Summary
항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.
Abstract
곰 팡이 감염 마지막 십 년간에 중요 한 의료 상태 되 있지만 사용 가능한 항진균 약물의 수는 제한. 이 시나리오에서는 새로운 항진균 약물에 대 한 검색이 필요 합니다. 여기 보고 프로토콜 화면 펩 티 드 그들의 항진균 속성에 대 한 방법을 자세히 설명 합니다. 그것은 잠재적인 새로운 antifungals로 항균 성 펩 티 드의 연구에 맞게 수정 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침에서 국물 microdilution 자화 율 시험을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 항진균 성 화합물의 활동을 평가 하는 기능 분석 결과 설명 하 고 조사 분자의 특정 클래스에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 분석 실험 96 잘 접시 작은 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다, 이후 대규모 심사 자동화 환경에서 실시 하는 경우에 특히 시간, 짧은 시간에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 표준화 되 고 조정 가능한 임상 프로토콜 곰 팡이 질병의 치료를 개선 하기 위해 새로운 분자의 벤치 작업 추구를 도울 수 있는 방법를 보여 줍니다.
Introduction
곰 팡이 감염 되는 중요 한 의료 우려 최근 수십 년간, 상당히 immunocompromised 개인 등 암 치료 및 HIV/에이즈와 함께 사는 사람들의 숫자에 있는 상승 때문에 주로 증가 하는 데 또는 이식 장기1,2. 그러나, 매우 제한 된 배열 사용 가능한 항진균 약물의과 그들에 게 곰 팡이 저항에 대 한 보고서의 증가 조직의 사상 균 병3의 치료제에 관한 주요 문제에 기여.
새로운 항진균 성 화합물의 항균 성 펩 티 드 (암페어), 작은 양이온 펩 티 드 감염4그들의 타고 난 면역 반응의 일환으로 많은 유기 체에 의해 생산 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 심사 방법 곰 팡이 병원 균에 대 한 이러한 화합물을 테스트 하는 표준화 되지. 다른 절차 때때로 동일한 모델 미생물5,,67에 대 한 앰프의 항진균 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 차이 부족의 일부 프로토콜 세부 화합물 및 저해 재현성 사이 비교를 복잡 하 게.
새로운 약 후보자의 테스트를 표준화 하기 위한 한 가지 방법은 항진균 민감성은 임상 등 임상 설정에서 정의 하는 데 사용 하는 지침 및 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침입니다. 그러나, 이러한 antifungal 감도 테스트 너무 제한적 그리고 받지 않습니다 고려 대사에서 변화에 종에 걸쳐 그들은 단지 몇 가지 선택 에이전트에 대 한 설립 했다. 예를 들어 그들은 할 고려 하지 계정 비 발효 효 모에의 대사 요구.
이 프로토콜 잠재 항진균 성 화합물의 활동의 평가 허용 하 고 항진균 펩 티 드에 대 한 검색에 대 한 여기에 구현 됩니다. 그것은 국물 microdilution 새로운 화합물8,9의 심사를 최적화 하는 수정 CLSI M27-A3 지침에서 시험 기반으로 합니다. 이러한 변경 내용은 컨트롤로 참조 antifungals 사용 하 여 결과 표준화 하는 동안 최적의 사전 테스트 성장 위한 소량의 화합물, 온도 또는 초기 inoculum와 다른 미디어를 사용 하 여 허용 합니다. 다 잘 배양 배지를 사용 하 여이 방법을 신속 하 고 안정적으로 화면 화합물의 많은 수를 가능 하 게.
그것의 고유의 유연성으로 인해이 프로토콜 및 몇 가지 각 색으로 다른 미생물에 대 한 화합물의 다른 화학 클래스와 함께 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 솔루션 및 미디어
- 2 X 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), Sabouraud 포도 당 국물, 및 표 1에 의하여 Sabouraud 포도 당 한 천 준비.
2. 균 Inoculum 성장 조건
- 필요할 때까지-80 ° C에서 35% 글리세롤에 냉동된 주식으로 모든 곰 팡이 긴장을 저장 합니다.
