Summary
Een eenvoudig en flexibel Bouillon microdilution methode voor het screenen van antischimmel verbindingen en extracten.
Abstract
Schimmelinfecties zijn een belangrijke medische voorwaarde geworden in de laatste decennia, maar het aantal beschikbare antischimmel geneesmiddelen is beperkt. In dit scenario is het zoeken naar nieuwe antischimmel geneesmiddelen nodig. Het protocol gemeld hier gegevens een methode om scherm peptiden voor hun schimmeldodende eigenschappen. Het is gebaseerd op de Bouillon microdilution gevoeligheid test van de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren met wijzigingen aan het onderzoek van antimicrobiële peptiden als potentiële nieuwe antischimmelmiddelen. Dit protocol beschrijft een functionele test om te evalueren van de activiteiten van antischimmel verbindingen en kan eenvoudig worden aangepast om aan te passen van een bepaalde categorie van moleculen onder onderzoek. Aangezien de testen worden uitgevoerd in 96-wells-platen met behulp van kleine volumes, kan een grootschalig onderzoek worden uitgevoerd in een korte hoeveelheid tijd, vooral als uitgevoerd in een omgeving van automatisering. Deze procedure laat zien hoe een gestandaardiseerde en verstelbare klinische protocol het nastreven van de Bank-werk van nieuwe moleculen ter verbetering van de therapie van schimmelziekten kan helpen.
Introduction
Schimmelinfecties zijn geworden een belangrijke medische zorg in de afgelopen decennia aanzienlijk is gestegen voornamelijk te wijten aan een stijging van het aantal immuungecompromitteerde personen zoals die in de behandeling van kanker en degenen die met HIV/AIDS leven of getransplanteerde organen1,2. Echter bijdragen een zeer beperkt scala van beschikbare antischimmel geneesmiddelen en het toenemende aantal verslagen over schimmel weerstand tegen hen aan de grote problemen met betrekking tot de therapeutiek van systemische mycoses3.
Een potentiële bron van nieuwe antischimmel compounds zijn antimicrobiële peptiden (ampère), kleine kationische peptiden geproduceerd door vele organismen als onderdeel van hun aangeboren immune reactie op infectie4. De screeningsmethode voor het testen van deze verbindingen tegen schimmel ziekteverwekkers is echter niet gestandaardiseerd. Verschillende procedures zijn gebruikt om de antischimmel activiteiten beoordelen van versterkers, soms voor de dezelfde model micro-organisme5,6,7. Deze verschillen en het gebrek aan detail in sommige protocollen bemoeilijken vergelijkingen tussen verbindingen en belemmert reproduceerbaarheid.
Unidirectioneel om te standaardiseren het testen van nieuwe drugkandidaten is richtsnoeren gebruikt om te definiëren antischimmel gevoeligheid in klinische instellingen, zoals de klinische en laboratorium Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren te volgen. Deze antischimmel gevoeligheid tests zijn echter te beperkend, en niet rekening overweging variatie in metabolisme over soorten, als zij slechts voor een paar selecteren agenten waren gevestigd. Bijvoorbeeld, doen ze niet rekening houden met de metabolische behoeften van niet-fermenteren-gisten.
Dit protocol staat de beoordeling van de activiteit van potentiële antischimmel verbindingen, en hier is geïmplementeerd voor het zoeken naar antischimmel peptiden. Het is gebaseerd op de Bouillon microdilution gevoeligheid test van de CLSI M27-A3-richtlijnen met betrekking tot wijzigingen die de screening van nieuwe verbindingen8,9te optimaliseren. Deze wijzigingen toestaan voor het gebruik van kleine hoeveelheden van stof, variaties in temperatuur of eerste entmateriaal en verschillende media voor optimale pre-test groei, terwijl de resultaten met het gebruik van referentie antischimmelmiddelen als besturingselementen te standaardiseren. Deze methode, met het gebruik van multi goed cultuur platen, maakt het mogelijk om snel en betrouwbaar scherm een groot aantal verbindingen.
Als gevolg van de inherente flexibiliteit, kan dit protocol worden gebruikt met verschillende chemische klassen van samenstellingen en tegen andere micro-organismen, met enkele aanpassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oplossingen en Media
- Bereiden van 2 X Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), Sabouraud dextrose Bouillon en Sabouraud dextrose agar volgens tabel 1.
