Summary
En lättarbetad och anpassningsbar buljong microdilution metod för screening svampdödande föreningar och extrakt.
Abstract
Svampinfektioner har blivit ett viktigt medicinskt tillstånd i de sista årtiondena, men antalet tillgängliga svampdödande läkemedel är begränsad. I det här fallet är sökandet efter nya svampdödande läkemedel nödvändigt. Det protokoll som redovisas här Detaljer en metod till skärmen peptider för sina svampdödande egenskaper. Den är baserad på buljong microdilution känslighet test från klinisk och Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 riktlinjerna med ändringar att passa forskningen av antimikrobiella peptider som potentiella nya antimykotika. Detta protokoll beskriver en funktionell analys för att utvärdera aktiviteten av svampdödande föreningar och kan enkelt ändras för att passa en viss klass av molekyler under utredning. Eftersom analyserna utförs i 96 brunnar med små volymer, kan en storskalig undersökning utföras i en kort tid, särskilt om utförs i automation miljö. Denna procedur illustrerar hur ett standardiserat och justerbar kliniska protokoll kan hjälpa bänk-arbete strävan efter nya molekyler att förbättra terapin av svampsjukdomar.
Introduction
Svampinfektioner har blivit en viktig medicinsk angelägenhet under de senaste decennierna har avsevärt ökat främst på grund av en ökning av antalet immunförsvagade individer såsom dem som genomgår cancerbehandling och de som lever med HIV/AIDS eller transplanterade organ1,2. Dock bidra ett mycket begränsat utbud av tillgängliga svampdödande läkemedel och det ökande antalet rapporter om svamp resistens mot dem till de stora problemen när det gäller therapeutics systemiska mykoser3.
En potentiell källa till nya svampdödande föreningar är antimikrobiella peptider (ampere), små katjoniska peptider produceras av många olika organismer som en del av sin medfödda immunsvaret mot infektion4. Trots är screeningmetoden att testa dessa föreningar mot svamp patogener inte standardiserat. Olika förfaranden har använts för att bedöma ampere, antifungal aktivitet ibland för samma modell mikroorganism5,6,7. Dessa skillnader och avsaknaden av detalj i vissa protokoll försvåra jämförelser mellan föreningar och hämmar reproducerbarhet.
Ett sätt att standardisera testning av nya läkemedelskandidater är att följa riktlinjerna används för att definiera svampdödande känslighet i kliniska inställningar, till exempel klinisk och Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Men dessa svampdödande känslighet tester är alltför restriktiv och tar inte hänsyn till övervägande variationen i metabolism mellan arter, som de inrättades endast för ett fåtal utvalda agenter. De tar exempelvis inte hänsyn de metabola behoven av icke-fermenterande jäst.
Detta protokoll kan bedömningen av aktiviteten av blivande svampdödande föreningar, och genomförs här för sökandet efter svampdödande peptider. Den är baserad på buljong microdilution känslighet test från CLSI M27-A3 riktlinjerna med modifikationer som optimerar screening av nya föreningar8,9. Dessa ändringar tillåter användning av små mängder av förening, variationer i temperatur eller inledande inokulum och olika media för optimal pre-test tillväxt, medan standardisera resultaten med användning av referens antimykotika som kontroller. Denna metod, med användning av flera väl kultur plattor, gör det möjligt att snabbt och tillförlitligt screena ett stort antal föreningar.
På grund av dess inneboende flexibilitet, kan detta protokoll användas med olika kemiska klasser av föreningar och mot andra mikroorganismer, med några anpassningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lösningar och Media
- Förbered 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), Sabouraud dextros buljong och Sabouraud dextros agar enligt tabell 1.
2. svamp inokulum tillväxt villkorar
- Lagra alla svamp stammar som fryst lager i 35% glycerol vid-80 ° C, tills det behövs.
- Utför följande steg innan varje experiment.
- Candida albicans stammar:
- Tina ett lager injektionsflaska och överföra 200 µL 10 ml av Sabouraud dextros buljongen i en steril 50 mL polypropylen tub med en mössa och kultur övernattning på 30 ° C med agitation (200 rpm). Kom ihåg att lutning röret och lämna den gemensamma jordbrukspolitiken något öppen för bättre luftning av kulturen.
