Summary
Um fácil e adaptável como caldo para a seleção de extratos e compostos antifúngicos.
Abstract
Infecções fúngicas tornaram-se uma importante condição médica nas últimas décadas, mas o número de drogas antifúngicas disponíveis é limitado. Nesse cenário, a busca de novos medicamentos antifúngicos é necessária. O relatado aqui detalha um método péptidos de tela para suas propriedades antifúngicas. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com modificações de acordo com a pesquisa de peptídeos antimicrobianos como potenciais novos antifúngicos. Este protocolo descreve um ensaio funcional para avaliar a atividade dos compostos antifúngicos e pode ser facilmente modificado para se adequar a qualquer classe particular de moléculas sob investigação. Desde que os ensaios são realizados em placas de 96 poços, usando volumes pequenos, uma triagem em larga escala pode ser concluída em um curto espaço de tempo, especialmente se realizado em um ambiente de automação. Este procedimento ilustra como um protocolo clínico padronizado e ajustável pode ajudar a busca de trabalho-banco de novas moléculas para melhorar a terapia de doenças fúngicas.
Introduction
Infecções fúngicas tornaram-se uma preocupação médica importante nas últimas décadas, tendo aumentado consideravelmente principalmente devido a um aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, tais como aqueles submetidos a tratamento de câncer e aqueles que vivem com HIV/AIDS ou transplante de órgãos,1,2. No entanto, um conjunto muito limitado de drogas antifúngicas disponíveis e o número crescente de relatórios sobre resistência fúngica-lhes contribuam para os grandes problemas em relação a terapêutica de micoses sistêmicas3.
Uma potencial fonte de novos compostos antifúngicos são peptídeos antimicrobianos (AMPs), pequenos peptídeos catiônicos produzidos por muitos organismos como parte de sua resposta imune inata para infecção4. No entanto, o método de triagem para testar estes compostos contra patógenos fúngicos não é padronizado. Diferentes procedimentos têm sido utilizados para avaliar a atividade antifúngica de AMPs, às vezes para o mesmo modelo microorganismo5,6,7. Essas diferenças e a falta de detalhes em alguns protocolos complicam comparações entre compostos e dificulta a reprodutibilidade.
Uma forma de padronizar os testes de novos candidatos a fármacos é seguir diretrizes usadas para definir a susceptibilidade em ambientes clínicos, tais como o clínico e orientações Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. No entanto, estes testes de sensibilidade antifúngica são demasiado restritivas e não leva em variação de consideração no metabolismo em toda a espécie, como eles foram criados apenas para alguns agentes selecionados. Por exemplo, eles não levam em conta as necessidades metabólicas de leveduras não-fermentação.
Este protocolo permite a avaliação da atividade dos compostos antifúngicos em potencial e é implementado aqui para a procura de peptídeos antifúngicos. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações CLSI M27-A3 com modificações que otimizam a exibição de novos compostos8,9. Estas alterações permitem o uso de pequenas quantidades de composto, variações de temperatura ou inóculo inicial e de diferentes meios de comunicação para o crescimento ideal do pré-teste, enquanto padronizar os resultados com o uso de antifúngicos de referência como controles. Esse método, com o uso de placas de cultura multi bem, torna possível para um grande número de compostos de tela de forma rápida e confiável.
Devido à sua flexibilidade inerente, este protocolo pode ser usado com diferentes classes químicas de compostos e contra outros microorganismos, com algumas adaptações.
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Protocol
1. soluções e meios de comunicação
- Prepare 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suporte, tampão fosfato salino (PBS), caldo de Sabouraud dextrose e ágar de Sabouraud dextrose conforme tabela 1.
2. condições de crescimento do inóculo fúngicas
- Armazene todas as estirpes fúngicas como estoques congelados em glicerol de 35% a-80 ° C, até que seja necessário.
- Execute as seguintes etapas antes de cada experimento.
- Por cepas de Candida albicans :
- Descongelar um frasco de estoque e transferir 200 µ l a 10 mL de caldo de Sabouraud dextrose em um tubo de polipropileno estéril 50 mL com tampa e cultura durante a noite a 30 ° C, com agitação (200 rpm). Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa um pouco aberta para melhor aeração da cultura.
