Summary
Denne protokol beskriver i detaljer hvordan at fabrikere og drive mikrofluid enheder til røntgen diffraktion dataindsamling ved stuetemperatur. Desuden, den beskriver hvordan man kan overvåge protein krystallisering af dynamisk lysspredning og hvordan til at behandle og analysere opnået diffraktion data.
Abstract
Denne protokol beskriver opdigte mikrofluid enheder med lav X-ray baggrund optimeret for goniometer baseret fast mål seriel krystallografi. Enhederne er mønstret fra epoxy lim. ved hjælp af bløde litografi og egner sig til i situ røntgen diffraktion eksperimenter ved stuetemperatur. Prøven brønde er låg på begge sider med polymere polyimid folie windows, der tillader diffraktion dataindsamling med lav X-ray baggrund. Denne fabrikation metode er krævende og billig. Efter indkøb af en SU-8 master wafer, kan alle fabrikation fuldføres uden for et renrum i en typisk research laboratoriemiljø. Chip design og fabrikation protokollen udnytte kapillær ventilfunktionen til microfluidically delt en vandig reaktion i definerede nanoliter størrelse dråber. Denne ladning mekanisme forhindrer prøven tab fra kanal døde-volumen og kan nemt udføres manuelt uden at bruge pumper eller andet udstyr til væske aktivering. Vi beskriver, hvordan isolerede nanoliter størrelse dråber protein løsning kan være overvåget i situ af dynamiske lys spredning til kontrol protein krystal Nukleering og vækst. Efter passende krystaller er vokset, kan komplet røntgen diffraktion datasæt indsamles ved hjælp af goniometer baseret i situ faste mål seriel uorganisk kemi ved stuetemperatur. Protokollen indeholder brugerdefinerede scripts til at behandle diffraktion datasæt ved hjælp af en suite af softwareværktøjer til at løse og forfine protein krystalstruktur. Denne metode undgår de artefakter muligvis induceret under cryo-bevarelse eller manuel krystal håndtering i konventionelle krystallografi eksperimenter. Vi præsentere og sammenligne tre proteinstrukturer, som blev løst ved hjælp af små krystaller med dimensioner på ca 10-20 µm vokset i chip. Af crystallizing og diffracting i situ, håndtering og dermed mekaniske forstyrrelser af skrøbelige krystaller er minimeret. Protokollen detaljer om, hvordan til at fabrikere en brugerdefineret X-ray gennemsigtige mikrofluid chip egnet til i situ seriel krystallografi. Som næsten alle crystal kan bruges til indsamling af diffraktion, er disse mikrofluid chips en meget effektiv krystal leveringsmetode.
Introduction
At kende 3D-struktur af en protein er vigtigt at forstå dens funktionalitet. I nærheden af atomic opløsning strukturer er hidtil oftest fremstillet ved røntgenkrystallografi. Denne teknik udsætter protein krystaller til X-ray stråling og de resulterende diffraktion mønstre er derefter analyseret for struktur beslutsomhed og raffinement. I traditionelle røntgenkrystallografi registreres en komplet diffraktion datasæt fra en enkelt, ideelt store, krystal på kryogene temperaturer. Sådanne krystaller, er dog for det meste ikke trivielt at vokse, og til at identificere egnede cryo-bevarelse betingelser kan blive udfordrende i sig selv og kan undertiden også forårsage afvigelser fra nativt protein struktur5.
Seneste teknologiske fremskridt inden for X-ray fri-elektron laser (FEL) og synkrotron beamlines har lov til at løse strukturer fra mindre krystaller, som nye mikro-fokusering beamlines, øget X-ray stråle glans, og forbedret røntgendetektorer blev tilgængelige6,7. Små krystaller er typisk lettere at dyrke end store og defekt frie krystaller8,9. Men små krystaller lider af X-ray strålingsskader meget hurtigere end store krystaller. Dette er fordi i forhold til en stor krystal, en højere X-ray dosis skal være projiceret ind i en mindre krystal volumen til diffract til sammenlignelige opløsning. Selv kryogene beskyttelse er derfor ofte ikke tilstrækkelig til at optage et komplet diffraktion datasæt fra en enkelt microcrystal.