- Cryptococcus neoformans stammar:
- Skrapa den frysta ytan av ett lager injektionsflaska. Platta celler på Sabouraud dextros agarplattor och inkubera i 48 h vid 30 ° C. Efter synliga tillväxten av isolerade kolonier, hålla plattorna i kylskåp (4 ° C) förseglade med paraffin filma i upp till 15 dagar.
- Samla en medelstora isolerad koloni från plattan med hjälp av en steril tandpetare eller steril ympning slinga och Inokulera 10 mL Sabouraud dextros buljongen i en steril 50 mL koniska tub. Inkubera i cirka 24 timmar vid 30 ° C under agitation (200 rpm).
- Överskrid inte 24 h ruvning. Kom ihåg att lutning röret och lämna den gemensamma jordbrukspolitiken något öppen för bättre luftning. Det är alltid bra att standardisera tillväxtfas av cellerna före varje prov, eftersom detta är en viktig faktor som påverkar antimikrobiell resistens.
Obs: Båda svampar odlades vid 30 ° C för snabb förökning i våra experiment, men temperaturen kan ändras för att återspegla målen för studien, till exempel kliniska behandling (37 ° C). Viktigast av allt, bör denna första inkubationstiden fastställas i förväg för varje svamp isolatet och objektivtypen alla tester att säkerställa reproducerbarhet.
- Candida albicans stammar:
- Efter svamp tillväxt, samla cellerna genom centrifugering koniska rören på 1,200 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och tillsätt 10 mL PBS.
- Återsuspendera cellerna och centrifugera igen på 1,200 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Upprepa den PBS-tvätten och centrifugering dubbelt mer. Efter den tredje tvätten, resuspendera cellerna i 5 mL (enligt pelleten storleken) 2 X RPMI-1640 medium.
- Laga 1 mL av en 1: 100 eller 1:1,000 i en mikrocentrifug rör (beroende på turbiditeten av cellsuspensionen).
- Alikvotens 10 µL denna utspädning, placera den i en hemocytometer kammare och räkna det totala antalet celler i fyra hörn kvadranterna under mikroskopet. Beräkna koncentrationen av formeln: (totalt cell nummer/4) x utspädning faktor x 104 (kammaren utspädning konstant).
- Överväga en 100% lönsamhet om livskraft grevar och tillväxt villkor har korrelerats systematiskt för isolatet studeras.
Obs: Den standardisering och kvalitetskontroll av livskraft räknas kan göras genom rygg-plätering i enlighet med Europeiska kommittén för antimikrobiell känslighet Testing (EUCAST) svampdödande minsta hämmande koncentration (MIC) metod för jäst10 . - Om tillväxt/livskraft sambandet inte har fastställts för isolatet under studien, mäta svamp livskraft genom att räkna levande celler i en hemocytometer med hjälp av färgämnen som selektivt färg döda celler, såsom phloxine B11, trypan blå 12, eller Janus grön13. Använd svamp cellerna för detta protokoll endast om livskraften hos befolkningen vid denna punkt är 90% eller högre.
Obs: Döda/levande färgämnen fungerar inte bra med svampen val. Vänligen testa dem före användning. Exempelvis fungerar trypan blå färgämnet inte bra med C. neoformans.
- Överväga en 100% lönsamhet om livskraft grevar och tillväxt villkor har korrelerats systematiskt för isolatet studeras.
- Efter det, förbereda cellsuspensioner i 2 X RPMI-1640 medium (2 X justerat inokulum i RPMI-1640 medium). För plattor med 96 brunnar överväga en volym på 5 mL för varje platta.
- För alla C. albicans stammar, förbereda en lager cellsuspension på 4 x 103 celler/mL. Denna koncentration är 2 X sista cell koncentration i varje brunn (2 x 103 celler/mL).
- För C. neoformans stammar, förbereda en lager kultur av celler 2 x 104 celler/mL. Denna koncentration är två gånger sista cell koncentration i varje brunn (1 x 104 celler/mL).
- Andra svampar, testa med en känd antimykotisk som koncentrationen kommer vara perfekt för den särskilda studien i förhållande till inkubationstiden. Beakta metabolism och dubbelarbete tid av svampen.