- Para cepas de Cryptococcus neoformans :
- Raspe a superfície congelada de um frasco de estoque. As células em placas de ágar Sabouraud dextrose da placa e incubar durante 48 h a 30 ° C. Depois visível crescimento de colônias isoladas, manter as placas no frigorífico (4 ° C) selado com película de parafina para até 15 dias.
- Recolher uma colônia isolada de médio porte da placa usando um palito estéril ou ansa inoculando estéril e inocular 10 mL de caldo de Sabouraud dextrose em um tubo cônico estéril 50 mL. Incube durante aproximadamente 24 horas a 30 ° C, sob agitação (200 rpm).
- Não exceda a incubação de 24 h. Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa um pouco aberta para melhor aeração. É sempre bom padronizar a fase de crescimento das células antes de cada ensaio, já que este é um fator importante que afecta a resistência antimicrobiana.
Nota: Ambos os fungos foram cultivados a 30 ° C, de rápida propagação em nossos experimentos, mas a temperatura pode ser alterada para refletir os objetivos do estudo, o tratamento por exemplo clínico (37 ° C). Mais importante, este tempo de incubação inicial deve ser previamente estabelecido para cada isolado fúngico e mantido ao longo de todos os testes para garantir a reprodutibilidade.
- Por cepas de Candida albicans :
- Após o crescimento de fungos, colete as células por centrifugação dos tubos cónicos a 1.200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e adicionar 10 mL de PBS.
- Ressuspender as células e centrifugar novamente a 1.200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Repeti a lavagem PBS e centrifugação mais duas vezes. Após a terceira lavagem, Ressuspender as células em 5 mL (de acordo com o tamanho da pelota) de 2 X RPMI-1640 médio.
- Prepare-se 1 mL de uma diluição de 1: 100 ou 1:1,000 em um tubo de microcentrifugadora (dependendo da turvação de suspensão de células).
- Alíquota 10 µ l desta diluição, coloque-o em uma câmara de hemocytometer e conte o número total de células nos quadrantes quatro canto sob o microscópio. Calcular a concentração pela fórmula: (total de número de celular/4) x diluição fator x 104 (constante de diluição de câmara).
- Considere uma viabilidade de 100% se condições de viabilidade contagens e crescimento têm sido sistematicamente correlacionadas para o isolado a ser estudado.
Nota: A padronização e controle de qualidade das contagens de viabilidade podem ser feitos por trás-chapeamento de acordo com o Comité Europeu de antifúngicos método de concentração inibitória mínima (CIM) teste de susceptibilidade aos antimicrobianos (EUCAST) para leveduras10 . - Se a correlação de crescimento/viabilidade não foi estabelecida para o isolado sob estudo, medir a viabilidade de fungosa pela contagem de células vivas em um hemocytometer com o auxílio de corantes que cor seletivamente as células mortas, como Floxina B11, trypan azul 12, ou Janus verde13. Use as células fúngicas para este protocolo somente se a viabilidade da população neste momento é de 90% ou acima.
Nota: Corantes mortos/vivos podem não funcionar bem com o fungo de escolha. Por favor, teste-os antes de usar. Por exemplo, o corante azul de Tripan não funciona bem com o c. neoformans.
- Considere uma viabilidade de 100% se condições de viabilidade contagens e crescimento têm sido sistematicamente correlacionadas para o isolado a ser estudado.
- Depois disso, preparar as suspensões celulares em 2 X RPMI-1640 médias (2 X ajustado inóculo em meio RPMI-1640). Para placas de 96 poços, considere um volume de 5 mL por cada placa.
- Para todas as cepas de c. albicans , prepare uma suspensão de célula estoque de 4 x 103 células/mL. Esta concentração é 2x da concentração celular final em cada poço (2 x 103 células/mL).
- Para cepas de c. neoformans , prepare uma estoque cultura de células de 2 x 104 células/mL. Esta concentração é duas vezes a concentração celular final em cada poço (1 x 104 células/mL).
- Para outros fungos, teste com um antifúngico conhecido qual concentração será ideal para o estudo particular em relação ao tempo de incubação. Tempo de duplicação e metabolismo do fungo em consideração.