For at overvinde denne forhindring, er seriel krystallografi blevet metoden til at samle og flette diffraktion mønstre fra mange tilfældigt orienterede microcrystals at opnå en komplet datasæt. Stråling induceret krystal skader er minimeret ved at sprede den samlede X-ray dosis anvendes til at løse et protein struktur over et stort antal krystaller5,10. I en ' diffract før ødelægge ' FEL eksperiment, hver crystal bruges kun til én eksponering ved hjælp af femtosekund sekund X-ray pulser. Mikro-fokus beamlines på tredje generation synkrotron kilder kan igen udføre seriel krystallografi med et par millisekund kort X-ray engagementer11,12,13,14. Uden en krystal svingning eller rotation under dataindsamling, dog kun delvis Bragg refleksioner kan registreres og dermed titusinder eller mere diffraktion mønstre er typisk kræves for struktur bestemmelse15. Til dato har er et mangfoldigt sæt af prøven leveringsmetoder blevet udviklet for serielle krystallografi, som for nylig gennemgik14,16,17,18,19. Blandt dem, flere faste-målet baseret prøve levering strategier blev med held kombineret med krystal rotation under X-ray engagementer så betydeligt færre diffraktion mønstre kan give lige så komplette datasæt samtidig også forbruge mindre prøven i forhold til klassisk serie krystallografi eksperimenter hvor stillbillederne er registreret7,16,20,21,22,23 , 24.
Vi præsenterer en protokol til at fabrikere mikrofluid enheder med lav X-ray baggrund. Enhederne er mønstret fra 5-minutters epoxy lim. ved hjælp af bløde litografi og er velegnet til in situ røntgen diffraktion eksperimenter ved stuetemperatur, drage fordel af integrere prøveforberedelsen direkte i X-ray set-up, som tilfældet med tidsopløst undersøgelser, der følger blanding-induceret kinetik18,19. Mikrofluid kanaler er låg på begge sider med polymere polyimid folie, hvilket resulterer i X-ray windows med en samlet tykkelse på ca. 16 µm, der giver mulighed for lav røntgenoptagelser baggrund. Alle anvendte materialer giver god solvent modstand. Denne fabrikation metode er forholdsvis enkel og billig. Efter indkøb af en SU-8 master wafer, kan alle fabrikation fuldføres uden for et renrum i en typisk research lab indstilling.
I et ansøgning eksempel beskriver vi chips for goniometer baseret fast mål seriel krystallografi. Første diskuteres design og fabrikation overvejelser for brug af kapillar ventilfunktionen til microfluidically delt en vandig reaktion i en række udvalgte nanoliter størrelse dråber. Denne ladning mekanisme forhindrer prøven tab fra kanal døde-volumen og opdeling kan nemt udføres manuelt uden at bruge pumper eller andet udstyr til væske aktivering. Sådan isoleret nanoliter størrelse dråber af protein løsning er overvåget i situ ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) til kontrol protein krystal Nukleering og vækst. Det er tidligere påvist, at DLS målinger kan udføres i mikrofluid enheder bestående af en Polydimethylsiloxan (PDMS) struktur, bundet til et glas dias25,26. Fordi polyimid lag har en høj transmission for bølgelængder længere end 550 nm, metoden kan udvides til målinger i X-ray gennemsigtige chips, når du bruger en passende laser bølgelængde27,28. Baseret på DLS resultater, indledende Nukleering kan iagttages, og yderligere droplet fordampning kan stoppes for at opnå færre men større protein krystaller.
Efter tilstrækkelig krystaller er vokset, kan komplet røntgen diffraktion datasæt derefter indsamles ved hjælp af goniometer baseret i situ faste mål seriel uorganisk kemi ved stuetemperatur. Diffraktion datasæt behandles ved hjælp af en suite af software-værktøjer og brugerdefinerede scripts til at løse protein krystalstruktur. Denne teknik undgår artefakter ofte induceret under cryo-bevarelse konventionelle krystallografi forsøgsdyr.
Vi sammenligner tre protein target strukturer, der blev løst ved hjælp af om 10-20 µm små krystaller vokset i chip til bedre derefter 2 Å opløsning. Af crystallizing og diffracting i situ, håndtering og dermed mekaniske forstyrrelser af skrøbelige krystaller er minimeret. Denne protokol kan anvendes for protein krystaller, som diffract til høj opløsning samt lav opløsning (1,7 Å til 3.0 Å). Som næsten alle crystal kan bruges til diffraktion, er lille stikprøve spildt, hvilket gør dette til en meget effektiv krystal leveringsmetode.
