Summary
הפרוטוקול מתאר של assay פשוט לזהות את הזחלים דרוזופילה melanogaster חווים היפוקסיה תחת רמות חמצן אטמוספרי רגיל. פרוטוקול זה מאפשר הזחלים שתקבעו יהיה מכובד של מוטאנטים אחרים שמראים פנוטיפים חופפים כגון והאתרי או צמיחה איטית.
Abstract
מחסור בחמצן בבעלי חיים יכול כתוצאה מחשיפה רמות חמצן אטמוספרי נמוכות או מפני נזק לרקמות פנימיות המפריע בחמצן הפצה. זה גם אפשרי כי התנהגות חריגה של נוירונים חישה חמצן שיכולים לזרז התנהגות היפוקסיה בנוכחות רמות החמצן הרגיל. ב ד melanogaster, פיתוח רמות חמצן נמוכות תוצאות עיכוב של צמיחה ושל התנהגות לאיטי במהלך שלבי זחל. עם זאת, גילויי ויצר גרעון חמצן חופפים במידה ניכרת הפנוטיפים של מוטציות רבות לווסת את הצמיחה, תגובות הלחץ או גפיים. וכתוצאה מכך, אין כרגע אין assay זמין לזהות היפוקסיה הסלולר i) הנגרמת על ידי מוטציה או התנהגות ii) היפוקסיה כאשר המושרה על ידי התנהגות חריגה עצביים.
לאחרונה זיהינו שני בהתנהגויות הייחודי של הזחלים melanogaster ד להתרחש ברמות חמצן נורמלי בתגובה זיהוי פנימי של היפוקסיה. ראשית, בכל שלבי, הזחלים כזה להימנע ומחילות למזון, לעיתים קרובות בסטייה רחוק ממקור המזון. שנית, חופר לתוך תשתית רך, אשר בדרך כלל מתרחשת במהלך השלב השלישי נודד לחלל לחלוטין פוליטי אם הזחלים ובשפתיים. וזמינותו המתוארים כאן נועד לזהות quantitate התנהגויות אלו ובכך לספק דרך לזהות היפוקסיה הנגרם על ידי נזק פנימי ולא חיצוני חמצן נמוכה. Assay צלחות עם תשתית של אגר ותקע המרכזי של שמרים הדבק משמשים לתמיכה חיות דרך החיים זחל. העמדות ואת מצב של הזחלים מתבצע מדי יום כפי שהם המשך הדרך לחלל הראשון עד השלישי. היקף מינהור לתוך תשתית אגר במהלך שלב נודד הוא quantitated לאחר להתגלמות באמצעות NIH ImageJ. וזמינותו יהיה לו ערך בקביעת כאשר היפוקסיה הוא רכיב של הפנוטיפ המוטנטי, ובכך מספקים תובנה אתרים אפשריים הפעולה של הגן המדובר.
Introduction
מערך גנטי כלים הזמינים ב ד melanogaster מתוחכמים לעשות את זה אורגניזם בעל ערך לחקר תהליכים ביולוגיים שנשמרת אבולוציונית. מפתח התגובות זמינות חמצן מולקולרי הוכיחו להיות שמור לאורך האבולוציה, מחקרים קודמים melanogaster ד יצרו תובנות הרכיבים אוניברסלי של אלה איתות המסלולים 1,2, 3,-4,-5,-6.
במסגרת מחקר שמטרתה לנתח פונקצית נוירון חישה melanogaster ד הזחלים, זיהינו שתי תגובות התנהגותיות אשר הוכיח להיות מופעל על ידי רקמת היפוקסיה-רמות חמצן נורמלית 7. באחת מהן, כשל להתחפר מזון, קשורה מאוד בתגובה רמות חמצן נמוכות שדווחו על-ידי Wingrove ו או'פרל 8. הפעולה השנייה, כשל לחפור מנהרה לתוך תשתית רך במהלך לחלל השלישית מאוחר משוטט שלב, לא בעבר זוהה כמו היפוקסיה הקשורות. אנחנו נקבע כי חשיפת פראי סוג הזחלים נודד אל רמות חמצן נמוכות גם מעכב תשתית מינהור 7, ובכך לבסס כי הן התנהגויות אלו מקורן היפוקסיה - גם הנגרם על ידי נזק לרקמות או רמות צריכת החמצן נמוך. כאן נתאר assay שפותחו כדי quantitate שני היפוקסיה-induced התנהגויות אלו, אשר מתחיל עם תצפיות מיד לאחר הבקיעה זחל.