3. peptídeos (agente desconhecido)
- Armazenar os peptídeos liofilizados a-20 ° C e dissolvê-los em água desionizada antes de cada experimento. O tempo máximo de armazenamento, uma vez dissolvido em água vai depender da natureza de cada peptídeo.
- Prepare alíquotas de duas vezes a maior concentração final testados no ensaio (2 X). Idealmente, prepare um pequeno número de alíquotas com suficiente peptídeo para uma utilização evitar ciclos de congelamento e descongelamento.
Nota: A escolha da concentração deve ser baseada na literatura e as propriedades do peptide. Recomenda-se iniciar as diluições de série com cerca de 100 µM do peptide e, em seguida, diminuir ou aumentar este intervalo de concentração dependendo dos resultados obtidos.
4. referência antifúngicos (controles positivos)
- Para aqueles diluído em água: preparar uma solução X 2 de maior concentração da análise (ver secção 5: ensaio antifúngicos para as etapas de diluição).
- Por cepas de c. albicans , prepare uma solução de 128 µ g/mL de fluconazol ou 128 µ g/mL de caspofungina. A concentração de placa para ambos será 64 µ g/mL.
- Por cepas de c. neoformans , prepare uma solução de 32 µ g/mL de anfotericina B (solução hidrossolúvel). A concentração de placa será 16 µ g/mL.
Nota: Normalmente anfotericina B é diluído em dimetilsulfóxido (DMSO), desde que este antifúngicos é pouco solúvel em água. No entanto, existem preparações hidrossolúveis anfotericina B disponível comercialmente.
- Para antifúngicos diluídos em um solvente orgânico: preparar uma 100 X solução estoque em DMSO e, em seguida, diluir a 10 X na água para uso.
Nota: Assim, no poço, a concentração final de DMSO não exceda 1%. Um poço onde o fungo irá crescer em meios contendo 1% DMSO como controle é necessário, dado que alguns fungos não toleram bem esta concentração do solvente. Lembre-se que o DMSO é fotossensível, então cubra o prato com papel alumínio ou coloque-o em uma câmara escura para a duração do período de incubação.
5. antifúngico ensaio
Nota: Os ensaios In vitro antifungais são executados com base no teste de susceptibilidade de caldo como de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com algumas modificações.
- Preparar uma diluição serial dupla de cada peptídeo e antifúngico em microplacas de poliestireno de 96 poços para um volume final de 50 µ l de controle.
- Usando uma pipeta Adicione 100 µ l do peptide/antifúngico na concentração X 2 da mais alta desejada concentração final nas colunas 1-3, em linha A.
- Usando uma pipeta multicanal, adicionar 50 µ l de água estéril em outros poços, nas linhas B-H.
- Remover 50 µ l de poços com a maior concentração (linha A), transferir para o próximo bem da próxima concentração (linha B) e homogeneizar.
- Repita os passos acima até o poço com a menor concentração e descartar 50 µ l desta bem (linha H). Deixe colunas 11 e 12 (linhas A, B, C) com água apenas para controle em branco ou controle negativo/crescimento.
- Adicionar 50 µ l do 2 X inóculo ajustado em meio RPMI-1640 a cada poço (colunas 1-3 plus coluna 11 (controle negativo/crescimento)); a concentração final para c. albicans será 2 x 103 células/mL e a concentração final para cepas de c. neoformans será 104 células/mL.
- Prepare-se controles em branco (50 µ l água + 50 µ l 2 X RPMI-1640 meio sem células) e controle negativo/crescimento (50 µ l água + 50 µ l ajustado inóculo 2 X RPMI-1640 médio sem antifúngico) e carga na placa bem como descrito acima.
- Repita o procedimento para cada composto a ser testado e o controle de antifúngico escolhido (colunas 4-10).
Nota: As diluições de série podem ser feitas verticalmente como o experimento abaixo, ou horizontalmente na placa (ou seja, se o número de diluições de determinado composto/extracto que precisam ser testados é de oito ou mais).- Se os compostos, referência drogas, ou qualquer dos seus componentes são fotossensíveis, realizar o ensaio em luz reduzida, cobrir as placas com papel alumínio ou coloque em uma câmara escura, durante a incubação do.