- 각 실험 하기 전에 다음 단계를 수행 합니다.
- Candida albicans 종자에 대 한:
- 재고 유리병을 해 동 하 고 동요 (200 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 문화와 모자 살 균 50ml 폴 리 프로필 렌 튜브에 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 200 µ L를 전송. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 문화의 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오.
- 대 한 Cryptococcus neoformans 긴장:
- 재고 유리병의 얼어붙은 표면 다쳤어요. 플레이트 Sabouraud 포도 당 한 천 배지 위에 셀 및 48 h 30 ° c.에 대 한 품 어 고립 된 식민지의 성장을 볼 수, 후 최대 15 일 동안 파라핀 필름으로 밀봉 냉장고 (4 ° C)에 번호판을 유지.
- 메 마른이 쑤 시 게 또는 살 균 접종 루프를 사용 하 여 접시에서 중간 크기의 고립 된 식민지를 수집 하 고 살 균 50 mL 원뿔 튜브에서 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 접종. 동요 (200 rpm)에서 30 ° C에서 약 24 h에 대 한 품 어.
- 24 시간 보육을 초과 하지 마십시오. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오. 그것은 항상 좋은 항균 성 저항에 영향을 미치는 중요 한 요소 이므로 각 테스트 전에 세포의 성장 단계를 표준화.
참고: 두 균 급속 한 전파, 우리의 실험에서 30 ° C에서 성장 했다 하지만 온도 예 임상 치료 (37 ° C) 연구의 목적에 맞게 변경할 수 있습니다. 가장 중요 한 것은,이 초기 보육 시간 미리 각 균 분리 설립 한다 고 재현성을 보장 하기 위해 모든 테스트를 통해 유지.
- Candida albicans 종자에 대 한:
- 곰 팡이 성장 후 실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 원뿔 관 centrifuging 여 세포를 수집 합니다. 삭제는 상쾌한 고 PBS의 10 mL를 추가 합니다.
- 실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 세포와 원심 분리기 다시 resuspend.
- PBS 세척 및 원심 분리 두 번 더 반복 합니다. 3 세척 후 2 X RPMI-1640 매체의 (에 따라 펠 릿 크기) 5 mL에 셀 resuspend.
- Microcentrifuge 튜브 (에 따라 세포 현 탁 액의 탁도)에서 1: 100 또는 1:1,000 희석의 1 mL를 준비 합니다.
- 이 희석의 aliquot 10 µ L 그것 hemocytometer 챔버에 놓고 현미경은 4 개의 코너 사분면에 셀의 총 수를 계산 합니다. 농도 계산 하는 수식으로: (총 셀 수/4) x 희석 요인 x 104 (챔버 희석 상수).
- 가능성 조사 및 성장 조건을 체계적으로 공부 되 고 격리에 대 한 상관 되었다 있다 100% 생존 능력을 고려 합니다.
참고: 표준화 및 품질 관리의 생존 할 수 효 모10에 대 한 항균 성 자화 율 테스트 (EUCAST) 항진균 최소 억제 농도 (MIC) 방법에 유럽 위원회에 따라에서 다시 도금 . - 성장/생존 상관 관계 연구 분리에 대 한 설립 되지 않았습니다, phloxine B11, trypan 블루 등 죽은 세포를 선택적으로 색상 염료의 도움으로 hemocytometer 라이브 셀을 계산 하 여 곰 팡이 생존 능력을 측정 12, 야누스 그린13또는. 이 프로토콜에 대 한 곰 팡이 세포를 사용 하 여 경우에이 시점에서 인구의 생존 능력은 90% 이상.
참고: 죽은 살아 있는 염료 선택의 균 류와 함께 잘 작동 하지 않을 수 있습니다. 제발 그들을 사용 하기 전에 테스트 합니다. 예를 들어 trypan blue 염료 C. neoformans와 함께 잘 작동 하지 않습니다.
- 가능성 조사 및 성장 조건을 체계적으로 공부 되 고 격리에 대 한 상관 되었다 있다 100% 생존 능력을 고려 합니다.