תגובות ובשפתיים זחל בשלבים המוקדמים לא נבדקו בעבר, ולכן ביצוע ניתוח לאורך החיים הזחל הוא מרכיב חשוב של assay שלנו. רוב הביטויים הברורה של היפוקסיה – איטי, המסכן צמיחה ופיתוח והאתרי גינקולוגיות – חופפים עם זחל פנוטיפים המיוצר על ידי מוטציות רבות. אבל מצאנו כי רק השלישי הזחלים לחלל עם היפוקסיה להראות כישלון חרוץ לחפור מנהרה 7. לכן, אנחנו נקבע כי הזחלים אפילו יותר מסובך מבחינת הצמיחה ובאופן יותר הזחלים ובשפתיים שלנו, עדיין לבצע קצת חופר, ואילו הזחלים ובשפתיים מעולם לא חפר 7. עוד ערך יסוד זה וזמינותו היא לפיכך כי זה מספק דרך להקים כאשר היפוקסיה היא המקור אוסף מסוים של פנוטיפים pleiotropic, בניגוד קצת מתח או תקלה מטבוליות אחרות. בתור הדגמה של וזמינותו, כאן אנו מתארים השימוש באפיון את התגובות של הזחלים עם ביטוי והכו אותי מופחתת של uninflatable, גן כי פונקציות ב איירווייז זחל 9.
אנחנו הסתברותיות כי assay הזה יהיה בעל ערך החוקרים העוסקים באפיון פנוטיפים הזחל כוללת התנהגות לאיטי וצמיחה המסכן. כתוצאה מכך, גנים חדשים המשפיעים על הפצה, שימוש או תגובות, יכול להיות מזוהה חמצן בכל הגוף. עוד יותר, שילוב זה וזמינותו מוטציה הקרנת פרוטוקול יספק מסלול ישיר לזיהוי מוטציות המייצרים היפוקסיה. Assay הזה יהיה גם בעל ערך בניתוח המעגלים ולחושים היפוקסיה-induced מולדת ההתנהגויות שתוארו כאן. רשת עצבית ניתוח מסוג זה הוא מוקד הרבה המחקר הנוכחי והיא מערכת העצבים פשוטה של הזחל melanogaster ד מערכת יקר ניקוד את התנהגויות אוטומטיות. מעורב בתפיסה חמצן זחל החישה הניריונים כבר זוהו, מתן צעד ראשון לקראת הגדרת המעגלים מלא תגובות היפוקסיה-induced 10,11. שימוש assay שלנו בשילוב עם נוקאאוט עצבית סלקטיבית באמצעות מערכת GAL4-UAS12 הוא מסלול ברור עבור קווים נוספים מרכיבי הרשת העצבית.
Protocol
1. הכנת הזחלים
- יום שני או יותר לפני תחילת וזמינותו, להגדיר חוצה של הרצוי ניסיוני ולשלוט שילובים (מינימום 20 נקבות וזכרים 10 כל) במנות ביצה-lay כפי שתואר על ידי Wieschaus ו- Nusslein-Volhard 13 אלא באמצעות 50 מ ל פוליפרופילן בקבוקונים ו- 6.0 ס מ חד פעמיים צלחות פטרי המכילה אגר ענבים, ומרוח עם שמרים להדביק רק לפני השימוש. שמור זבובים במנות ביצה-lay החושך בטמפרטורת החדר עד שהוא נדרש.
- מתכון אגר ענבים – 100 מ ל קפוא לשלב 100% ענבים מיץ תרכיז, 350 מ"ל deioinized מים, 5 מ ל קרחוני אצטית ו- 13 g ד melanogaster אגר בתוך זכוכית 1 ליטר. מיקרוגל בפרצים 1-2 דקות, תוך ערבוב בין התפרצויות, עד אגר כל היא התפרקה. מגניב הפתרון לכמה דקות ואז להוסיף 10 מ של 10% (w/v) Nipagen (מתיל-p-hydroxybenzoate) ב- 95% אתנול. לערבב ולאחר מכן פיפטה 7 מ לכל צלחת פטרי 6.0 ס מ חד פעמיות, מאפשרים ג'ל ויבשה בטמפרטורת החדר במשך 3-4 ח' חנות 4 ג 0 בשקיות פלסטיק.