Denne protokol indeholder en detaljeret vejledning i at forberede i situ protein krystallisering og diffraktion dataindsamling X-ray gennemsigtige mikrofluid chips. Proceduren var omhyggeligt designet til at drage fordel af mikrofluid præcision uden at det kræver avanceret udstyr i laboratoriet. Også, dataindsamling på synkrotron beamline kan udføres uden at det kræver en specialiseret goniometer eller luftfugter at lette reproducere resultaterne af ikke-eksperter. Den præsenteres teknik kan anvendes til seriel millisekund krystallografi dataindsamling ved stuetemperatur samtidig med at stråling skaden minimal og uden at indføre stress til krystallerne efter vækst af cryo-beskyttelse eller krystal håndtering. Den beskrevne metode er derfor velegnet til ethvert protein krystallisering projekt.
Protocol
1. hak Design og Master fabrikation
- Maske design
- Skitsere ønskede kanal geometrier ved hjælp af en egnet CAD tegneprogram. For hver photoresist lag, udarbejde en individuel maske. Alle mønstre anvendes i denne protokol er drøftet i detaljer i afsnittet resultater og er tilgængelige som AutoCad '. DWG' format i supplerende fil 1.
Bemærk: For at opbygge all-PDMS enheder, kanal højde og bredde højde-breddeforhold bør ikke overstige 1:10 for at forhindre kanal sammenbrud. Både polyimid folie og hærdet epoxyharpiks er mere robuste og principielt bør tillade også højere aspektforhold. Dog, vi med vilje ikke overstige 1:10 forhold, så det indledende design kunne afprøves som traditionelle PDMS enheder. - Oversætte CAD-filer til emulsion film komponeneter. Brug en nominel 64 k DPI opløsning til at tillade præcise funktioner ned til omkring 5 µm størrelse.
Bemærk: Dette kan gøres gennem en forretningsmæssig tjeneste. Imaging services kan foretrække forskellige tegning konventioner at strømline filkonvertering for maske billeddannelse. Spørg, om de foretrukne tegning konventioner på forhånd at undgå besværlig fejlfinding under konverteringen. Masker med gennemsigtige funktioner på sort baggrund vil mønster SU8 photoresist funktioner på wafer til at give funktionel PDMS microchannels under replika støbning. Til gengæld sort funktioner på gennemsigtig baggrund masker er nødvendig for at forberede PDMS forme egnet til X-ray chip fabrikation. Vi anbefaler bestilling begge maske polariteter at muliggøre tidlig prototyping og design validering til at fabrikere PDMS enheder før omsætte X-ray chips design.
- Skitsere ønskede kanal geometrier ved hjælp af en egnet CAD tegneprogram. For hver photoresist lag, udarbejde en individuel maske. Alle mønstre anvendes i denne protokol er drøftet i detaljer i afsnittet resultater og er tilgængelige som AutoCad '. DWG' format i supplerende fil 1.
- SU8 master fabrikation
Bemærk: Dette er den eneste proces, der skal udføres i et renrum. Hvis kritiske renrum udstyr ikke er tilgængelig, kan det komplette trin blive outsourcet til MEMS støberi servicevirksomheder, der leverer klar mønstrede SU8 masters. Processen SU8 ifølge data sheet instruktion. Trin 1.2.1 til 1.2.4 opsummere generelle SU8 master fabrikation arbejdsprocessen, med komplet parametre for de tre-lags X-ray chip design der er anført i tabel 1. En introduktion til multi-lag SU8 justering har været offentliggjort tidligere29.- Hæld ca. 1 mL SU8 modstå på 3 tommer wafer og spin pelsen SU8 ned til den ønskede tykkelse ved hjælp af passende spin hastighed og tid som angivet i tabel 1 (figur 1, trin 1). Pre bage photoresist ifølge lagtykkelse på 65 ° C og 95 ° C i et par minutter. Udføre pre-bage for at størkne SU8 at forhindre det holder sig til photomask og forbedre modstå vedhæftning til underlaget (figur 1, trin 2).
- Udsætte photoresist for UV-lys som angivet i tabel 1 efterfulgt af en post-exposure-Bages ved 95 ° C til katalytisk fuldføre den photoreaction, der er indledt under eksponering (figur 1, trin 3).
- Gentag disse trin for hver efterfølgende lag. Derefter justere komponeneter af det efterfølgende lag med master ved hjælp af en maske aligner og Vernier caliper justering mærker29.