2. schimmel entmateriaal groei voorwaarden
- Bewaar alle schimmel stammen als bevroren voorraden in 35% glycerol bij-80 ° C, totdat het nodig is.
- Voer de volgende stappen uit voor elk experiment.
- Voor Candida albicans stammen:
- Ontdooi een voorraad flesje en breng 200 µL tot 10 mL Sabouraud dextrose Bouillon in een steriele 50 mL polypropyleen buis met een GLB en cultuur 's nachts bij 30 ° C met agitatie (200 rpm). Vergeet niet om de helling van de buis en het GLB iets openlaten voor een betere ventilatie van de cultuur.
- Voor Cryptococcus neoformans stammen:
- Schraap het bevroren oppervlak van een voorraad flacon. Plaat van de cellen op Sabouraud dextrose agar platen en incubeer gedurende 48 h bij 30 ° C. Na zichtbare groei van geïsoleerde kolonies, de platen in de ijskast (4 ° C) verzegeld met paraffine film voor maximaal 15 dagen te houden.
- Een middelgrote geïsoleerde kolonie van de plaat met een steriel tandenstoker of steriele inoculating lus verzamelen en Sabouraud dextrose Bouillon in een conische buis van steriele 50 mL 10 mL beënten. Incubeer gedurende ongeveer 24 h bij 30 ° C onder agitatie (200 rpm).
- De 24 uur incubatie niet overschrijden. Vergeet niet om de helling van de buis en het GLB iets openlaten voor een betere ventilatie. Het is altijd goed op de standaardisering van de fase van de groei van de cellen vóór elke proef, want dit is een belangrijke factor die van antimicrobiële resistentie.
Opmerking: Beide schimmels bij 30 ° C voor snelle vermeerdering in onze experimenten zijn geteeld, maar de temperatuur kan worden aangepast aan de doelstellingen van de studie, bijvoorbeeld klinische behandeling (37 ° C). Bovenal moet dit eerste incubatietijd worden vooraf vastgesteld voor elke schimmel isolaat en onderhouden in alle tests om de reproduceerbaarheid.
- Voor Candida albicans stammen:
- Na de groei van zwammen, verzamelen de cellen door centrifugeren van de conische buisjes bij 1.200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en voeg toe 10 mL PBS.
- Resuspendeer de cellen en centrifuge weer bij 1.200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Herhaal de PBS wassen en centrifugeren tweemaal meer. Na de derde wash, resuspendeer de cellen in 5 mL (op basis van de grootte van de pellet) 2 X RPMI-1640 voedingsbodem.
- Bereiden 1 mL van een verdunning van het 1:100 of 1:1,000 in een microcentrifuge buis (afhankelijk van de troebelheid van de celsuspensie).
- Aliquot 10 µL met deze tweevoudige verdunning, plaatst u deze in een hemocytometer kamer en tellen het totale aantal cellen in de hoek van de vier kwadranten onder de Microscoop. Bereken de concentratie door de formule: (totaal cel nummer/4) x verdunning factor x 104 (kamer verdunning constant).
- Overwegen een 100% levensvatbaarheid als levensvatbaarheid graven en groei omstandigheden hebben systematisch zijn gecorreleerd voor het isolaat bestudeerd.
Opmerking: De normalisatie en kwaliteitscontrole van de graven van de levensvatbaarheid kunnen worden gedaan door rug-plating in overeenstemming met de Europese Commissie minimaal inhiberende concentratie (MIC) antischimmel, antimicrobiële gevoeligheid testen (EUCAST) methode voor gisten10 . - Als de groei/levensvatbaarheid correlatie is niet vastgesteld voor het isolaat bestudeerde, meten de schimmel levensvatbaarheid door het tellen van levende cellen in een hemocytometer met behulp van kleurstoffen die selectief kleur dode cellen, zoals phloxine B11, trypan-blauw 12, of Janus groen13. De schimmel cellen gebruiken voor dit protocol alleen als de levensvatbaarheid van de bevolking op dit punt 90 is % of hoger.