- שמרים להדביק מתכון – 7 גר' יבשים שקדים, יונים 10 מ"ל מים, לערבב עם מרית עד עקביות אחיד.
- הקולקציות מתוזמן ביצה כדי ליצור ניסיוני ולשלוט הזחלים. משתמש חדש, צלחות מרוח שמרים, ענבים, לאסוף ביצים בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות בחשיכה בשעות הבוקר. להסיר את הלוחיות אוסף 4 שעות והחלף צלחות טריים. דגירה הלוחות אוסף 4 שעות בלילה בגיל 25 0C עד אחר הצהריים למחרת, כאשר רוב החרקים יש בקעו. לאסוף את הזחלים לחלל הראשון אלה ולהשתמש בהם כדי להגדיר את הניסוי.
2. הגדרת assay צלחות
- הכנת לוחות וזמינותו. לריצה יחיד של וזמינותו, להכין חמישה assay צלחות כל הזחלים ניסיוני 10 צלחות חמש של הזחלים שליטה 10. השתמש בורר הפקק של 1.5 ס מ להסיר את הליבה המרכזית של אגר כל צלחת ליצור חור בשביל האוכל. לשים רסק שמרים (0.8 - 0.9 g) לתוך החור, לטפוח בעדינות עם מרית כדי להפוך תלולית ממלא את החור.
- הכנת צלחת אגר – לשלב יונים 700 מ"ל מים עם 16 גרם אגר melanogaster ד ב גביע זכוכית 2 ל', במיקרוגל ל 5 דק הסרה של מיקרוגל ומערבבים עם מוט זכוכית אגר undissolved להכניס הפתרון. להוסיף מ 17.5 ל 10% (w/v) Nipagen 95% אתנול, מיקס, ולאחר מכן להמשיך חימום במיקרוגל בפרצים s 30 ולאחריו תוך ערבוב, עד אגר כל היא התפרקה לחלוטין. מגניב במשך דקה או שתיים, ואז פיפטה aliquots 15 mL פטרי פלסטיק 10 ס מ. לאפשר אגר ג'ל, לכסות את הלוחות בשלמותם ולתת להם יבש בטמפרטורת החדר לכמה שעות או למשך הלילה. חנות צלחות בשקיות פלסטיק אטום-18 מעלות צלזיוס.
הערה 1: כדי למנוע היווצרות גבישים Nipagen על פני הלוחות עקב עודף dessiccation, השתמש צלחות תוך מספר ימים של הכנה. במידת הצורך, קריסטלים להיות מומס מחדש על ידי הטלת כמה microliters של אלכוהול 95% לעברם.
הערה 2: אצוות של אגר יכול שיש לה מאפיינים שונים ג'לי. הלוחות ג'ל יבש צריך להיות מוצק למגע מספיק גמיש מעגל נקי, ללא פגע אגר יכול יוסרו בעת שימוש בורר את הפקק ליצירת החור מזון (ראה לעיל). - הגדרת הזחלים בתוך צלחות וזמינותו. השתמש לחץ מכני עקומת קצה microspatula פלסטיק, טובלים הקצה של שמרים הדבק כדי לספק "דבק" לאסוף את הזחלים. לאסוף את הזחלים לחלל הראשון בנפרד ומניחים בצלחת אגר קרוב התל מזון. להכין לפחות חמישה לוחות שכפל של הזחלים 10 עבור שנינו ניסיוני, שליטה אחרים. עם סיום, קאפ, תווית כל צלחת, הניח את הצלחות (צד המכסה למעלה) במקום חשוך בטמפרטורת החדר (במעבדה שלנו זה 22 ° C).
3. פיקוח על צלחות assay
- לבחון צלחות מדי יום תחת מיקרוסקופ ויבתר ולהקליט את המספר של הזחלים על האוכל, או בחוץ על פני השטח אגר. הערה כל הזחלים גלוי מת או גוסס. שימו לב, אם וכאשר, מינהור לתוך תשתית אגר נראה כי הזחלים להעביר לתוך לחלל השלישי. הערה תאריכים שבהם הגלמים מתחילים להיווצר ושים לב חריגות הגולמי. המשך מדי יום עד כל הזחלים מת או pupated.
- הסר הגלמים בזהירות לצלחת עם נטייה להקניט המחט והעברתן ל צלחת ענבים. אם רצונך בכך, המשך ניטור הגלמים כדי לקבוע כמה eclose כמבוגרים.