- Vaske væk alle ueksponeret SU8 modstå ved at udvikle wafer i propylenglycol methyl ether acetat (PGMEA), indtil isopropanol skylning ikke længere afslører mælkeagtig nedbør (figur 1, trin 4). Tørre wafer med trykisoleret kvælstof.
Bemærk: Isopropanol er en dårlig opløsningsmiddel for SU8 og dens nedbør angiver resterende uhærdet resterne.
- PDMS skimmel fabrikation
- Placer et stykke aluminiumsfolie (15 × 15 cm) i en petriskål (10 cm) og placere SU8 master på alufolie i petriskålen til nem fjernelse af master efter PDMS hærdning.
- Bland silikone base med hærdning agent (10:1), hvilket resulterer i et samlet beløb på 25 g, energisk med en spatel i en krukke eller en mekanisk mixer. En 3 tommer wafer i en petriskål (10 cm) forbruger ca. 25 g PDMS at resultere i en 5 mm tyk plade.
- Hæld færdigblandede PDMS på SU8-master (figur 1, trin 5) til en højde af 4 mm. Desiccate PDMS i 5 min. for at fjerne luftbobler indtil ingen, eller kun få bobler forbliver på PDMS overflade.
- Helbrede PDMS i en ovn ved 70 ° C i 1 time. Derefter skåret ud den hærdede PDMS med en skalpel og forsigtigt skræl PDMS mug fra SU8 master (figur 1, trin 6). Skåret helt ned til skibsføreren at forhindre PDMS revner under peeling.
- Valgfrit: Forberede tværsnits skiver af PDMS forme til at bekræfte, at alle SU8-lag på master har de ønskede tykkelse (figur 1). Tidlige mikrofluid kanal layout test kan udføres i alle PDMS chips.
Bemærk: En replika-støbt PDMS kan limes direkte til et glas substrat efter stansning adgang porte (trin 3.3) til PDMS gennem O2 plasma aktivering ved hjælp af 20 s, 0,4 mbar O2, 50 W, 13.56 MHz. Som bemærket i afsnit 1.2., dette kræver overfor maske polaritet og dermed wafer disposition for X-ray chip fabrikation.
2. in Situ X-ray Chip fabrikation
- Fortynd begge epoxy harpiks prækursorer i ethanol til en sidste ethanol koncentrationen af 40 wt %. En samlet masse på 0,25 g af hver epoxy harpiks forløber i ethanol er tilstrækkelig for en 1 cm2 chip.
Bemærk: Dette reducerer viskositet af den resulterende 5 min epoxy at forenkle boble-fri blanding og replika-skimmel støbning og minimere tykkelsen af laget endelige hærdet epoxy. Ethanol fordamper gennem PDMS under trinnet hærdning. - Degas PDMS skimmel i en vakuum ekssikkator i 30 min, således at det kan absorbere små luft bobler fra epoxyharpiks under trinnet støbning.
- Skære polyimid folie til omkring 70 × 70 mm og span det omkring en 75 × 50 mm glas dias ved hjælp af tape til at opnå en flad og stiv overflade med tape på bagsiden. Plasma aktivere folie med 50 W, 13.56 MHz, 0,4 mbar O2 plasma for 20 s, derefter inkuberes komplet folie-diasset i en vandig opløsning af 1 vol. % (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTS) eller (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GPTS) i 5 min. ved 20 ° C.
- Blandes grundigt både ethanol fortyndet epoxy forløber løsninger for at sikre optimal hærdning opførsel. Hente PDMS-forme fra den vakuumkammer og placere dem på en flad overflade. Derefter hurtigt give afkald på en dråbe af blandet resin på hver mikrostruktur på formen ved hjælp af en mikropipette (ca. 10 µL pr. 1 cm2 af mikrostrukturer) (figur 1, trin 7a).
- Hente polyimid folie-slide sandwich fra vandige silan (APTS eller GTPS) løsning. Tørre folie med trykluft eller kvælstof.
- Placer forberedt polyimid folie-glas-slide sandwich på den deponerede epoxyharpiks (figur 1, trin 7b). Tryk fast på glas dias knyttet til polyimid folie mod PDMS skimmel. Placer en metalplade på glas dias og derefter depositum vægte at anvende op til 1,4 N/cm2 pres for 1 h, mens epoxy harpiks hærder ved stuetemperatur.