Opmerking: Dead/alive kleurstoffen kunnen niet goed werken met de schimmel van keuze. Gelieve te testen ze vóór gebruik. De trypan blauwe kleurstof werkt bijvoorbeeld niet goed met C. neoformans.
- Overwegen een 100% levensvatbaarheid als levensvatbaarheid graven en groei omstandigheden hebben systematisch zijn gecorreleerd voor het isolaat bestudeerd.
- Daarna bereiden de schorsingen van de cel in 2 X RPMI-1640 medium (2 X aangepast entmateriaal in RPMI-1640 medium). Overwegen een volume van 5 mL voor elke plaat voor 96-wells-platen.
- Voor alle C. albicans stammen, bereiden een voorraad celsuspensie van 4 x 10-3 cellen/mL. Deze concentratie is 2 X van de concentratie van de laatste cel in elk putje (2 x 103 cellen/mL).
- Voorbereiden voor C. neoformans stammen, een voorraadculturen van cellen 2 x 104 cellen/mL. Deze concentratie is twee keer de laatste cel concentratie in elk putje (1 x 104 cellen/mL).
- Voor andere schimmels, test met een bekende antimycoticum welke concentratie ideaal voor de specifieke studie met betrekking tot de incubatietijd zijn zal. Rekening tijd van het metabolisme en duplicatie van de schimmel.
3. peptides (onbekende Agent)
- Slaan de gelyofiliseerd peptiden bij-20 ° C, en hen in gedeïoniseerd water vóór elk experiment op te lossen. De maximale opslagtijd eenmaal opgelost in water zal afhangen van de aard van elke peptide.
- Bereid hoeveelheden van twee keer de hoogste eindconcentratie getest in de analyse (2 X). In het ideale geval bereiden een klein aantal aliquots met genoeg peptide voor één keer wordt gebruikt om te voorkomen dat cycli bevriezen-ontdooien.
Opmerking: De keuze van de concentratie moet worden gebaseerd op literatuur en de eigenschappen van de peptide. Het is aanbevolen om de seriële verdunningen beginnen met ongeveer 100 µM van de peptide, en vervolgens vergroten of verkleinen deze concentratiebereik afhankelijk van de verkregen resultaten.
4. verwijzing antischimmelmiddelen (positieve controles)
- Voor degenen verdund in water: bereid een 2 X-oplossing van de hoogste concentratie van de analyse (zie sectie 5: antischimmel Assay voor de verdunning stappen).
- Bereid voor C. albicans stammen, een oplossing van 128 µg/mL fluconazol of 128 µg/mL caspofungine. De concentratie van de plaat voor beide zullen 64 µg/mL.
- Bereid voor C. neoformans stammen, een oplossing van 32 µg/mL amfotericine B (in water oplosbare oplossing). De plaat concentratie zullen 16 µg/mL.
Opmerking: Normaal amfotericine B wordt verdund in dimethylsulfoxide (DMSO), aangezien dit anti-schimmel slecht oplosbaar in water is. Er zijn echter in water oplosbare amfotericine B preparaten commercieel beschikbaar.
- Voor antischimmelmiddelen verdund in een organisch oplosmiddel: een 100 X stockoplossing in DMSO bereiden en Verdun het tot 10 X in water voor gebruik.
Opmerking: Dus in de put, de uiteindelijke concentratie van DMSO zal niet meer dan 1%. Een put waar de schimmel in de media met 1% DMSO zoals controle nodig is, gezien het feit dat sommige schimmels geen goed deze concentratie van het oplosmiddel tolereren zal groeien. Vergeet niet dat DMSO lichtgevoelige is, dus de afdekplaat met folie of plaatst u deze in een donkere kamer voor de duur van de incubatietijd.
5. antischimmel Assay
Opmerking: In vitro antischimmel tests zijn uitgevoerd op basis van de Bouillon microdilution gevoeligheid test uit Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren met enkele wijzigingen.
- Maak een tweeledig seriële verdunning van elke peptide en schimmeldodende in 96-Wells polystyreen microplates tot een eindvolume van 50 µL controle.
- Met behulp van een precisiepipet Voeg 100 µL van het antimycoticum/peptide in de 2 X-concentratie van de hoogste gewenste eindconcentratie in kolommen in rij 1-3, A.
- Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 50 µL van steriel water in de andere putten, in rijen B aan H.
- Verwijderen van 50 µL van de putjes met de hoogste concentratie (rij A), overdracht naar het volgende goed van de volgende concentratie (rij B) en meng.
- Herhaal de bovenstaande stappen totdat de put met de laagste concentratie en gooi 50 µL van dit goed (rij H). Laat kolommen 11 en 12 (rijen A, B, C) met uitsluitend water voor blanco-controle of controle van de negatieve/groei.
- 50 µL van de 2 X aangepast entmateriaal in RPMI-1640 medium toevoegen aan elk putje (kolommen 1-3 plus kolom 11 (negatief/groei control)); de uiteindelijke concentratie voor C. albicans zal worden 2 x 103 cellen/mL, en de uiteindelijke concentratie voor C. neoformans stammen 104 cellen/mL zullen.
- Bereiden van lege besturingselementen (50 µL water + 50 µL 2 X RPMI-1640 medium zonder cellen) en negatieve/groei controle (50 µL water + 50 µL aangepast entmateriaal 2 X RPMI-1640 medium zonder schimmeldodende) en lading in de goed plaat zoals beschreven hierboven.
- Herhaal de procedure voor elke verbinding worden getest en de gekozen antischimmel controle (kolommen 4-10).
Opmerking: De seriële verdunningen mogelijk verticaal als het experiment hieronder, of horizontaal in de plaat (dat wil zeggen, als het aantal verdunningen van het gegeven samengestelde/extract dat moet getest worden acht of meer).- Als u verwijst naar de verbindingen, drugs, of onderdelen daarvan zijn lichtgevoelige, uitvoeren van de bepaling in lagere licht, dekking van de platen met folie of plaats in een donkere kamer tijdens incubations.
- Houd rekening met de volgende optionele aanbevelingen.
- Verzegel de plaat met een duidelijke afdekplaat waarmee gasuitwisseling, als dit helpt verdamping verminderen.
- Plaats de plaat in een vochtige kamer; het zal ook helpen verminderen van verdamping.
- Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur of 48 uur voor alle C. albicans stammen, en gedurende 48 uur met 200 rpm schudden voor C. neoformans. De lagere eindvolume (100 µL) zorgt ervoor dat geen spillover optreedt.
Opmerking: Werd geen significant verschil waargenomen tussen MIC lezingen op 24 uur en 48 uur voor C. albicans stammen. Lezingen op 48 uur zijn echter gemakkelijker om te visualiseren. - Observeer alle putjes, met de hulp van een omgekeerde optische Microscoop, voordat de incubatietijd en na om te controleren of veranderingen in de morfologie zo goed te controleren op tekenen van besmetting.
Opmerking: Lezingen kunnen worden gedaan visueel en gefotografeerd aan het einde van het experiment. Vóór elke lezing, meng licht de plaat. Het leest kunnen ook worden uitgevoerd door het meten van de OD op 600 nm, als cel samengeklonterd of filamentation niet worden nageleefd. - De experimenten uitvoeren ten minste driemaal op aparte data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De MIC wordt gedefinieerd als het laagste antimicrobiële samengestelde concentratie dat volledig de groei van de zichtbare zwammen aan het eind van de incubatietijd remt. Aangezien de doelstelling van dit protocol een snelle methode om scherm potentiële antischimmelmiddelen is, elk goed met duidelijke media vergelijkbaar met de lege putten wordt beschouwd als een positief resultaat, overwegende dat een goed met troebelheid analoog aan de negatieve/groei-controleputjes als negatief beschouwd. Echter als er belang bij te weten of een bepaalde AMP schimmelvorming of schimmeldodend is, kan de media van de positieve putten ook verzinkt op Sabouraud Dextrose Agar of gecontroleerd door een andere test van de levensvatbaarheid.