4. הכנת assay לוחות עבור הדמיה
- בזהירות להסיר ולמחוק את כל האוכל השמרים. מהבאר המרכזי של כל צלחת.
- בעדינות להציף כל צלחת עם מים מהברז ולהשתמש המכחול של אמן רך כדי להימרח היטב פסולת זה יש כבר מסומנים על גבי המשטח אגר. להחליף את המים מספר פעמים ולהמשיך צחצוח עדין עד שהלוח נקי לחלוטין. תן צלחות שטיפה סופית עם מים יונים, קאפ אותם ולהשאיר בטמפרטורת החדר לילה יבש.
הערה: מינהור לתוך אגר הוא האינטנסיבי ביותר סביב התל מזון (ראה איור 2). כתוצאה מכך, שפת הבור מזון בדרך כלל מורחב מעבר לקוטר הראשוני 1.5 ס מ. בנוסף, השבריריות של אגר עבד באזור זה עלולה לגרום חתיכות קטנות של אגר tunneled יאבד מן ההיקף של החור במהלך הניקוי. הגדלת ריכוז אגר ג'ל יכול לעזור עם בעיות אלה, אך תיקונים אפשריים במהלך השלבים כימות התמונה J (ראו להלן).
5. כימות של מנהרות
- תמונה את הצלחות. להכין תמונה של כל צלחת שצולמו על רקע שחור מראה את המנהרות באגר שורות לבן בהיר.
הערה: אנו משתמשים במערכת נפוץ לשיקוף DNA ג'לים בשלב זה (ראה טבלה של חומרים, ריאגנטים). יכולה להיות מכוונת חלופית מערכות המסוגלות לייצר קבצי tiff, כגון מצלמות דיגיטליות או מצלמות הפלאפון הדמיה כדי להפיק תמונות מתאימות. - השתמש בתוכנית הציבור NIH התמונה J כדי quantitate מינהור זחל. להוריד את התוכנית מ- http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. לקבלת מידע נוסף אודות התוכנית ללכת http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html.
הערה: מערכות הדמיה אחרות יכול לשמש כדי quantitate tunneling. ההוראות שלהלן חלות NIH תמונה ג' - לאחר פתיחת תמונת קובץ tiff של צלחת מנהור, השתמש בכלי אליפסה להגדרת אזור עבור כימות מייצג את פני השטח כולו אגר, אך גידולי את קצה הפלסטיק של הצלחת.
- להחיל את סף אוטומטי כדי להפיק תמונה הפוכה של הצלחת, עם המנהרות מציג כמו קווים שחורים. השתמש בדוגם הצבע כלי מברשת צבע לבן יש אזורים שחורים המייצגים נזק אגר מאשר מנהרות.
- תחת התפריט הנפתח נתח , בחר קנה מידה סט | לחץ כדי להסיר מידה ולאחר מכן בחלון לקבוע מידות (גם תחת נתח), בדוק את האזור ואת מגבלת לסף.
- הקש על מקש Cntrl + מקש מ ' הצג אזור שחור (מנהרות) בפיקסלים.
- העתק והדבק ערך הפיקסל של כל צלחת הוא לתוכנית גליונות אלקטרוניים (כגון Excel) אשר יאפשרו אנליזה כמותית.
- החור המרכזי בדרך כלל מורחב עקב מינהור אינטנסיבי באזור זה. כדי quantitate את החסר מינהור, בטל "הגבלת לסף" והשתמש בכלי מטה כדי להגדיר החור המרכזי. הקש על מקש Cntrl + מקש מ כדי לקבל את ערך הפיקסל של אזור זה. להחסיר מהערך הזה את ערך הפיקסל של חור 1.5 ס מ ומוסיפים את ההבדל לערך מינהור שהושג בשלב 5.6.
- עבור כמה צלחות, החור המרכזי אולי חסר חתיכה של אגר tunneled הכולל אזור הסמוך לחור untunneled אגר. כאשר quantitating החור המרכזי לשימוש לוחות אלה דוגם הצבע ואת צבע מברשת כלים כדי להוסיף פס שחור ברחבי האזור החסר כדי להגדיר את אזור tunneled או לא לכלול אזור שאינו חפר מ כימות.
הערה 1: אם הזחלים ניסיוני לבצע tunneling כלשהו, כימות זה מאפשר חישוב של ממוצע מינהור סטים של צלחות, השוואה סטטיסטית של שליטה וערכי ניסיוני.