3. peptider (okänd Agent)
- Lagra de frystorkade peptiderna vid-20 ° C, och lös upp dem i avjoniserat vatten före varje experiment. Den maximala lagringstiden en gång upplöst i vatten beror på arten av varje peptid.
- Förbereda alikvoter av två gånger den högsta slutlig koncentration som testats i analysen (2 X). Idealiskt, förbereda ett litet antal portioner med tillräckligt peptid användas en gång att undvika frysning-tining cykler.
Obs: Valet av koncentration bör baseras på litteratur och egenskaper av peptiden. Det rekommenderas att börja seriespädningar med cirka 100 µM av peptiden, och sedan minska eller öka denna koncentrationsintervall beroende på de erhållna resultaten.
4. referens antimykotika (positiv kontroll)
- För dem utspätt i vatten: Bered en 2 X av den högsta koncentrationen av analysen (se avsnitt 5: svampdödande Assay anvisningar om spädning).
- För C. albicans stammar, Bered en 128 µg/mL flukonazol eller 128 µg/mL av kaspofungin. Plattan koncentrationen för båda blir 64 µg/mL.
- För C. neoformans stammar, Bered en av 32 µg/mL amfotericin B (vattenlösliga lösning). Den platta koncentrationen blir 16 µg/mL.
Obs: Normalt amfotericin B är utspätt i dimetyl sulfoxid (DMSO), eftersom detta anti-svamp är svårlösliga i vatten. Det finns dock vattenlösliga amfotericin B-preparat som är kommersiellt tillgängliga.
- För antimykotika utspätt i ett organiskt lösningsmedel: förbereda en 100 X stamlösning i DMSO, sedan späd det till 10 X i vatten för användning.
Obs: Således i brunnen, den slutliga koncentrationen av DMSO kommer inte överstiga 1%. En brunn där svampen kommer att växa i media som innehåller 1% DMSO som kontroll krävs med tanke på att vissa svampar inte tål väl denna koncentration av lösningsmedlet. Kom ihåg att DMSO är ljuskänslig, så Täck plåten med folie eller placera den i en mörk kammare under inkubationstiden.
5. svampdödande Assay
Obs: In vitro svampdödande analyser utförs baserat på buljong microdilution känslighet test från klinisk och Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 riktlinjer med några ändringar.
- Förbereda en tvåfaldiga seriella utspädning av varje peptid och styra emot svamp i 96 brunnar polystyren mikroplattor till en slutlig volym av 50 µL.
- Tillsätt med pipett 100 µL av antimykotisk/peptiden i 2 X koncentration av de högsta önskad slutlig koncentration i kolumnerna 1-3, i rad A.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 50 µL sterilt vatten i andra brunnar, i raderna B-H.
- Ta bort 50 µL av brunnarna med den högsta koncentrationen (rad A), transfer till nästa och till nästa koncentrationen (rad B) och homogenisera.
- Upprepa stegen ovan tills brunnen med den lägsta koncentrationen och kassera 50 µL av detta väl (rad H). Låt kolumner 11 och 12 (rader A, B, C) med bara vatten för antingen tom kontroll eller negativ/tillväxt kontroll.
- Tillsätt 50 μl av 2 X justerade inokulum i RPMI-1640 medium till varje brunn (kolumnerna 1-3 plus kolumn 11 (negativ/tillväxt kontroll)); den slutliga koncentrationen av C. albicans kommer att vara 2 x 103 celler/mL, och den slutliga koncentrationen C. neoformans stammar kommer att vara 104 celler/mL.
- Förbereda tomt kontroller (50 µL vatten + 50 µL 2 X RPMI-1640 medium utan celler) och negativa/tillväxt kontroll (50 µL vatten + 50 µL justerat inokulum 2 X RPMI-1640 medium utan medel mot svamp) och lasten i väl plattan som beskrivs ovan.
- Upprepa proceduren för varje förening ska testas och valt svampdödande kontroll (kolumnerna 4-10).