Gezien het feit dat het werkingsmechanisme van een samengestelde roman onbekend is, het is daarom essentieel om te controleren als de referentie antimycoticum binnen het verwachte bereik valt voor de schimmel (selectievakje officiële richtsnoeren, tabellen of gegevens in de literatuur) voor het controleren van isoleren de geteste MIC voor de verbinding (in dit geval een AMP; Figuur 1 en Figuur 2) om te bevestigen dat de omstandigheden ideaal zijn. Als het niet in de gerespecteerde bereik valt, zal moet het experiment opnieuw moet worden uitgevoerd omdat het onmogelijk is om te bepalen of wijzigingen waargenomen uitsluitend het gevolg van de geteste stof zal zijn. Het is even cruciaal voor het observeren van alle putjes onder een optische Microscoop, vóór en na de incubatieperiode om te controleren voor veranderingen in de morfologie en verontreiniging.
Figuur 1. Evaluatie van antischimmel activiteit voor drie peptides tegen Cryptococcus neoformansmet behulp van de bepaling van de microdilution Bouillon. Schimmel concentratie 1 x 104 cellen/mL bedraagt. Drie peptiden werden getest (AMP1, kolommen 1 tot en met 3; AMP2, kolommen 5 tot en met 7; AMP3, kolommen 8 tot en met 10) met concentraties variërend van 100 µM (rij A) tot 0.78 µM (rij H). Controle van de groei en leeg zijn in kolommen 11 en 12, respectievelijk. Het beeld werd verworven met een digitale camera na 48u van incubatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Evaluatie van antischimmel activiteit voor drie peptides tegen Candida albicans met behulp van de bepaling van de microdilution Bouillon. Schimmel concentratie bedraagt 2 x 103 cellen/mL. Drie peptiden werden getest (AMP1, kolommen 1 tot en met 3; AMP2, kolommen 4 tot en met 6; AMP3, kolommen 7 tot en met 9) met concentraties variërend van 100 µM (rij A) tot 0.78 µM (rij H). Controle van de groei en leeg werden opgenomen in de bepaling, maar worden niet weergegeven in de foto. Het beeld werd verworven met een digitale camera na 48u van incubatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Zoals in Figuur 1 en Figuur 2aangegeven, is 48u genoeg tijd om te onderscheiden van de positieve en negatieve wells visueel voor zowel C. neoformans en C. albicans. Het is opmerkelijk dat de resultaten voor C. neoformans 24u werden verkregen eerder dan volgens de richtlijnen van de CSLI zonder de wijzigingen. Voor elke drievoud, de positieve en negatieve put, en daarom de MIC voor elke verbinding, zijn gemakkelijk te onderscheiden. Dit zorgt voor snelle MIC bepaling over meerdere verbindingen evenals wat betreft kiezen welke moleculen verdienste verder onderzoek. Ondertussen, Figuur 3 is een voorbeeld van een slecht resultaat, waarschijnlijk van onjuiste pipetteren tijdens de verdunning stap. Dit kan worden waargenomen in kolom 5, rij C, waar een verschil in groei C. neoformans aanwezig over replicatieonderzoeken (kolommen 5-7 is).
Figuur 3. Voorbeeld van een fout in de technische worden gerepliceerd in een seriële verdunning assay. De afbeelding toont een seriële verdunning van versterkers variërend van 100 µM (rij A) tot 0.78 µM (rij H). Verschillen in de groei C. neoformans aanwezig tussen replicaat-organismen in kolommen zijn 5-7, rij C, waarschijnlijk als gevolg van pipetting fout tijdens verdunning voorbereiding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Wat betreft de interpretatie van de platen, in Figuur 1 is er een antischimmel assay voor drie verschillende versterkers tegen C. neoformans, gelegen in de kolommen 1-3 voor AMP1, kolommen 5-7 voor AMP2 en kolommen 8-10 voor AMP3 met concentraties variërend van 100 µ M (rij A) tot 0.78 µM (rij H). De negatieve/groei besturingselement was geplaatst in kolom 11, rijen A tot C, terwijl de blanco-controle werd geplaatst in kolom 12, rijen A naar C. Voor AMP1 (1-3 van kolommen, rijen A-C) en AMP2 (5-7 van kolommen, rijen A-D), is Let erop dat bij een hogere concentratie van de media doorschijnend en er is geen zichtbare groei. In tegenstelling, bij lagere concentraties de putten zijn ondoorzichtig (1-3 van kolommen, rijen D-H en kolommen rijen 5-7, E-H). Rij C is derhalve bevatten de MIC voor AMP1, terwijl de MIC voor AMP2 in rij D, dat wil zeggen, 25 µM en 12,5 µM, respectievelijk is. AMP3 zal moeten opnieuw worden geëvalueerd, zoals de schimmel in alle concentraties getest groeide. De risicoanalyse voor AMP3 is noodzakelijk om te bepalen van de oorzaak, die zouden kunnen worden dat het testmedium de antischimmel activiteit van de samengestelde, microbiële verontreiniging verstoort, of een hogere weerstand van de schimmel aan de agent getest. Voor de laatste mogelijkheid is het nodig om het concentratiebereik getest. Zoals opgemerkt, de neen-inhibitie en controle putten zijn homogene, dus ze kunnen ook worden beoordeeld door meting van de OD op 600 nm.