Representative Results
כמו הפגנה של הערך הזה assay השתמשנו בו כדי לחקור היפוקסיה פוטנציאליים ב הזחלים עם תפקוד לקוי של הגן uninflatable (uif) ב- tracheae. uif מקודד של טראנסממברנלי גדול זה מתבטא בחריפות על-פני התאים והכו אותי זחל הפסגה. מוטציות של uif נרשמו בעבר שהפגינו התנהגות סוטה יכול להצביע על רקמות היפוקסיה עקב תקלה והכו אותי 9. אנו במיוחד דיכאו uif ביטוי לקנה זחל באמצעות מערכת Gal4-UAS. Gal4 שתי שורות שימשו: i) עד כלות הנשימה (btl)-Gal4, הבאה לידי ביטוי חזק tracheae מתחילת שלהם התפתחות עובריים ו- ii) לחתוך(מורה)-Gal4, אשר מתחיל בביטוי באזור האחורי קטן של tracheae הראשי המטען הגבי בסוף מופרה וממשיך ביטוי חזק באזור זה לאורך כל החיים זחל 7. UAS -uif RNAi קו הושג מן המרכז לחקר דרוזופילה וינה (VDRC ID #1050).
כפי שתואר לעיל בפרוטוקול, חמש לשכפל את צלחות בימיו לחלל הראשון הזחלים הוגדר עבור כל אחד ארבעה צלבים כדלקמן.
ניסוי 1
1) בקרת 1 - לחתוך(מורה)-Gal4 x קנטון-S (+)
2) ניסיונית 1 - לחתוך(מורה)-Gal4 x UAS-uif RNAi
ניסוי 2
3) שליטה 2 - btl-Gal4 x קנטון-S (+)
נסיוני 4) 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
ההתנהגות של חתך(מורה)-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים של ניסוי 1 היה דומה לזה של הבקרה לחתוך(מורה)-Gal4 > + חיות ומחילות, מינהור, מהישרדות להתגלמות, (איור 1 , איור 2). לעומת זאת, הביטוי uif מווסת למטה לאורך כל מערכת הנשימה כולו מן מוקדם בהתפתחות (ניסוי 2) הפיק תגובות שונה במידה ניכרת. Btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים מוצגים שני ביטויים התנהגותיים של רקמות היפוקסיה – צמצום המזון ומחילות, העדר מוחלט של תשתית מינהור בהמשך חייו זחל (איור 1 , איור 2 ). הזחלים ניסיוני היו גם ניכר קטנות, דק יותר וכבד יותר מאשר פקדים (איור 3), הראו שיעור גבוה של מוות במהלך וזמינותו. כפי שצוין לעיל, צמיחה מופחתת, והאתרי ומוות organismal ידועים סימפטומים של היפוקסיה זחל. בנוסף, רוב הזחלים ניסיוני נכשל ניסיון להתגלמות ונשארתי instar כמו השלישי הזחלים ארוך לאחר שליטה הזחלים היה pupated. הזחלים קצת שרדו יותר מ 15 ימים לפני בסופו של דבר למות בלי מאבריה (איור 1 א'). כמה מן הזחלים ניסיוני pupate אבל בכל המקרים חריגים הגלמים נוצרו היוצרים לא מבוגרים בת קיימא.
איור 1. כימות של מזון ומחילות זחל ופיתוח.
(א) אחוז הזחלים חיים מחוץ תלים מזון עבור אחרים ארבע למד כאן. ממוצעים עבור לוחות assay חמש המשמש עבור כל גנוטיפ מוצגים. ביום 3 לאחר הבקיעה, ~ 70% btl-Gal4 > UAS uif RNAi הזחלים היו מחוץ האוכל, ואילו הזחלים לא אותרו בחוץ האוכל או על פני השטח אגר על אחרים שלושה אחרים. Btl-Gal4 > UAS uif RNAi הזחלים למות לאט בין ימים 4-20, עם ~ 15% מהם עדיין חי 15 ימים לאחר הבקיעה. החץ השחור לאורך ציר x כאן, ב (B) מציין את היום שבו כל הזחלים של שלושה אחרים אחרים היו pupated.