- 그 후, 2 X RPMI-1640 중간에 셀 정지 준비 (2 X 조정 inoculum RPMI 1640 매체에서). 96 잘 접시 각 접시 5 mL의 볼륨을 고려 하십시오.
- 모든 C. albicans 변종에 대 한 4 x 103 셀/mL의 재고 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 이 농도 각 음 (2 x 103 셀/mL)에서 최종 셀 농도의 2 배입니다.
- C. neoformans 변종에 대 한 셀 2 × 104 셀/mL의 사진 문화를 준비 합니다. 이 농도 각 잘 (1 x 104 셀/mL)에서 최종 셀 농도 두 번.
- 다른 버섯에 대 한 어떤 농도 부 화 시간에 관하여 특정 연구에 대 한 이상적인 것 알려진된 항진균 테스트. 곰 팡이의 물질 대사 및 복제 시간 고려해 서.
3입니다. 펩 티 드 (알 수 없는 에이전트)
- -20 ° C에서 동결 건조 된 펩 티 드를 저장 하 고 각 실험 전에 이온된 수에 그들을 분해. 최대 저장 시간 한 번 물속에에서 녹아 있는 각 펩 티 드의 성격에 따라 달라 집니다.
- 두 번 분석 결과 (2 배)에 테스트 높은 최종 농도의 aliquots을 준비 합니다. 이상적으로, freeze-thaw 주기를 피하기 위해 사용 하는 한 시간에 대 한 충분 한 펩 티 드와 aliquots의 작은 수를 준비 합니다.
참고: 농도 문학 및 펩 티 드의 속성에 근거 한다. 직렬 희석, 펩 티 드의 약 100 µ M와 함께 시작 하 고 다음 줄이거나 얻은 결과 따라이 농도 범위를 증가 하는 것이 좋습니다.
4. 참조 Antifungals (긍정적인 컨트롤)
- 그 물에 희석: 분석의 높은 농도의 2 배 솔루션 준비 (섹션 5 참조: 희석 단계에 대 한 항진균 분석 결과).
- C. albicans 변종에 대 한 fluconazole의 128 µ g/mL 또는 caspofungin의 128 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 모두 접시 농도 64 µ g/mL를 될 것입니다.
- C. neoformans 변종에 대 한 암포 B (수용 성 솔루션)의 32 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 플레이트 농도 16 µ g/mL를 될 것입니다.
참고: 일반적으로 암포 B는 희석 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 이후이 항진균 저조한 물에 용 해. 그러나, 상업적으로 이용 가능한 수용 성 암포 B 준비 있습니다.
- Antifungals 유기 용 매에 희석에 대 한: DMSO, 재고 솔루션 X 100을 준비 다음에 사용 하기 위해 물에 10 배 희석.
참고: 이렇게, 잘, DMSO의 최종 농도 초과 하지 않습니다 1%. 곰 팡이 컨트롤은 필요한 일부 버섯 용납 하지 않습니다 잘 솔벤트의이 농도 1 %DMSO 포함 하는 미디어에서 성장할 것입니다 우물. DMSO는 감광, 그래서 호 일 접시 커버 또는 잠복기 동안 어두운 챔버에 배치.
5. 항진균 분석 결과
참고: 항진균 분석 실험 체 외에 는 국물 microdilution 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침 일부 수정에서 시험에 따라 수행 됩니다.
- 각 펩 티 드의 두 배 직렬 희석을 준비 하 고 항진균 50 µ L의 최종 볼륨을 96 잘 폴리스 티 렌 microplates에서 제어.
- 100 µ L의 최고 2 배 농도에서 항진균/펩 티 드의 원하는 열에 최종 농도 1-3, 시내 행 대답 하는 것을 추가 피 펫을 사용 하 여
- H. B 행에, 다른 우물으로 살 균 물의 50 µ L을 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여,
- 최고 농도 (A 행)와 우물의 50 µ L을 제거 하 고 농도 (B 행)의 다음에 전송 균질.
