zellpopulation, Außerdem stellt zusätzliche Belastungen auf die Zellen und kann niedriger Rentabilität Kulturen oder Ertragseinbußen führen. Insgesamt konzentrieren wir uns auf Antikörper-basierten Methoden über markierungsfreie Dichte Zentrifugation und Shake-off Vorbereitungen, die Reproduzierbarkeit und die Reinheit der Zellpopulation zu maximieren.

Während dieses Protokoll für die Kultur der juvenilen Ratte Mikroglia optimiert ist, kann es zur Mikroglia aus verschiedenen Epochen Kultur; Zelle Summe Erträge sind maximal 1 - 2 Wochen alte Ratten, nachdem der Höhepunkt der Mikroglia Expansion überschritten hat und vor strukturellen Umlagerungen, die Gewinnung von Zellen aus älteren Gewebe beeinträchtigen. Mikroglia kann auch isoliert und kultiviert von Mäusen und menschlichen Gewebes durch den Austausch des CD11b Antikörpers mit einer geeigneten monoklonalen Antikörper spezifisch für Maus oder menschlichen Epitope. Während sowohl die Maus als auch die menschlichen Mikroglia unter diesen Kulturbedingungen überleben, zeigen sie morphologische Unterschiede im Vergleich zu Rattenzellen. Mauszellen behalten eine verzweigte Morphologie aber haben weniger Prozesse zu erarbeiten, während menschliche Zellen eine fast einheitliche amöboiden Morphologie haben als isoliert und nach diesem Verfahren kultiviert.

Isolierte Mikroglia kann auf verschiedene Arten je nach der Assays erforderlich beschichtet. Für ein optimales Ergebnis (wie abgebildet in die lebenden/Toten-Assays und morphologischen Filme hier gezeigt) wurden 3.5 x 10³ Zellen "vor Ort" plattiert in der Mitte des Brunnens einer 24-Well anionischen/kationischen beschichtete Gewebe-Kultur-Platte nach einer 10-min-Beschichtung von Kollagen IV als in dem oben genannten Protokoll beschrieben. Alternativ kann für Experimente, die eine große Anzahl von Zellen, wie z. B. RNA-Isolierung, 3-5 x 10⁴ Zellen pro Bohrloch einer 24-Well-Platte nach 10 min bis 1 h von Kollagen IV Beschichtung überzogen werden. Zellen bei höheren dichten zeigte etwas niedriger Rentabilität vernickelt und weniger komplexe Morphologie im Vergleich zu den Zellen, die wurden vor Ort behandelt, möglicherweise aufgrund der Auswirkungen von entzündlichen Signalen abgesondert in Reaktion auf die Isolierung. Für Immunohistochemistry oder Bildgebung erfordert Glasdeckgläser Zellen zeigen die besten überleben und Morphologie als Deckgläsern erste waren beschichtet mit PDL dann in Kollagen IV beschichtet, wie oben beschrieben. Für Assays erfordern eine große Anzahl von Bedingungen ist die Zellviabilität auch in 96-Well oder 384-Well Kollagen-beschichteten Platten hoch. Unter allen Bedingungen die Zellen beginnen rund- oder bipolar, beginnen, um Prozesse rund um Tag 3-4, zu erwerben und nehmen 5-10 Tage, die maximal verzweigte Morphologie, dargestellt in Abbildung 1 und Film 1auszustellen.

Während dieses Protokoll ergibt sich eine Kultur, die dynamische Überwachung Verhalten und Morphologie ähnlich ruht Mikroglia in Vivozeigt, nicht diese Zellen voll spezialisierte gen Ausdruck Signatur der Mikroglia in Vivozu behalten. Viele der persistenten gen beobachteten Veränderungen in kultivierten Zellen spiegeln Veränderungen in der Regel in der embryonalen oder entzündeten CNS⁹gesehen. So, dieses Protokoll stellt einen Fortschritt im Verständnis der Bedingungen Mikroglia erfordern, um in Kultur und Serum-evozierten Änderungen zu überleben, sondern weitere Studien sind erforderlich, um die extrinsische Signale zur Verfügung gestellt von der CNS zu verstehen, die Mikroglia optimieren Eigenschaften und gen-Ausdruck.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.