(ב) אחוז גלוי בחוץ המזון אחרים ארבעה מתים הזחלים. ממוצעים עבור לוחות assay חמש עבור כל גנוטיפ מוצגים. מת btl-Gal4 > UAS uif RNAi הזחלים לצבור לאורך זמן עם רוב גוסס בחוץ האוכל. אחרים אחרים כל לשרוד עד להתגלמות
(ג) אחוז ההישרדות כדי להתגלמות עבור אחרים ארבע למד. ממוצעים עבור לוחות assay חמש עבור כל גנוטיפ מוצגים. אין גלמים נורמלי של btl-Gal4 > UAS uif RNAi גנוטיפ הופקו. קווי שגיאה לאורך כל דמות מייצגים SEMs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. כימות של מנהרות זחל.
(א) דוגמאות של הלוחות assay עבור כל ארבעה אחרים למד לאחר הכנה מינהור כימות. הערה העדר מינהור עבור btl-Gal4 > UAS uif RNAi הזחלים. צלחות assay הן צלחות פטרי 10 ס מ.
(ב) מינהור כימות נגזר J תמונה עבור אחרים ארבע. ממוצע ערכי פיקסלים עבור לוחות assay חמש עבור כל גנוטיפ. אין מנהרות מתחת נצפתה עבור btl-Gal4 > UAS uif RNAi הזחלים. קווי שגיאה = SEMs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. השוואה של btl-Gal4 > UAS uif RNAi, btl-Gal4 > + הזחלים
הזחלים גיל דומה (יום 6 לאחר הבקיעה) עבור btl-Gal4 > UAS uif RNAi (א) ו- btl-Gal4 > + (ב) אחרים. חצים אדומים הצבע tracheae המטען הגבי. שניהם הזחלים עם תמונה בהגדלה אותו. סרגל קנה מידה = 0.5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
הוצגו כאן וזמינותו פשוטה שנועדה לזהות רקמת היפוקסיה melanogaster ד הזחלים. האבחנה מתבססת על ומחילות ירד לתוך המזון תלים מוקדם בחיים זחל ואת העדר תשתית מינהור בשלב מאוחר בחייו זחל. הצפיפות זחל יכול לגרום העברה מוקדמת מן מקור מזון, ובכך היבט קריטי אחד של וזמינותו היא כי מספר קטן של הזחלים הם לבדיקה בנוכחות עודפי מזון גדול. הכללת פטריות מתיל-p הידרוקסיל בנזואט (Nipagen) לתוך הצלחות אגר חיוני גם כדי למנוע צמיחה של עובש במהלך וזמינותו.
אנו מוצאים כי הלוחות אגר יכול להיות מקור ההשתנות ב וזמינותו. בדרך כלל, הזחלים של גנוטיפ באותה, קבוצות שונות של ההורים, או אוספים שונים של הזחלים, הצג וריאציה מוגבלת יחסית ההתנהגות שלהם וזמינותו. לעומת זאת, פלטות אגר עשוי בימים שונים או עם קבוצות שונות של אגר יכולות להניב הבדלים tunneling. התנאי אחת ולכן הוא פקד זה, הזחלים ניסיוני צריך כל להיבדק באמצעות פלטות אגר מהכנת אצווה אותו. אגר מיצרנים שונים או אפילו משלוחים של ייצור זהה יכול להשתנות כוחם ג'לי, אז ייתכן צורך התאם הריכוז אגר כלפי מעלה מ- 2.2% משמשת כאן להשגת ג'ל של האופטימלית. מצאנו כי הזחלים פראי סוג יכול בקלות קודחים חור אגר 3% מוצקים.
על מנת להדגים את הערך של זה וזמינותו, השתמשנו בו כדי לחקור היפוקסיה רקמות פוטנציאליים ב הזחלים עם הפונקציה מודחקים של uninflatable , tracheae. הממצאים שלנו מספקים תמיכה חזקה ההשערה כי אובדן הנשימה ביטוי של גן זה יכול לייצר היפוקסיה: btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים הראה כשל להתחפר מזון, העדר תשתית מינהור במהלך לחלל השלישי. במחקרים קודמים שלנו של אחרים אחרים, הבחנו כי היפוקסיה-induced אובדן של מזון ומחילות אינו מוחלט כמו אובדן של מנהרות תשתית על btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים למד כאן התנהגו באופן דומה. הרכיב מינהור כושל של assay הזה מספק לכן הסימן החזק ביותר של היפוקסיה.