Obs: Seriespädningar kan göras vertikalt som experimentet nedan, eller horisontellt i plattan (dvs. om antalet utspädningar av viss förening/extraktet som behöver testas är åtta eller mer).- Om referenser till föreningarna, droger, eller någon av dess komponenter är ljuskänsliga, utföra analysen i reducerad ljus, täck plattorna med folie eller placera i en mörk kammare under inkubationer.
- Överväg följande valfria rekommendationer.
- Försegla plattan med en tydlig täckplåt som tillåter gasutbyte, eftersom detta bidrar till att minska avdunstning.
- Placera plattan i en fuktig kammare; Det kommer också att minska avdunstning.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C under 24 h eller 48 h för alla C. albicans stammar och för 48 h med 200 rpm skakar för C. neoformans. Den lägsta slutliga volymen (100 µL) säkerställer att ingen spridningseffekter uppstår.
Obs: Ingen signifikant skillnad observerades mellan MIC avläsningar på 24 h och 48 h för C. albicans stammar. Avläsningar på 48 h är ändå lättare att visualisera. - Observera alla brunnar, med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop, före inkubationstiden och efter för att kontrollera förändringar i morfologi samt att kontrollera för tecken på kontamination.
Obs: Avläsningar kan göras visuellt och fotograferade i slutet av experimentet. Innan varje läsning, homogenisera något plattan. Läser kan också utföras genom att mäta dess OD på 600 nm, om cell klumpar eller filamentation inte följs. - Utföra experimenten minst tre gånger på separat datum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MIC definieras som den lägsta antimikrobiella sammansatta koncentration som helt hämmar synliga svamptillväxt i slutet av inkubationstiden. Eftersom målet med detta protokoll är att ha en snabb metod att skärmen potentiella antimykotika, anses någon brunn med tydlig media liknar de tomma brunnarna ett positivt resultat, medan någon väl med grumlighet analogt med negativa/tillväxt kontrollbrunnarna är betraktas som negativa. Dock om det finns ett intresse att veta om en viss AMP är fungistatisk eller svampdödande, kan media från positiv brunnarna också vara klädd på Sabouraud dextros Agar eller kontrolleras av en annan bärkraftstest.
Verkningsmekanismen av en roman som förening är okänd, det är därför viktigt att kontrollera om referens antimykotisk faller inom det förväntade intervallet för den svamp isolera (kontrollera officiella riktlinjer, tabeller eller data i litteraturen) innan du kontrollerar den testade MIC för föreningen (i detta fall, en AMP; Figur 1 och figur 2) bekräfta att förhållandena är idealiska. Om det inte faller inom intervallet respekterade, blir det nödvändigt att köra experimentet eftersom det blir omöjligt att avgöra om eventuella förändringar som observerats är uteslutande beror på den testa föreningen. Det är lika viktigt att iaktta alla brunnar under ett ljusmikroskop före och efter inkubationstiden att kontrollera förändringar i morfologi och kontamination.
Figur 1. Utvärdering av antifungal aktivitet för tre peptider mot Cryptococcus neoformansmed buljong microdilution analys. Svampen koncentrationen är på 1 x 104 celler/mL. Tre peptider testades (AMP1, kolumnerna 1-3; AMP2, kolumner 5 till 7; AMP3, kolumnerna 8-10) med koncentrationer från 100 µM (rad A) 0,78 µm (rad H). Blank och tillväxtkontroll är i kolumnerna 11 och 12, respektive. Bilden förvärvades med en digitalkamera efter 48 h för inkubation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Utvärdering av antifungal aktivitet för tre peptider mot Candida albicans med buljong microdilution analys. Svamp koncentrationen är på 2 x 103 celler/mL. Tre peptider testades (AMP1, kolumnerna 1-3; AMP2, kolumner 4 till 6; AMP3, kolumnerna 7 till 9) med koncentrationer från 100 µM (rad A) 0,78 µm (rad H). Blank och tillväxtkontroll ingick i analysen, men visas inte i bilden. Bilden förvärvades med en digitalkamera efter 48 h för inkubation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Såsom framgår av figur 1 och figur 2, är 48 h tillräckligt med tid att skilja mellan positiva och negativa brunnar visuellt för både C. neoformans och C. albicans. Det är anmärkningsvärt att resultaten för C. neoformans erhölls 24 h tidigare än enligt CSLI riktlinjer utan ändringar. För varje tre exemplar, positiva och negativa brunnen och därför MIC för varje förening, är lätt urskiljbar. Detta möjliggör snabb MIC-bestämning för flera föreningar samt när det gäller att välja vilka molekyler merit ytterligare utredning. Samtidigt är figur 3 ett exempel ett dåligt resultat, sannolikt från felaktig pipettering under utspädningssteg. Detta kan observeras i kolumn 5, rad C, där en skillnad i C. neoformans tillväxt är närvarande över replikat (kolumnerna 5-7).