Wat voor Figuur 2, werden drie verschillende peptiden getest tegen C. albicans. De microfoons voor AMP1 (kolommen 1-3), AMP2 (kolommen 4-6), en AMP3 (kolommen 7-9) waren 50 µM, 6 µM en 25 µM, respectievelijk. C. albicans, kan als gevolg van filamentation in de incubatietemperatuur, worden waargenomen in klontjes in de neen-inhibitie en controle putten, waardoor het moeilijk te gebruiken OD meting voor de lezing.
Soms is geen groei waargenomen in de putjes. Dit kan worden veroorzaakt door een besmetting van de toxine in de media (in welk geval de groei controles ook blijkt dat er geen groei) of een hogere gevoeligheid voor de agent (in welk geval de groei controles blijkt dat groei). Voor het laatste geval zou een daling in het concentratiebereik dienovereenkomstig, nodig.
| Medium | Voorbereiding | |
| 2 X Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium – 500 mL | 10.4 g RPMI-1640 (aangevuld met L-glutamine en fenol rood; zonder bicarbonaat) | |
| 330 mM 3-(N- morfolino) propaan sulfonzuur (WIPES) | ||
| Verkleinen/vergroten tot pH 7.0 met NaOH | ||
| Steriliseren door filtratie (0,22 µM filter) | ||
| Met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2,7 mM KCl | ||
| 10 mM nb2HPO4 | ||
| 2 mM KH2PO4 | ||
| Autoclaaf bij 121° C gedurende 15 minuten. | ||
| Sabouraud dextrose Bouillon | 15 gram van het poeder in 500 mL gedestilleerd water. | |
| Pas op met NaOH, pH 7,0 | ||
| Autoclaaf bij 121° C gedurende 15 minuten. | ||
| Sabouraud Dextrose Agar | 32.5 g van het poeder in 500 mL gedestilleerd water. | |
| Pas op met NaOH, pH 7,0 | ||
| Autoclaaf bij 121° C gedurende 15 minuten. | ||
Tabel 1. Media en reagens voorbereiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microdilution tests kunnen analyseren van de potentiële antischimmel activiteit van een doel samengesteld met behulp van kleine hoeveelheden van de stof, en tegelijkertijd testen in een aantal uiteenlopende concentraties. Dienovereenkomstig, dit protocol wordt aanbevolen als een eerste stap in de screening voor potentiële nieuwe antischimmel compounds. Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de M27-A3-protocol, in eerste instantie ontworpen om te helpen bij de keuze van antifungale therapie in klinieken, en kan worden aangepast aan een verscheidenheid van nieuwe antischimmel compounds. Globaal, is dit protocol kan richten op de fysisch-chemische eigenschappen van het extract of samengestelde. Bijvoorbeeld lijkt een potentiële kandidaat in de bepaling ten onrechte inefficiënt omdat een stof in de media zijn interactie met de schimmel cel, zoals het effect van RPMI op Histatin 514kan blokkeren. In dit geval is een alternatieve medium voor wanneer de RPMI interfereert, gist stikstof Base (YNB) buffer met MOPS pH 715.