למרות btl-Gal4 > uif RNAi הזחלים הראו תכונות התנהגותיות האבחון של היפוקסיה, חתך(מורה)-Gal4 > UAS -uif RNAi לא מוצג ליקויים אלה. Btl , לחתוך(מורה) Gal4 נהגים באים לידי ביטוי בשלבים שונים, ובשנת דפוסים שונים, בתוך tracheae הזחל. Btl-נהג Gal4 בא לידי ביטוי לאורך כל מערכת הנשימה החל מהתפתחותו ב מופרה והמשך דרך החיים זחל. לעומת זאת, ביטוי Gal4 מ חתך(מורה)-Gal4 רק מתחיל בסוף החיים מתחלקים, לאחר מורפוגנזה של tracheae, ונהג מוגבל לסעיפים האחורי הקיצוני של גזעי הגבי, כלי האורך העיקריים של מערכת הנשימה. uif נוקאאוט עם הקו הזה Gal4 לא ייתכן לכן להפחית uif ביטוי מספיק מוקדם או רחבה מספיק כדי לייצר כמה רמת סף של היפוקסיה נדרש כדי להפעיל את ההתנהגויות נמדד זה וזמינותו.
מחקר קודם מצא כי הזחלים לחלל השלישי שנחשפו לרמות נמוכות של חמצן (10%) להראות צמיחה ירידה ועיכוב היווצרות pupariation 14. Btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים למד פה התקדם לחלל השלישי, אבל ההשפעות על שיעורי הצמיחה, להתגלמות שלהן היו יותר מבוטא: הם היו קטן יותר פקדים עם מעט מאוד רקמות שומן מתחת האפידרמיס (איור 3), רק שבריר קטן (~ 10%) ניסיון pupariation. הבדלים אלה מראים את btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים חווה מידה רבה יותר של היפוקסיה, משום uif נוקאאוט ב tracheae היה נוכח במהלך כל חייהם זחל, או משום זה מיוצר יותר מחסור בחמצן חמור ב לחלל השלישי. איך אובדן התפקוד uif tracheae עשוי למנוע העברת החמצן אינה ברורה בשלב זה. Tracheae של btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים היו גלויות דרך הקוטיקולה (איור 3), מעיד כי הם הכיל אוויר, לא נפגעו לנקודת הכניסה נוזלים שנפרצו פונקציה. לכן אפשרי באופן רשמי כי הנזק והכו אותי שנוצרו על-ידי אובדן התפקוד uif לא זכה היפוקסיה אבל מעדיף קצת אחרים מום זה מעכב tunneling. עבור אחרים למד בעבר, קבענו כי כשל לחפור מנהרה קשורה עם רמות גבוהות של LDH mRNA7, מחוון הקנוני של היפוקסיה גליקוליזה מאוחר השלישי לחלל הזחלים 15. לפיכך, אישור סופי של היפוקסיה עבור btl-Gal4 > UAS -uif הזחלים RNAi (וגם בהזחלים בחן בעתיד שימוש assay הזה) מערבת RT-PCR כדי להעריך את רמות ה-mRNA LDH או השימוש מחוון זמינים מסחרית כדי למדוד רמות החמצן תאיים (לדוגמה ראה 16).
Disclosures
המחברים מצהירים שיש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
קארן מ' Qiang היה 2016 זוכת פרס מחקר Schroepfer של ג'יי. ג'ורג ' באוניברסיטת רייס. ג'ואו Fanli היא זוכת מלגת לימוד מאוניברסיטת אורז. השירותים של המרכז מניות דרוזופילה בלומינגטון, המתקן הרווארד הטיול, מרכז המשאבים דרוזופילה וינה בתודה הם הכירו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
References
- O'Farrell, P. H. Conserved responses to oxygen deprivation. J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).
- Lavista-Llanos, S., et al. Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar. Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).
- Reiling, J. H., Hafen, E. The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster. Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).
- Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates. J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).
- Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective. Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).
- Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade. Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).
- Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae. PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).
- Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster. Cell. 98 (1), 105-114 (1999).
- Zhang, L., Ward, R. E. Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster. Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).
- Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster. J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).
- Morton, D. B. Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae. Fly. 5 (2), 119-125 (2011).
- Brand, A., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C. Looking at embryos. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press. Oxford and Washington DC. 199-227 (1986).
- Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster. J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).
- Li, Y., et al. Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster. PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).
- Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark. Scient. Rep. 5 (9061), (2015).