Figur 3. Exempel på ett fel i tekniska replikerar i en seriell utspädning assay. Bilden visar en seriell utspädning ampere alltifrån 100 µM (rad A) till 0,78 µM (rad H). Skillnader i C. neoformans tillväxt finns mellan replikaten i kolumnerna 5-7, rad C, troligen på grund av pipettering fel under utspädning beredning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När det gäller tolkningen av pläterar, i figur 1 finns svampdödande test för tre olika ampere mot C. neoformans, belägen vid kolumnerna 1-3 för AMP1, kolumn 5-7 för AMP2 och kolumnerna 8-10 för AMP3 med koncentrationer varierar från 100 µ M (rad A) till 0,78 µM (rad H). Negativ/tillväxt kontroll placerades i kolumn 11, rader A till C, medan blankprovet placerades i kolumn 12, rader A till C. För AMP1 (kolumnerna 1-3, rader A-C) och AMP2 (kolumnerna 5-7, rader A-D), är Observera att vid en högre koncentration media är genomskinlig och det ingen synlig tillväxt. Däremot vid lägre koncentrationer brunnarna är ogenomskinliga (kolumnerna 1-3, rader D-H och kolumner 5-7, rader E-H). Därför, rad C anses innehålla MIC för AMP1, medan MIC för AMP2 är i rad D, det vill säga, 25 µM och 12,5 µM, respektive. AMP3 måste omvärderas, som svampen växte i alla koncentrationer testats. Omprövning för AMP3 är nödvändigt att fastställa orsaken, som skulle kunna vara att testmediet stör svampdödande aktiviteten av den sammansatta, mikrobiell kontamineringen eller en högre svampen till agenten testad. Sista möjligheten att blir det nödvändigt att öka de koncentrationsintervall som testas. Som påpekat, nr-hämning och kontroll brunnarna är homogena, så de kunde även bedömas genom OD mätning på 600 nm.
Figur 2testades tre distinkta peptider mot C. albicans. Mikrofoner för AMP1 (kolumnerna 1-3), AMP2 (kolumnerna 4-6), och AMP3 (kolumnerna 7-9) var 50 µM, 6 µM 25 µM, respektive. C. albicans, kan på grund av filamentation i inkubation temperatur, observeras i klumpar i de no-hämning och kontrollbrunnar, vilket gör det svårt att använda OD mätning för läsning.
Ibland observeras ingen tillväxt i brunnarna. Detta kan bero på en toxin förorening i media (i vilket fall tillväxt kontrollerna visas också ingen tillväxt) eller en högre känslighet för agenten (i vilket fall, tillväxt kontrollerna visar tillväxt). Följaktligen för sistnämnda fall kan en minskning i koncentrationer behövas.