Bemærk: Ideelt set ingen harpiks forbliver på folien i de områder, hvor strukturerne i formen have maksimal højde. De svarer til de krystallisering brønde hvor krystalliseringen finder sted bagefter.- Valgfrit: Hvis nøjagtige støbning af små features er kritisk, PDMS mug kan være forstærket med en aluminiumsramme under støbning trin31.
- Fjerne glas dias med polyimid folie og mønstrede epoxy ved at skrælle det fra PDMS mug (figur 1 trin 8). Plasma aktivere mønstrede epoxy side med 50 W, 13.56 MHz, 0,4 mbar O2 plasma for 20 s.
- Efter fjernelse af polyimid folie fra plasma kammer, Inkuber den epoxy-mønstrede folie i en 1 vol. % vandig APTS (eller GPTS) løsning for 5 min. ved 20 ° C. På samme måde, forberede en anden un-mønstrede polyimid folie med supplerende 1 vol. % GPTS (eller APTS) silan aktivering. Efter inkubation, tør både strukturerede og ustrukturerede folie med trykluft.
- Placer epoxy side opad på en flad overflade, ved hjælp af overfladespænding i en dråbe vand nedenunder som en mægler til at forhindre curling af folien og sikre maksimal planhed. Derefter placere den anden aktiveret polyimid folie på toppen og forsigtigt streak med fingeren fra det ene hjørne til modsat, at gøre dem obligation og undgå dannelsen af boblerne.
3. adgang porte til væske levering
- Forbered 4 mm tykke PDMS plader i en petriskål ifølge trin 1.3.1 til 1.3.3 uden at bruge SU8-master. Skære pladen i PDMS blokke af passende størrelse til at dække alle indgangsporte i chippen, uden at dække de enkelte krystallisering rum af chippen.
- Plasma aktivere begge, chip og PDMS blokere i 50 W, 13.56 MHz, 0,4 mbar O2 plasma for 20 s. For kemisk binding, derefter inkuberes hver del i en 1 vol. % vandig APTS eller GPTS-løsning for 5 min. ved 20 ° C. Tørre hver del med trykluft og tryk på PDMS slab på folie chip.
- At forbedre limning, placere jetonen på en flad PDMS slab, og dække det med en plastfolie, efterfulgt af et rent glas dias og en metal blok. Endelig indbetaling vægte for at lægge op til 1,4 N/cm2 pres i ca 1 time.
- Punch adgang huller med en 0,75 mm biopsi punch på hver position hvor tilgangs- og afgangsåbninger i chip design er markeret og forsegle tilbage med tape. Chippen er nu tilgængelige for enhver rør med en ydre diameter på matchende diameter af hullet (som beskrevet i trin 4.2).
4. overflade behandling
- Forberede en 1:20 fortynding af 9 wt % fluorpolymer bestand i fluoro-opløsningsmiddel til en endelig koncentration på 0,45 wt %. Lagring af stamopløsninger og fortyndinger i køleskab i mørke ved 4 ° C.
- Indlæse 1:20 fluorpolymer fortynding i en 1 mL Luer-lock sprøjte. Vedhæfte en 27G × 5/8" nål til sprøjten og derefter en PTFE slanger til nålen.
- Tilslut slangen til X-ray chip outlet og injicere fluorpolymer brugsopløsning forberedt i trin 4.1 indtil alle kanaler er fyldt.
- Placer en chip med den flade side ned på en 190 ° C varm tallerken for 5 min til at fordampe alle opløsningsmiddel til at deponere fluorpolymer i en tynd film belægning.
Bemærk: Når du bruger en ny geometri, tjek hvis kanaler var tilstoppet med fluorpolymer under denne belægning proces. I så fald yderligere fortyndes stamopløsningen.
5. protein forberedelse
- Vejer frysetørret thaumatin og opløse den i en bufferopløsning, der er anført i tabel 2 til den passende mængde til at opnå en endelig proteinkoncentration af 40 mg mL-1.
- Dialyze glucose isomerase mod den buffer, der er anført i tabel 2 i henhold til fabrikanten protokollen.
- Forberede protein thioredoxin som tidligere beskrevet af Schubert et. al. 30.
- Kontrollere de endelige protein koncentrationer fotometrisk ved hjælp af udryddelse koefficienter opsummeres i tabel 2, beregnet ved software ProtParam32.
- Forberede alle løsninger ved hjælp af ultrarent vand og filtrere dem med 0,2 µm filter.