- 최저 농도와 잘 때까지 위의 단계를 반복 하 고이 잘 (행 H) 50 µ L를 삭제. 빈 컨트롤 또는 네거티브/성장 제어에 대 한만 물에 두고 열 11 및 12 (행 A, B, C).
- 추가할 조정된 inoculum X 2의 50 µ L RPMI 1640 매체에 각 음 (열 1-3 플러스 열 11 (네거티브/성장 제어)); C. albicans 에 대 한 최종 농도 2 x 103 셀/mL, 그리고 최종 농도 C. neoformans 변종 104 셀/mL에 될 것입니다 될 것입니다.
- 빈 컨트롤을 준비 (50 µ L 물 + 50 µ L 2 셀 없이 X RPMI-1640 매체) 및 부정/성장 제어 (50 µ L 물 + 항진균 없이 50 µ L 조정 inoculum 2 X RPMI-1640 매체), 그리고 위의 설명 대로 잘 플레이트에 부하.
- 테스트할 각 화합물에 대 한 절차 및 선택한 항진균 제어 (열 4-10)를 반복 합니다.
참고: 직렬 희석 할 수 있습니다 세로로 또는 가로로 (즉, 테스트 하는 주어진된 화합물/추출의 희석 수는 8 개 이상의 경우) 접시에 아래, 실험으로.- 화합물, 참조 하는 경우 약물, 또는 그 구성 요소 중 하나는 감광, 감소 빛에 분석 결과 수행, 호, 플레이트 커버 또는 외피 동안 어두운 챔버에 배치.
- 다음 옵션 권장 사항을 고려 하십시오.
- 로이 증발 감소 가스 교환을 허용 하는 명확한 커버 플레이트 플레이트를 봉인.
- 습 한 챔버;에 접시를 놓으십시오 그것은 또한 증발 줄일 것 이다.
- C. neoformans를 흔들어 200 rpm으로 24 시간 또는 48 h 모든 C. albicans 긴장, 및 48 h 37 ° C에서 번호판을 품 어. 낮은 최종 볼륨 (100 µ L) 아무 일 좀 발생 하는 것을 보장 합니다.
참고: 24 시간에 마이크 읽기와 C. albicans 긴장에 대 한 48 h 사이 상당한 차이가 관찰 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 48 h 수치는 시각화 하기 쉽습니다. - 형태 또한 오염의 흔적을 확인으로 변경 사항을 확인 하려면 잠복기 전후 반전된 광학 현미경의 도움으로 모든 우물을 관찰 합니다.
참고: 읽기 시각적으로 수행 및 실험의 끝에 촬영 될 수 있습니다. 각 읽기 전에 접시 약간 균질. 600의 OD를 측정 하 여 읽기를 수행할 수 있습니다, 셀 묶습니다 경우 또는 filamentation 하지 관찰 된다. - 별도 날짜에 세 번 이상 실험을 수행 합니다.
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Representative Results
마이크는 완전히 잠복기의 끝에 보이는 곰 팡이 성장을 억제 하는 최저 항균 화합물 농도로 정의 됩니다. 반면 탁도 부정/성장 제어 웰 스에 유사한 어떤 잘 분명 미디어 빈 우물에 유사한 어떤 잘 긍정적인 결과 여겨진다이 프로토콜의 목적은 화면 잠재적인 antifungals 빠른 방법 이므로, 부정적인 것으로 간주. 그러나, 주어진된 앰프 fungistatic 또는 살 진 균 인지 알고에 관심이 있는 경우에, 긍정적인 우물에서 미디어 또한 수 Sabouraud 포도 당 한 천에 도금 하거나 또 다른 생존 능력 테스트로 확인.
주어진 소설 화합물의 행동의 메커니즘은 알려진, 그것 따라서 필수적입니다 경우 참조 항진균 이루어졌고 예상된 범위는 곰 팡이 분리 (확인 공식 지침, 테이블, 또는 문학에서 데이터)을 검사 하기 전에 대 한 확인 하는 (이 경우, 앰프;에 화합물에 대 한 테스트 마이크 그림 1 과 그림 2) 이상적인 조건이 되는지 확인 하. 존경 받는 범위에 속하지 않는 경우에 변경 관찰 시험된 화합물을 전적으로 인해 인지 확인할 수 있을 것입니다 때문에 실험을 다시 실행 해야 합니다. 그것은 이전과 변화 형태 및 오염에 대 한 확인을 잠복기 후 모든 우물을 광학 현미경 관찰을 동등 하 게 중요 한.