| Medium | Beredning | |
| 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (kompletteras med L-glutamin och fenolrött; utan bikarbonat) | |
| 330 mM 3-(N- morpholino) propan sulfonsyra (moppar) | ||
| Justera till pH 7.0 med NaOH | ||
| Sterilisera genom filtrering (0,22 µM filter) | ||
| Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2,7 mM KCl | ||
| 10 mM Na2HPO4 | ||
| 2 mM KH2PO4 | ||
| Autoklav vid 121° C i 15 minuter. | ||
| Sabouraud dextros buljong | 15 g av pulvret i 500 mL destillerat vatten. | |
| Justera till pH 7.0 med NaOH | ||
| Autoklav vid 121° C i 15 minuter. | ||
| Sabouraud dextros Agar | 32,5 g av pulvret i 500 mL destillerat vatten. | |
| Justera till pH 7.0 med NaOH | ||
| Autoklav vid 121° C i 15 minuter. | ||
Tabell 1. Media och reagens förberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microdilution tester kan analysera potentiella svampdödande aktiviteten av ett mål som är sammansatta med små mängder av föreningen och samtidigt testa den i en serie koncentrationer. Följaktligen rekommenderas detta protokoll som ett första steg i screening för potentiella nya svampdödande föreningar. Det protokoll som presenteras här bygger på protokollet M27-A3, ursprungligen konstruerad för att stöd i valet av antimykotisk terapi i kliniker, och kan anpassas till en mängd nya svampdödande föreningar. Övergripande, detta protokoll kan fokusera på de fysikalisk-kemiska funktionerna av extraktet eller sammansatta. Exempelvis kan en potentiell kandidat i analysen falskt visas ineffektivt eftersom en förening i media kan blockera dess interaktion med svamp cellen, till exempel effekten av RPMI på Histatin 514. I det här fallet är ett alternativt medium för när RPMI stör, jäst kväve bas (YNB) buffert med moppar pH 715.
Protokollet tillåter också ändringar i före tillväxt villkorar, inokulum koncentration, inkubation temperatur, och ljuskänsliga komponenter, så länge som referens svampdödande resultaten finns inom intervallet som riktlinjer. Referens antimykotisk bör baseras på den nuvarande terapin för de testa svamp arterna. Dessutom om det finns en referens förening som är snarlika till potentiella läkemedlet – t.ex., en känd antimikrobiell peptid med svampdödande aktivitet mot testade svamp modellen – den bör användas som en ytterligare kontroll.
Före tillväxt villkorar kan ändras för att passa svamparna och forskningsbehov. Som i protokollet odlades, C. neoformans och C. albicans vid 30 ° C för bättre förökning. Ändå, denna temperatur kan ändras beroende på svampar metabolism: till exempel, Paracoccidioides brasiliensis kräver tillväxt vid 37 ° C att upprätthålla sin jäst form, och på grund av dess långsamma dubbelarbete, behöver odlas för 5-7 dagar. Därför är det viktigt att förstå svampen egenskaperna för att testa ett potentiellt nytt läkemedel. Dessutom ålder och skede av tillväxt på cellerna som används bör definieras utifrån syftet med varje studie och, viktigast av allt, första inkubationstiden bör fastställas i förväg och objektivtypen alla tester att säkerställa reproducerbarhet .
Lika, om förening/extraktet, referens svampdödande eller spädningsmedel är känsliga för ljus, steg bör läggas till förhindra dess nedbrytning, som arbetar med reducerad ljus, som täcker plattorna med folie eller placera plattorna i en mörk kammare under inkubationstider.
Dessutom kan den kant effekt och avdunstning minskas med tillsats av vatten i tomma brunnar, genom att inte använda yttre brunnarna och fylla dem med vatten, eller genom att placera plattan i en fuktig kammare.
En av de viktigaste begränsningarna när du använder denna metod är dess fokus på den hämmande effekten av en testade förening, i motsats till skilja mellan svampbekämpning eller Fungistatisk verkan. Ändå, eftersom målet är en snabb genomgång av de potentiella nya svampdödande, den första visuella bedömningen MIC med en tydlig positiv (' clear/icke-grumlighet' brunnar) och en negativ ('grumlighet' brunnar) resultat, hjälper till att identifiera föreningar av intresse att studera Ytterligare, och därmed minska den totala kostnaden för screening för nya föreningar.
Eftersom verkningsmekanismen av dessa nya föreningar är okänd, kan detta samma protokoll användas avgöra föreningens förmåga att hämma eller döda svampceller genom att lägga till några extra steg, såsom plätering positiva brunnarna eller använda live/dead färgämnen. Andra mindre ändringar kan läggas till använda protokollet för en schackrutiga titrering analys för att identifiera eventuella synergieffekter av föreningen med andra droger.
Även om analysens behandlingen utförs vanligtvis av visuell analys av svamp tillväxt under olika villkor jämfört med tillväxten i brunnen med ingen svampdödande agent (negativ/tillväxt kontroll), det kan också göras genom att mäta dess OD på 600 nm. Men även om OD mätning är korrekt för homogen lösningar, växa vissa svampar i klumpar därmed bryta precisionen i metoden – t.ex., Candida spp. som följd av filamentation under inkubationstiden.