- Centrifugeres protein løsninger ved 20 ° C i 15 min. ved 16100 x g, og tage supernatanten for krystallisering eksperimenter.
6. protein krystallisering i X-ray Chip
- For at krystallisere proteiner i mikrofluid chips, blande lige store mængder af protein løsning og fældningsmiddel løsning. Proteinkoncentration, buffer sammensætning og fældningsmiddel sammensætning er opsummeret i tabel 2. Udarbejde en samlet maengde paa omkring 20 µL til at udfylde en mikrofluid chip.
- Umiddelbart efter blandingen, injicere løsningen til indløbsstuds af chippen via en sprøjte, koblet til en 27G × 5/8" nål og PTFE slanger med 0,75 mm ydre diameter (beskrevet taktfast 4.2).
Bemærk: Påfyldning proceduren for den serielle layout kræver en forudgående priming af chip med fluorholdige olie, hvilket gøres lettest ved at indlæse de fluorholdige olie fra udgangsporten før injektion krystallisering løsning gennem indløbsstuds. Alle lastning trin bør overvåges ved hjælp af et mikroskop til at styre anvendt sprøjte pres og den tilsvarende strømningshastighed." - Når chippen er fyldt, adskille de enkelte krystallisering rum ved at indsprøjte fluorholdige olie til indløbsstuds af chippen. Forsegle chippen ved at blokere alle tilgangs- og afgangsåbninger af chippen. Dette kan gøres ved at indsætte en papirclips.
Bemærk: Fordi krystallisering rum er fyldt af protein/fældningsmiddel løsning, fluorholdige olie kun fylder fjorden kanal chip, uden at det påvirker løsningen i krystallisering rum. - For at efterligne vapor diffusion krystallisering kinetik, placere den forseglede chip ved omgivende temperatur og normal atmosfære til at tillade denne droplet i krystallisering rum til at skrumpe ved fordampning af vand gennem polyimid folie.
- Efter crystal dannelse er observeret via et mikroskop eller DLS målinger (trin 7), overføre den komplette mikrofluid chip i den passende fældningsmiddel løsning, at standse yderligere fordampning fra krystallisering wells indtil røntgen diffraktion eksperiment udføres.
7. dynamisk lys spredning målinger i krystallisering brønde i Chip
Bemærk: DLS målinger blev udført med en laser udgangseffekt på 100 mW, en bølgelængde på 660 nm og det spredte lys blev fundet i en scattering vinkel på 142°. Fordi alle undersøgte prøve løsninger var vandig brydningsindekset for vand (n = 1,33) blev brugt i alle beregninger.
- Sted mikrofluid chip i den i SBS format tallerken indehaveren af DLS instrument ved hjælp af adapter beskrevet taktfast 8.1. Indsæt kortet i enheden.
- Nøje justere laser fokus inde i et rum af mikrofluid chip ved hjælp af motoriseret x-, y- og z-scenen. Fordi mikrofluid chip er meget tynd, Juster z-plan ved at anvende små increment trin.
Bemærk: En korrekt justering er bekræftet af en høj skæring og en glat hale af den resulterende autokorrelation funktion af DLS måling. En kalibrering fil kan oprettes for at matche placeringen af hver individuel krystallisering godt i mikrofluid chip, tillader automatiseret DLS målinger i flere segmenter med tiden. - Udføre hver DLS måling på 293 K til 30 s og gentage måling hver 5 min. indtil udgangen af krystallisering eksperiment.
Bemærk: Første Nukleering kan følges af radius fordelingen af DLS målinger over tid og vellykket crystal dannelse kan sideløbende efterfølges af den indbyggede mikroskop af DLS-Pladelæser.
8. diffraktion dataindsamling
- Adaptere til beamline goniometers
- Udskrive adapter til pladen goniometer for at placere og rotere X-ray chips under krystallografiske dataindsamling.
- Fremstil adaptere til den base goniometer på en hobby-grade 3D printer ved hjælp af standard parameterindstillinger, som anbefalet af fabrikanten.
Bemærk: Adapterne er designet ved hjælp af en 3D-CAD-System og koordinere filerne netværkskort vedhæftes i '. STL'-filformat i tillægget. - Lave X-ray chips til kortet med dobbeltklæbende tape.