그림 1입니다. Cryptococcus neoformans국물 microdilution 분석 결과 사용 하 여에 대 한 3 개의 펩 티 드에 대 한 항진균 성 활동의 평가. 균 농도 1 x 104 셀/mL 이다. 3 펩 티 드 테스트 (AMP1, 열 1-3; AMP2, 열 5-7; AMP3, 열 8 ~ 10) 0.78 µ m (행 H) 100 µ M (A 행)에서 배열 하는 농도 함께. 성장 제어 및 빈 열 11 및 12에에서 각각 있다. 이미지는 외피의 48 h 후 디지털 카메라와 함께 인수 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Candida albicans 국물 microdilution 분석 결과 사용 하 여에 대 한 3 개의 펩 티 드에 대 한 항진균 성 활동의 평가. 곰 팡이 농도 2 x 103 셀/mL에. 3 펩 티 드 테스트 (AMP1, 열 1-3; AMP2, 열 4-6; AMP3, 열 7 ~ 9) 0.78 µ m (행 H) 100 µ M (A 행)에서 배열 하는 농도 함께. 성장 제어 및 빈 고의 분석 결과에 포함 된 하지만 사진에 표시 되지 않습니다. 이미지는 외피의 48 h 후 디지털 카메라와 함께 인수 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 1 과 그림 2에서 관찰, 48 h C. neoformans , C. albicans에 대 한 긍정적이 고 부정적인 우물을 시각적으로 구별을 충분 한 시간 이다. 그것은 C. neoformans 에 대 한 결과 24 시간 가져온 수정 없이 CSLI 지침에 따라 이전 보다. 각 3 중, 긍정적이 고 부정적인 잘, 그리고 따라서 각 화합물에 대 한 마이크에 대 한 쉽게 인지할 수 있습니다. 선택 어떤 분자 장점 추가 조사에 관해서는 뿐만 아니라 여러 화합물에 대 한 빠른 마이크 결정 수 있습니다. 한편, 그림 3 예 부적 절 한 pipetting 희석 단계에서 가능성이 가난한 결과입니다. 이 열 5 행 C, C. neoformans 성장에 차이 복제 (열 5-7)에 걸쳐 현재에 관찰할 수 있습니다.
그림 3입니다. 직렬 희석 분석 결과에서 복제 기술에 오류의 예. 이미지는 0.78 µ m (행 H) 100 µ M (A 행)에서 배열 하는 앰프의 직렬 희석을 보여줍니다. C. neoformans 성장에 차이 열에 복제 사이 희석 준비 중 pipetting 오류로 인해 대부분 5-7, 행 C. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
플레이트의 해석에 관해서는 그림 1 에 C. neoformans, 100 μ에서 다양 한 농도와 AMP3 AMP1 열 1-3, 5-7 AMP2에 대 한 열 및 열 8-10에 위치에 대 한 3 개의 다른 앰프에 대 한 항진균 분석 결과 0.78 µ (행 H) m M (A 행). 빈 컨트롤 행 A c 12, 열에 배치 하는 동안 부정/성장 제어 열 11, 행 A, C에 배치 했다 AMP1 (열 1-3, 행 A-C) 및 AMP2 (열 5-7, 행 A D), 높은 농도에 언론은 반투명 하 고 거기 아무 표시 성장 이다. 대조적으로, 낮은 농도에서 우물은 불투명 (열 1-3, 행 열 및 D-H 5-7, 행 E-H). 따라서 행 C 각각 행 D, 즉, 25 µ M 및 12.5 µ M에에서 AMP2에 대 한 마이크는 마이크 AMP1, 포함 여겨진다. AMP3 곰 팡이 테스트는 모든 농도에서 성장 하는 때 다시 평가할 수 있을 것 이다. AMP3에 대 한 재검토 테스트 중간 화합물, 미생물 오염, 항진균 성 활동 방해 또는 에이전트에 곰 팡이의 높은 저항 테스트 될 수 있습니다 원인을 확인할 필요가 있다. 마지막 가능성에 대 한 테스트 농도 범위를 증가 해야 할 것입니다. 그래서 그들은 또한 600 외경 측정에 의해 사정 될 수 없음-억제 및 제어 우물이 균질, 관찰, nm.