Het protocol kan ook wijzigingen in pre groei voorwaarden, entmateriaal concentratie, incubatietemperatuur, en voor licht-gevoelige onderdelen, zolang de verwijzing antischimmel resultaten binnen het bereik van de richtsnoeren zijn. De referentie antimycoticum moet worden gebaseerd op de huidige therapie voor de geteste schimmel soorten. Bovendien als er een verwijzing samengestelde dat is qua aard aan de potentiële drug- bijvoorbeeld, een bekende antimicrobiële peptide met schimmeldodende activiteit tegen het geteste schimmel model-mag worden gebruikt als een extra verwijzing-besturingselement.
Pre groei voorwaarden kunnen worden gewijzigd om te passen bij de schimmels en onderzoekbehoeften. Zoals in het protocol werden, C. neoformans en C. albicans geteeld bij 30 ° C voor betere vermeerdering. Toch is deze temperatuur wijzigbaar afhankelijk van het metabolisme van schimmels: bijvoorbeeld, Paracoccidioides brasiliensis vereist groei bij 37 ° C om de gist vorm te handhaven, en als gevolg van de trage dubbel tarief, moeten worden gekweekt voor 5-7 dagen. Daarom is het essentieel om te begrijpen van de kenmerken van de schimmel voor een potentiële nieuwe drug testen. Bovendien, de leeftijd en fase van de groei van de gebruikte cellen moeten worden vastgesteld volgens het doel van elk onderzoek en, belangrijker nog, de eerste incubatietijd moet worden vooraf vastgesteld en gehandhaafd in alle tests om de reproduceerbaarheid .
Ook als het samengestelde/extract, de verwijzing schimmeldodende of verdunningsmiddel gevoelig voor licht is, moeten stappen worden toegevoegd om te voorkomen dat de degradatie, zoals werken met minder licht, die betrekking hebben op de platen met folie of plaatsen van de platen in een donkere kamer tijdens incubatie tijden.
Bovendien, het randeffect en de verdamping kunnen worden verminderd met de toevoeging van water in de lege wells, door geen gebruik maakt van de buitenste wells en ze te vullen met water, of door het plaatsen van de plaat in een vochtige kamer.
Een van de belangrijkste beperkingen bij het gebruik van deze methode is de focus op de inhiberende activiteit van een geteste stof, in tegenstelling tot het onderscheid te maken tussen schimmeldodend of schimmelvorming effecten. Niettemin, als het doel een snelle screening van de potentiële nieuwe antimycoticum is, de eerste visuele beoordeling MIC met een duidelijk positieve (' clear/niet-troebelheid' wells) en een negatieve ('troebelheid' wells) resultaat, helpt identificeren verbindingen van belang om te studeren verder, en dus vermindering van de totale kosten van de screening voor nieuwe verbindingen.
Aangezien het werkingsmechanisme van deze nieuwe verbindingen onbekend is, kan ditzelfde protocol worden gebruikt om te bepalen van de compound kunnen remmen of doden schimmel cellen door het toevoegen van een paar extra stappen, zoals de positieve putten plating of met behulp van live/dead kleurstoffen. Andere kleine aanpassingen kunnen worden toegevoegd aan het protocol voor een dambord titratie assay te identificeren van eventuele synergetische effecten van de stof met andere drugs gebruiken.
Hoewel de bepaling van lezing worden doorgaans uitgevoerd door visuele analyse van de groei van zwammen onder verschillende omstandigheden ten opzichte van de groei in de put met geen antimycoticum (negatief/groei control), het kan ook gebeuren door het meten van de OD op 600 nm. Echter, hoewel de OD-meting nauwkeurig voor homogene oplossingen is, sommige schimmels groeien in bosjes dus breken de precisie van de methode – bijvoorbeeld, Candida spp. als gevolg van de filamentation tijdens de incubatieperiode.
Aan de andere kant, is een van de grote voordelen van het protocol beschreven hier, in vergelijking met de CLSI M27-A3-richtsnoeren, dat in rekening beluchting van de media voor niet-fermenteren schimmels, zoals duurt C. neoformans. Daarnaast gebruikt de CLSI richtsnoeren slechts een kleine eerste entmateriaal, waarvoor derhalve een langere incubatietijd voor de groei van zwammen en MIC definitie. Sommige studies hebben aangetoond dat hogere initialen inoculums en schudden van de plaat tijdens de incubatie de antischimmel gevoeligheid tests zonder significante effecten op MIC bepaling16,17 verbeteren. Ons protocol kunt precies bepalen van de MIC voor nieuwe verbindingen tegen C. neoformans in een kortere incubatieperiode, binnen 48u, in vergelijking met 72 h CLSI richtsnoeren voorstelde.