- Considere as seguintes recomendações opcionais.
- Selo da placa com uma placa de tampa transparente que permite a troca gasosa, como este ajuda a reduzir a evaporação.
- Coloque a placa em uma câmara úmida; Isso também ajudará a reduzir a evaporação.
- Incube as placas a 37 ° C por 24 h ou 48h para todas as cepas de c. albicans e por 48 h com 200 rpm agitação por c. neoformans. O volume final inferior (100 µ l) garante que não há repercussões ocorre.
Nota: Nenhuma diferença significativa foi observada entre as leituras de MIC em 24 h e 48 h para cepas de c. albicans . No entanto, leituras em 48 h são mais fáceis de Visualizar. - Observe todos os poços, com o auxílio de um microscópio óptico invertido, antes do período de incubação e depois verificar as alterações na morfologia, bem como para verificar se há sinais de contaminação.
Nota: As leituras podem ser feitas visualmente e fotografadas no final do experimento. Antes de cada leitura, homogeneizar ligeiramente a placa. As leituras também podem ser realizadas medindo seu OD em 600 nm, se agrupa de célula ou filamentação não são observados. - Realizar os experimentos que pelo menos três vezes em datas distintas.
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Representative Results
O MIC é definido como a menor concentração de compostos antimicrobianos que inibe completamente o crescimento fúngico visível no final do período de incubação. Desde que o objectivo do presente protocolo é ter um método rápido de antifúngicos potencial de tela, qualquer bem com clara mídia similar aos poços em branco é considerado um resultado positivo, Considerando que qualquer bem com turbidez análoga dos poços de controle negativo/crescimento considerados negativos. No entanto, se houver um interesse em saber se um determinado AMP é fungicida ou fungistático, os meios de comunicação dos poços de positivo também podem ser banhados em Sabouraud Dextrose ágar ou verificados por outro teste de viabilidade.
Dado que o mecanismo de ação de um romance composto é desconhecido, portanto, é essencial para verificar se o antifúngico de referência cai dentro do intervalo esperado para os fungos isolar (seleção oficial diretrizes, tabelas ou dados na literatura) antes de verificar a MIC testado para o composto (no caso, um AMP; Figura 1 e Figura 2) para confirmar que as condições são ideais. Se não cai na faixa de respeitado, será necessário executar novamente o experimento, uma vez que será impossível determinar se as alterações observadas são devidas exclusivamente ao composto testado. É igualmente crucial observar todos os poços sob microscópio óptico antes e após o período de incubação para verificar se há alterações na morfologia e contaminação.
Figura 1. Avaliação da atividade antifúngica para três peptídeos contra Cryptococcus neoformans, usando o caldo como ensaio. Concentração do fungo é a 1 x 104 células/mL. Testaram-se três peptídeos (AMP1, colunas 1 a 3; AMP2, colunas de 5 a 7; AMP3, colunas 8 a 10) com concentrações que variam de 100 µM (linha A) a 0,78 µM (linha H). Em branco e controle de crescimento estão nas colunas 11 e 12, respectivamente. A imagem foi adquirida com uma câmera digital após 48 h de incubação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Avaliação da atividade antifúngica para três peptídeos contra Candida albicans , usando o caldo como ensaio. Concentração do fungo é a 2 x 103 células/mL. Testaram-se três peptídeos (AMP1, colunas 1 a 3; AMP2, colunas 4-6; AMP3, colunas de 7 a 9) com concentrações que variam de 100 µM (linha A) a 0,78 µM (linha H). Em branco e controle de crescimento foram incluídos no ensaio, mas não aparecem na foto. A imagem foi adquirida com uma câmera digital após 48 h de incubação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como observado na Figura 1 e Figura 2, 48 h é tempo suficiente para distinguir poços positivos e negativos visualmente para c. neoformans e c. albicans. Vale ressaltar que os resultados para c. neoformans foram obtidos 24 horas mais cedo do que sob as diretrizes do CSLI sem as modificações. Para cada triplicado, o poço de positivo e negativo e, portanto, o MIC para cada composto, são facilmente discerníveis. Isto permite a rápida determinação do MIC para vários compostos também quanto a escolher quais moléculas investigação adicional de mérito. Enquanto isso, a Figura 3 é um exemplo de um resultado pobre, provavelmente de pipetagem incorreta durante a etapa de diluição. Isto pode ser observado na coluna 5, linha C, onde a diferença no crescimento de c. neoformans está presente através de repetições (colunas 5-7).