그림 2에 관해서는 세 가지 펩 티 드 C. albicans에 대 한 테스트 되었습니다. AMP1 위한 마이크 (열 1-3), AMP2 (열 4-6), 그리고 AMP3 (열 7-9) 6 µ M, 50 µ M, 25 µ M, 각각 있었다. C. albicans, 외피 온도에 filamentation 때문에 관찰할 수 있습니다 아니 저해 및 제어 웰 스, 수 풀에서 독서에 대 한 외경 측정을 사용 하 고 어려운.
때로는, 아니 성장 우물에서 관찰 됩니다. 이 미디어 (이 경우 성장 컨트롤 또한 표시 없는 성장) 또는 에이전트에 높은 자화 율 독 소 오염 때문일 수 있습니다 (어떤 경우에, 성장 컨트롤 표시 성장). 따라서, 후자의 경우에 대 한 농도 범위에서 감소 할 수도 있습니다.
| 매체 | 준비 | |
| 2 X 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 -500 mL | 10.4 g RPMI-1640 (L-글루타민 및 페 놀 레드, 중 탄산염 없이 보충) | |
| 330 m m 3-(N-morpholino) 프로 판 술 폰 산 (MOPS) | ||
| PH 7.0으로에 조정 NaOH | ||
| 여과 (0.22 μ M 필터)에 의해 소독 | ||
| 인산 염 (PBS)를 버퍼링 | 137 mM NaCl | |
| 2.7 m m KCl | ||
| 10 m m 나2HPO4 | ||
| 2mm KH2포4 | ||
| 15 분 동안 121 ° C에 고압입니다. | ||
| Sabouraud 포도 당 국물 | 500 mL의 증류수에 가루 15 g. | |
| NaOH로 pH 7.0에 조정 | ||
| 15 분 동안 121 ° C에 고압입니다. | ||
| 우선 당 Sabouraud Agar | 500 mL의 증류수에 파우더의 32.5 g. | |
| NaOH로 pH 7.0에 조정 | ||
| 15 분 동안 121 ° C에 고압입니다. | ||
표 1입니다. 미디어와 시 약 준비입니다.
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Discussion
Microdilution 테스트는 화합물, 화합물의 소량을 사용 하 여 대상의 잠재적인 항진균 성 활동을 분석 하 고 동시에 농도의 범위에서 테스트 수 있습니다. 이 따라,이 프로토콜은 잠재적인 새로운 항진균 성 화합물에 대 한 심사의 첫 번째 단계도 권장 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 처음 클리닉, 항진균 치료의 선택에 도움을 설계 되었습니다 M27-A3 프로토콜에 기반은 그리고 새로운 항진균 성 화합물의 다양 한 적응 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜은 추출 물 또는 화합물의 물리 화학적 기능에 집중할 수 있습니다. 예를 들어 분석 결과에서 잠재적인 후보 나타날 수 있습니다 잘못 효과 미디어에서 화합물 Histatin 514RPMI의 효과 같은 곰 팡이 세포와의 상호 작용을 차단할 수 있습니다. 이 경우에 RPMI 방해 하는 경우에 대 한 대체 매체 MOPS pH 715효 질소 기지 (YNB) 버퍼입니다.
프로토콜 또한으로 참조 항진균 결과 지침 범위 내에서 사전 성장 조건, inoculum 농도, 부 화 온도 및 빛에 민감한 구성 요소에 대 한 수정 수 있습니다. 참조 항진균 테스트 균 종에 대 한 현재 치료를 기반으로 해야 합니다. 또한, 경우에 대 한 참조 복합 비슷합니다 실제로 잠재적인 약물- 예를 들어, 테스트 곰 팡이 모델에 대 한 항진균 성 활동으로 알려진된 항균 성 펩 티 드-추가 참조 제어로 사용 해야 합니다.