Een ander voordeel is dat ons protocol een eindvolume van 100 µL in plaats van 200 µL aanbevolen richtsnoeren voor CLSI gebruikt, waardoor het bedrag van de geteste nieuwe stof vereist voor de antischimmel assay. Verdamping van externe putten wellicht een bron van zorg, maar oplossingen al beschreven in deze sectie om verdamping kunnen worden gebruikt zonder afbreuk te doen aan de resultaten van de test.
Bovendien, door het uitvoeren van de verdunningen rechtstreeks in de plaat, en dus het omzeilen van de CLSI verdunning richtsnoeren voor het gebruik van microcentrifuge buizen, kunnen meerkanaals pipetten worden gebruikt. De vergadering van dit protocol is minder ingewikkeld dan die in de richtsnoeren van de CLSI, en gebruikt ook minder materialen.
Een kritieke stap aan schimmel cel voorbereiding gerelateerde is het gebruik van cellen die zo vers mogelijk zijn. Het is ook van cruciaal belang voor het uitvoeren van alle testen met de cellen op de dezelfde groeifase, aangezien er verschillende rapporten in de literatuur over de verschillen in de antischimmel gevoeligheid als de cultuur18,19 leeftijden. Een zorgvuldige selectie van referentie stammen is ook essentieel. Een zeer gevoelige of zelden geïsoleerd soorten kan niet leiden tot een duidelijk beeld van het antischimmel potentieel. Evenzo, is het nuttig om te voorkomen dat sub kweken stappen over niet veel variabelen toevoegen aan de test. Bijvoorbeeld voor Candida-stammen (die sneller groeien), we liever mijden de agar plaat stap doordat het entmateriaal rechtstreeks in de vloeibare media.
Vergeet niet dat de fysisch-chemische eigenschappen van het extract of samengestelde te beproeven zijn belangrijk om te overwegen. Bijvoorbeeld: als het extract of samengestelde moet worden opgelost in oplosmiddelen dan water, moet ervoor zorgen dat een passende schimmel groei besturingselement bevat die dezelfde oplosmiddel concentratie met de schimmel alleen. Dit is te garanderen dat elke groeiremming waargenomen niet als gevolg van het oplosmiddel in plaats van de geteste stof of te halen. In dit geval, het zou misschien beter zijn te volgen van de aanbevelingen van de CLSI-M27A3 voor DMSO verdund antifungale geneesmiddelen, zoals de ontbinding van de drug in een concentratie van ten minste 100 keer hoger dan de hoogste geteste concentratie te verminderen van het percentage van het oplosmiddel in de plaat.
Met betrekking tot stabiliteit, is het aanbevolen om het houden van kleine porties van de geanalyseerde extracten of verbindingen. Doordat het volume nodig voor een honkslag assay op de juiste temperatuur, buitensporige manipulatie van het monster en, indien de extracten of verbindingen worden opgeslagen bevroren, cycli bevriezen-ontdooien kunnen worden vermeden.
Ten slotte, een van de meest fundamentele stappen is de nauwkeurigheid van de microplate seriële verdunning, gezien het feit dat elke pipetting fout zal worden doorgegeven langs de opeenvolgende verdunningen. Voortaan, staan Pipetteer precisie en adequate pipetting technieken om de reproduceerbaarheid. Dus, het is noodzakelijk te gebruiken die zijn gekalibreerd pipetten en altijd selectievakje als het volume toegevoegd en verwijderd uit elk putje klopt. Zorg ervoor dat residuen of overblijfsel van de drug niet in de pipet tip blijft. Als de samengestelde neiging vast te houden tot aan de vingertop, is het wellicht beter om over te schakelen tussen de verdunningen tips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de CAPES-Brazilië, CNPq-Brazilië, FAP/DF voor financiële steun. Wij zijn dankbaar aan Dr Hugo Costa Paes voor de herziening van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