Figura 3. Exemplo de um erro técnico Replica em um ensaio de diluição serial. A imagem mostra uma diluição serial de amplificadores que variam de 100 µM (linha A) a 0,78 µM (linha H). Diferenças no crescimento de c. neoformans estão presentes entre repetições nas colunas 5-7, linha C, provavelmente devido a erro de pipetagem durante a preparação da diluição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quanto a interpretação das placas, na Figura 1 , há um ensaio antifúngico para três ampolas diferentes contra c. neoformans, localizada em colunas 1-3 para AMP1, colunas 5-7 para AMP2 e colunas 8 a 10 para AMP3 com concentrações variando de 100 µ M (linha A) 0,78 µM (linha H). O controle negativo/crescimento foi colocado na coluna 11, linhas A, c, enquanto o controle em branco foi colocado na coluna 12, linhas A, c. Para AMP1 (linhas de colunas 1-3, A-C) e AMP2 (linhas de colunas 5-7, A-D), nota que, em uma concentração mais elevada, a mídia é translúcido e lá não é nenhum crescimento visível. Em contraste, em concentrações inferiores os poços são opacos (colunas 1-3, filas D-H e colunas 5-7, E-H). Portanto, a linha C é considerada para conter o MIC para AMP1, enquanto o MIC para AMP2 está na fileira D, quer dizer, 25 µM e 12,5 µM, respectivamente. AMP3 terá de ser re-avaliados, como o fungo cresceu em todas as concentrações testadas. O reexame para AMP3 é necessário para determinar a causa, que pode ser que o meio de teste está a interferir com a atividade antifúngica da contaminação microbiana, composta, ou uma maior resistência do fungo ao agente testado. A última possibilidade, será necessário aumentar o intervalo de concentração testado. Como observado, os poços não-inibição e controle são homogêneos, então eles também podem ser avaliados pela medição de OD em 600 nm.
Quanto à Figura 2, três peptídeos distintos foram testados contra c. albicans. Os microfones para AMP1 (colunas 1-3), AMP2 (colunas 4-6) e AMP3 (colunas 7-9), foram 50 µM, 6 µM e 25 µM, respectivamente. C. albicans, devido a filamentação da temperatura de incubação, pode ser observado nos grupos dos poços não-inibição e controle, tornando-se difícil de usar a medição de OD para leitura.
Às vezes, nenhum crescimento é observado nos poços. Isto pode ser devido a uma contaminação de toxina na mídia (caso em que os controles de crescimento também não mostram nenhum crescimento) ou uma maior suscetibilidade ao agente (nesse caso, os controles de crescimento mostram crescimento). Nesse sentido, para o último caso, uma diminuição na faixa de concentração pode ser necessária.
| Médio | Preparação | |
| 2 médias de 1640 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (suplementado com L-glutamina e vermelho de fenol; sem bicarbonato) | |
| 330 mM 3-(N- Morpholinos) propano sulfônico (MOPS) | ||
| Ajustar para pH 7,0 com NaOH | ||
| Esterilizar por filtração (filtro de 0,22 µM) | ||
| Tampão fosfato salino (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2,7 mM KCl | ||
| 10 mM Na2HPO4 | ||
| 2mm KH2PO4 | ||
| Autoclave a 121° C por 15 minutos. | ||
| Sabouraud dextrose caldo de carne | 15 g de pó em 500 mL de água destilada. | |
| Ajustar o pH 7.0 com NaOH | ||
| Autoclave a 121° C por 15 minutos. | ||
| Ágar Sabouraud Dextrose | 32,5 g do pó em 500 mL de água destilada. | |
| Ajustar o pH 7.0 com NaOH | ||
| Autoclave a 121° C por 15 minutos. | ||
Tabela 1. Preparação de mídia e reagente.