사전 성장 조건은 요구 하는 곰 팡이 맞게 변경할 수 있습니다. 프로토콜에서C. neoformans , C. albicans 더 전파 30 ° C에서 성장 했다. 그럼에도 불구 하 고,이 온도 곰 팡이 대사에 따라 변경 될 수 있습니다: 예를 들어 Paracoccidioides brasiliensis 37 ° c의 효 모 형태를 유지 하기 위해 성장 필요 및 그것의 느린 복제 속도 때문에 5-7 일 동안 성장 될 필요가. 따라서, 잠재적인 새로운 약물 테스트에 대 한 곰 팡이 특성을 이해 하는 것이 필수적입니다. 또한, 나이 및 사용 하는 셀의 성장의 단계는 각 연구의 목적에 따라 정의 해야 하 고, 초기 보육 시간 해야 미리 설정 및 재현성을 보장 하기 위해 모든 테스트 내내 유지 하는 가장 중요 한 것은, .
마찬가지로, 화합물/추출, 참조 항진균 또는 희석제는 빛에 민감한, 단계 추가 되어야 합니다 작업 감소 된 빛을, 호 일, 접시를 덮고 판 동안 어두운 챔버에 배치 등의 저하를 방지 하기 위해 부 화 번입니다.
또한, 가장자리 효과 및 증발 수 줄어들 빈 우물에 물 추가 하지 사용 하 여 외부 우물 그들을 작성 하는 물, 또는 습 한 챔버에 접시를 배치 하 여.
주요 제한 경우이 메서드를 사용 하 여 살 균 제의 또는 fungistatic 효과 사이 구별에 반대 시험된 화합물의 억제 활동에 그것의 초점 중 하나입니다. 그럼에도 불구 하 고, 목표는 잠재적인 새로운 항진균의 빠른 심사 초기 시각적 평가 마이크 분명 긍정적인 (' 클리어/비-탁 ' 웰 스)와 네거티브 ('탁' 웰 스) 결과, 식별할 수 연구 관심사의 화합물 또한, 그리고 따라서 새로운 화합물에 대 한 심사의 전반적인 비용을 감소.
이 새로운 화합물의 행동의 메커니즘 있기 때문에 알 수 없는, 화합물의 능력을 억제 하거나 긍정적인 우물을 도금 또는 라이브/죽은 염료를 사용 하 여 하 여 몇 가지 추가 단계를 추가 하 여 곰 팡이 세포를 죽 일 결정 하이 같은 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 다른 작은 수정 프로토콜을 사용 하는 바둑판 적정 분석 결과 대 한 다른 약물과 화합물의 어떤 시너지 효과 식별 하기 위해 추가할 수 있습니다.
분석 결과 독서는 일반적으로 아무 antifungal 에이전트 (네거티브/성장 제어)에 잘 성장에 비해 다른 조건 하에서 곰 팡이 성장의 시각적 분석에 의해 수행 됩니다, 하지만 그것은 또한 행 해질 수 있다 600의 OD를 측정 하 여 nm. 그러나, OD 측정은 균질 성 솔루션에 대 한 정확한, 일부 곰 팡이 예를 들어, Candida 종 인큐베이션 기간 동안 filamentation 결과적으로 따라서 방법-의 정밀도 깨고 수 풀에서 성장.
다른 한편으로, 여기, CLSI M27-A3 지침과 비교 하 여 설명 하는 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 같은 비 발효 균에 대 한 미디어의 폭 기 계정에 걸립니다 C. neoformans. 또한, CLSI 지침만 따라서 버섯 모양 성장 및 마이크 정의 외피의 장기간을 필요로 작은 초기 inoculum을 사용 합니다. 일부 연구는 높은 이니셜 inoculums 고 부 화 하는 동안 접시를 떨고 마이크 결정16,17에 중요 한 영향 없이 항진균 민감성 테스트 개선 증명 하고있다. 우리의 프로토콜 정확 하 게, 72 h CLSI 지침에 의해 제안에 비해 48 h 이내 단축된 잠복기에 C. neoformans 에 대 한 새로운 화합물에 대 한 마이크를 확인할 수 있습니다.