Däremot, en av de stora fördelarna med av protokollet som beskrivs här, i jämförelse med CLSI M27-A3 riktlinjerna, är att det tar in i konto luftning av media för icke-fermenterande svampar, som C. neoformans. CLSI riktlinjerna använder också, bara en liten inledande inokulum, vilket kräver längre perioder för inkubation för svamptillväxt och MIC definition. Vissa studier har visat att högre initialer inoculums och skaka plattan under inkuberingen förbättra de svampdödande resistensbestämning utan betydande effekter på MIC bestämning16,17. Våra protokoll kan exakt bestämma MIC för nya föreningar mot C. neoformans i en förkortad inkubationstid, inom 48 h, jämfört med 72 h CLSI riktlinjer har föreslagit.
En annan fördel är att våra protokoll använder en 100 µL slutlig volym istället för 200 µL rekommenderas av CLSI riktlinjer, vilket minskar beloppet av de testade nya förening behövs för svampdödande analysen. Avdunstning av externa brunnar kan vara ett bekymmer, men lösningar som redan beskrivits i detta avsnitt för att minska avdunstningen kan användas utan att kompromissa med resultaten.
Dessutom, genom att utföra spädningarna direkt i plattan, och därmed kringgå CLSI utspädning riktlinjerna för att använda mikrocentrifugrör, kan multikanal användas. Detta protokoll församling är mindre komplicerat än det i CLSI riktlinjerna, och använder också färre material.
Ett avgörande steg samband svamp cell förberedelserna är användningen av celler som är så färsk som möjligt. Det är också viktigt att utföra alla analyserna med celler på samma tillväxtfas, eftersom det finns flera rapporter i litteraturen om skillnaderna i svampdödande känslighet när kulturen åldrarna18,19. Ett noggrant urval av referensstammar är också viktigt. En mycket känslig eller sällan isolerade arter kanske inte ger en tydlig bild av svampdödande potential. På samma sätt, är det bra att undvika sub odlingsskålar steg om inte lägga många variabler till analysen. Till exempel för Candida-stammar (som växer snabbare), vi föredrar att kringgå steget agar plattan genom att göra inokulatet direkt i flytande media.
Kom ihåg att de fysikalisk-kemiska funktionerna av extraktet eller sammansatta testas är viktigt att tänka på. Till exempel om den extrakt eller sammansatta behov att upplösas i lösningsmedel än vatten, måste se till att ha en lämplig svamptillväxt kontroll innehåller som samma lösningsmedel koncentration med svampen ensam. Detta är att garantera att någon tillväxthämning som observerades inte är på grund av lösningsmedlet i stället för den testa föreningen eller extrahera. I det här fallet, det kan vara bättre att följa CLSI-M27A3 rekommendationer för DMSO utspädd svampdödande läkemedel, såsom upplösning drogen i en koncentration som är minst 100 gånger högre än den högsta testa koncentrationen att minska procentandelen av lösningsmedlet i den plattan.
När det gäller stabilitet, det rekommenderas att hålla små delprover av analyserade extrakt eller föreningar. Genom att lagra volymen som behövs för en enda analys vid lämplig temperatur, överdriven manipulation av alikvoten och, om den extrakt eller föreningar lagras frysta, frysning-tining cykler kan undvikas.
Slutligen är ett av de mest grundläggande stegen riktigheten i mikroplattan seriell utspädning, eftersom något pipettering fel kommer att propageras längs de på varandra följande utspädningarna. Hädanefter, är pipett precision och rätt pipettering teknik avgörande att säkerställa reproducerbarhet. Så, det är absolut nödvändigt att användning kalibreras pipetter och alltid kontrollera om volymen läggs och tas bort från varje brunn är korrekt. Se till att rester eller spår från drogen inte förblir i pipettspetsen. Om föreningen tenderar att hålla sig till spets, kan det vara bättre att byta tips mellan spädningarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar uddar-Brasilien, CNPq-Brasilien, FAP/DF för ekonomiskt stöd. Vi är tacksamma mot Dr Hugo Costa Paes för översyn av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