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Discussion
Como testes podem analisar a potencial atividade antifúngica de um alvo composto usando pequenas quantidades do composto e ao mesmo tempo testá-lo em uma gama de concentrações. Nesse sentido, o presente protocolo é recomendado como um primeiro passo na triagem para potenciais novos compostos antifúngicos. O protocolo aqui apresentado é baseado no protocolo M27-A3, inicialmente projetado para auxiliar na seleção da terapia antifúngica em clínicas e pode ser adaptado a uma variedade de novos compostos antifúngicos. Globalmente, este protocolo pode focar as características físico-químicas do extrato ou composto. Por exemplo, um candidato em potencial no ensaio falsamente pode parecer ineficaz porque um composto na mídia pode bloquear sua interação com a célula fúngica, tais como o efeito de RPMI em 5 Histatin14. Neste caso, um meio alternativo para quando o RPMI interfere, é o buffer de Base de nitrogênio levedura (YNB) com MOPS pH 715.
O protocolo também permite modificações nas condições pre-crescimento, concentração de inóculo e temperatura de incubação e para os componentes sensíveis à luz, enquanto os resultados antifúngico de referência estão dentro da faixa de orientações. O antifúngico de referência deve basear-se na terapia atual para as espécies de fungos testadas. Além disso, se houver uma referência composto que é semelhante em natureza à droga potencial – por exemplo, um peptídeo antimicrobiano conhecido com atividade antifúngica contra fungo modelo testado – deve ser usado como um controle de referência adicional.
Condições de pré-crescimento podem ser alteradas para atender os fungos e as necessidades de investigação. Como o protocolo, c. neoformans e c. albicans foram cultivadas a 30 ° C para melhor propagação. No entanto, esta temperatura pode ser alterada dependendo do metabolismo de fungos: por exemplo, Paracoccidioides brasiliensis requer crescimento a 37 ° C, para manter a sua forma de levedura e devido a sua taxa de duplicação lento, precisa ser cultivada por 5-7 dias. Portanto, é essencial compreender as características do fungo para testar uma nova droga potencial. Além disso, a idade e a fase de crescimento das células usados devem ser definidos de acordo com a finalidade de cada estudo e, mais importante, o tempo de incubação inicial deve ser estabelecido antecipadamente e mantido ao longo de todos os testes para garantir a reprodutibilidade .
Igualmente, se o composto/extrato, o antifúngico de referência ou diluente é sensível à luz, etapas devem ser adicionadas para evitar sua degradação, como trabalhar com luz reduzida, cobrindo as placas com papel alumínio ou colocar as placas em uma câmara escura durante tempos de incubação.
Além disso, o efeito de borda e evaporação podem ser diminuídas com a adição de água em poços vazios, não usando os exteriores poços e enchendo-os com água, ou colocando a placa em uma câmara úmida.
Uma das principais limitações ao usar esse método é o seu foco sobre a atividade inibitória de um composto testado, em oposição a distinção entre efeitos fungicidos ou fungistático. No entanto, como o objetivo é um rastreio rápido do potencial antifúngico de novo, a primeira avaliação visual MIC com um positivo claro (poços ' clear/não-turbidez') e um resultado negativo (poços 'turbidez'), ajuda a identificar compostos de interesse para o estudo ainda mais e, portanto, reduzindo o custo total de rastreio de novos compostos.
Desde que o mecanismo de ação desses novos compostos é desconhecido, este mesmo protocolo pode ser usado para determinar a capacidade do composto para inibir ou matar células fúngicas, adicionando alguns passos extras, tais como o chapeamento dos poços positivos ou usando corantes ao vivo/morto. Outras pequenas modificações podem ser adicionadas para usar o protocolo para um ensaio de titulação quadriculado para identificar quaisquer efeitos sinérgicos do composto com outras drogas.
Embora a leitura do ensaio é geralmente realizada por análise visual do crescimento fúngico em condições diferentes em comparação com o crescimento no poço com nenhum agente antifúngico (controle negativo/crescimento), também pode ser feito medindo seu OD em 600 nm. No entanto, embora a medição de OD é exata para soluções homogéneas, alguns fungos crescem em aglomerados, quebrando assim a precisão do método – por exemplo, Candida spp. como resultado de filamentação durante o período de incubação.