또 다른 장점은 우리의 프로토콜 따라서 항진균 시험에 필요한 테스트 새로운 화합물의 양을 줄이는 CLSI 지침에서 권장 하는 200 µ L 대신 100 µ L 최종 볼륨을 사용. 그러나, 외부 우물의 증발 문제가 있을 수 있습니다 시험 결과 없이 이미 증발을 줄이기 위해이 섹션에서 설명 하는 솔루션을 사용할 수 있습니다.
또한,는 희석 접시를 직접 수행 하 고 따라서 우회 CLSI 희석 지침 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여, 멀티 채널 펫 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CLSI 지침에 것 보다 덜 복잡 한 조립과 또한 적은 재료를 사용 하 여.
곰 팡이 세포 준비에 관련 된 중요 한 단계는 최대한 신선한 셀의 사용 이다. 그것은 또한 있기 때문에 여러 보고서 항진균 민감성의 차이 대 한 문학 문화18,19세 때 같은 성장 단계에서 셀으로 모든 분석 실험을 수행 하는 중요 한. 참조 긴장의 신중한 선택도 필수적 이다. 매우 중요 하거나 거의 고립 된 종 항진균 잠재력의 분명 한 그림을 생성 하지 않을 수 있습니다. 마찬가지로, 분석 결과를 많은 변수를 추가 하지로 자란 하위 단계를 피하기 위해 도움이 됩니다. 예: 칸디 다 긴장 (는 빠르게 성장), 우리는 inoculum 액체 미디어에 직접 제작 하 여 한 천 격판덮개 단계를 우회 하는 것을 선호.
테스트를 물리 화학적 특징 추출 물 또는 화합물은 고려해 야 할 중요 한 기억. 예를 들어 추출 물 또는 화합물, 물 이외의 용 매에 용 해 될 필요가 적절 한 버섯 모양 성장을 제어를가지고 있는지 확인 해야 합니다 경우는 혼자 균 류와 같은 용 매 농도 포함 됩니다. 이것은 관찰 하는 어떤 성장을 저해 하지 테스트 화합물 대신 용 매로 인해 보장 또는 추출입니다. 녹이는 용 매에서의 비율을 줄일 높은 시험된 농도 보다 적어도 100 배 높은 농도에서 마약 같은 DMSO 희석 항진균 약물 CLSI M27A3 권장 사항에 따라이 좋을 수 있습니다이 경우에 플레이트입니다.
안정성에 대해서 분석된 추출 물 또는 화합물의 작은 aliquots를 유지 하는 것이 좋습니다. 적절 한 온도 약 수의 과도 한 조작에는 단일 시험 하 고, 동결-해 동 주기를 피할 수 있습니다 추출 물 또는 화합물 냉동 저장 됩니다, 경우 필요한 볼륨을 저장 하 여.
마지막으로, 가장 기본적인 단계 중 하나는 미 판 직렬 희석의 정확도 주어 집니다 pipetting 오류가 연속 희석 따라 전파 됩니다. 이제부터, 피 펫 정밀도 적절 한 pipetting 기술을 재현성 보장 답해야 합니다. 그래서, 그것은 필수적 보정 사용 펫을 항상 체크 볼륨 추가 하 고 각 우물에서 제거 하는 경우 올바른입니다. 찌 꺼 기 또는 약물에서 흔적 피 펫 팁에 남아 있지 않는다 다는 것을 확인 하십시오. 화합물 팁에 충실 하는 경향이, 그것은 전환 팁은 희석 사이 좋을 수도 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 망 토-브라질, CNPq-브라질, FAP/DF 재정 지원에 대 한 감사합니다. 우리는 수정 원고에 대 한 박사 휴고 코스타 Paes에 감사입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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