Por outro lado, uma das principais vantagens do protocolo descrito aqui, em comparação com as diretrizes do CLSI M27-A3, é que é preciso para aeração de conta dos meios de comunicação para fungos não-fermentação, como c. neoformans. Além disso, as orientações CLSI utiliza apenas um pequeno inóculo inicial, exigindo longos períodos de incubação para o crescimento fúngico e a definição de MIC. Alguns estudos têm demonstrado que a maior inoculo iniciais e agitando a placa durante a incubação melhoram os testes de susceptibilidade sem efeitos significativos na determinação de MIC16,17. Nosso protocolo precisamente pode determinar o MIC para novos compostos contra c. neoformans em um período de incubação abreviada, no prazo de 48 h, em comparação com 72 h sugerida pelas diretrizes do CLSI.
Outra vantagem é que nosso protocolo utiliza um volume final de 100 µ l em vez de 200 µ l recomendado pelas diretrizes do CLSI, reduzindo assim a quantidade do composto novo testado necessária para o ensaio de antifúngico. No entanto, evaporação de poços externos pode ser uma preocupação, mas soluções já descritas nesta seção para reduzir a evaporação podem ser usadas sem comprometer os resultados do ensaio.
Além disso, executando as diluições diretamente na placa, e, assim, ignorando as orientações de diluição do CLSI para usar microcentrifuga tubos, pipetas multicanais podem ser usadas. Este conjunto de protocolo é menos complicado do que o que nas orientações CLSI e também usa menos materiais.
Um passo crítico relacionado a preparação da célula fúngica é a utilização de células que são tão frescas quanto possível. Também é crucial realizar todos os ensaios com as células com a mesma fase de crescimento, uma vez que existem vários relatos na literatura sobre as diferenças de susceptibilidade quando a cultura idades18,19. Uma cuidadosa seleção de cepas de referência também é essencial. Uma espécie muito sensível ou raramente isolada pode não produzir uma imagem clara do potencial antifúngico. Da mesma forma, é útil evitar passos sub cultivo quanto não adicionar muitas variáveis para o ensaio. Por exemplo, por cepas de Candida (que crescem mais rápido), preferimos ignorar o passo de placa de ágar-ágar, tornando o inóculo diretamente para o meio líquido.
Lembre-se que as características físico-químicas do extracto ou compostos a serem testadas são importantes a considerar. Por exemplo, se o extrato ou composta precisa ser dissolvido em solventes, com exclusão da água, deve certificar-se de ter um controle adequado crescimento fúngico que inclui a mesma concentração de solvente com o fungo sozinho. Isto é para garantir que qualquer inibição do crescimento observada não é devido o solvente em vez do composto testado ou extrair. Neste caso, é melhor seguir as recomendações do CLSI-M27A3 para drogas antifúngicas DMSO diluído, como se dissolvendo a droga em uma concentração de pelo menos 100 vezes maior do que a maior concentração testada para reduzir o percentual do solvente na placa.
Em matéria de estabilidade, é aconselhável manter pequenas alíquotas dos extratos analisados ou compostos. Armazenando o volume necessário para um único ensaio à temperatura apropriada, manipulação excessiva da alíquota e, se os extratos ou compostos são armazenados congeladas, ciclos de gelo-degelo podem ser evitados.
Finalmente, um dos passos mais fundamentais é a precisão de diluição serial microplate, dado que qualquer erro de pipetagem será propagado ao longo as diluições consecutivas. De agora em diante, pipeta de precisão e técnicas de pipetagem adequadas são fundamentais para garantir a reprodutibilidade. Então, é imperativo para pipetas de uso calibrado e sempre verifique se o volume adicionado e removido de cada poço está correto. Certifique-se de que resíduo ou vestígio da droga não permaneça na ponta da pipeta. Se o composto tende a ficar na ponta, é melhor trocar dicas entre as diluições.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a CAPES-Brasil, Brasil-CNPq, FAP/DF para apoio financeiro. Nós estamos gratos ao Dr. Hugo Costa Paes para a revisão do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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