-
i situ røntgenkrystallografi
- Indsamle diffraktion data ved hjælp af en stråle størrelse på 10 × 5 µm (FWHM af Gaussisk profil) på 296 K. Brug x-stråler med en energi på 12,8 keV og en flux 2,2 · 1011 fotoner · s-1 i den svækkede stråle og optage diffraktion mønstre ved hjælp af en Pilatus 6 M hybrid pixel detektor.
Bemærk: Mikrofluid udstyr, der indeholder thaumatin, glucose isomerase eller thioredoxin krystaller der bruges til i situ X-ray krystallografiske eksperimenter på EMBL beamline P14 af PETRA III synkrotron. Fås i stråle fokus størrelse og flux afvige på andre X-ray kilder. Antallet af udsatte protein krystaller, antallet af diffraktion mønstre optaget fra hver krystal, svingning vinkel rækkevidde pr. eksponering og eksponeringstiden er sammenfattet i tabel 3. - Processen sætter i to på hinanden følgende diffraktionsmønster individuelt ved hjælp af programmet XDS33. Bruge bash script "xds.sh" fundet i tillægget.
- Oprette HKL filer for hvert datasæt fra alle krystaller og skalere dem ved hjælp af software XSCALE33. Bruge bash script "xscale.sh" i tillægget til at oprette en inputfil for XSCALE.
Bemærk: Kun datasæt af krystaller, der har korrelationskoefficienter større end 90%, hvilket indikerer en høj grad af isomorfi, skal skaleres. Den konservative kriterium ‹I/σ (I) › (> 2) bør anvendes til at bestemme den højeste opløsning shell. Molekylær udskiftning ved hjælp af programmet MOLREP34 fra CCP4 suite35 kan bruges til at opnå faserne for yderligere model bygning ved hjælp af 3D-koordinater af Protein Data Bank (FBF), vist i tabel 3. - Forfine alle strukturer brændselsfremstilling ved hjælp af Refmac535,36 og bruge BLISHØNE37 for besigtigelse af den endelige model.
Bemærk: Solvent molekyler skal tilføjes automatisk under raffinement proces og skal kontrolleres for at bekræfte kemisk rimelige holdninger. Alle modeller skal inspiceres for at identificere Ramachandran outliers.
- Indsamle diffraktion data ved hjælp af en stråle størrelse på 10 × 5 µm (FWHM af Gaussisk profil) på 296 K. Brug x-stråler med en energi på 12,8 keV og en flux 2,2 · 1011 fotoner · s-1 i den svækkede stråle og optage diffraktion mønstre ved hjælp af en Pilatus 6 M hybrid pixel detektor.
9. datavurdering
- Strålingsskader
- Analysere henfald af diffraktion magt over tid ved hjælp af en metode beskrevet af Owen mfl38. For dette, skal du beregne den samlede sum af I/σ(I) (leveres af XDS33) af alle indekserede refleksioner af hver evaluerede diffraktion datasæt (2 på hinanden følgende diffraktionsmønster), at bruge som en referenceværdi. Bruge bash script "ISigma.sh" fra tillægget.
- Normalisere diffraktion magt hvert datasæt til den gennemsnitlige diffraktion effekt af det første datasæt.
- Analysere ændringen af Rmeas værdierne over tid ved at tage Rmeas værdierne fra de Correct.LP filer fra XDS33 (bash script "Rmeas.sh" fra tillægget).
- Krystal orientering
- Bestemme Euler vinklerne at indhente oplysninger om fordelingen af krystalgitter retningslinjer i forhold til koordinatsystemet laboratorium. Beregne Euler vinkler fra matrixen XDS orientering i outputfilen XPARM39 ved hjælp af software Matlab. Bruge bash script "rotation_matrix.sh" til at udtrække rotation matrix fra hver krystal fra filen XPARM. Bruge filen som input i Matlab til at beregne de Euler vinkler ved hjælp af Matlab funktion rotro2eu.m (supplerende fil).
Bemærk: En detaljeret beskrivelse af beregningen er blevet offentliggjort af Zarrine-Pavias mfl40. - Konvertere de opnåede Euler vinkler fra radianer til grader. Gruppen opnåede Euler vinkler for alle tre rotation fly (xy-, xz og zy) i klasser på 10° og plot dem ved hjælp af software Origin9.
- Bestemme Euler vinklerne at indhente oplysninger om fordelingen af krystalgitter retningslinjer i forhold til koordinatsystemet laboratorium. Beregne Euler vinkler fra matrixen XDS orientering i outputfilen XPARM39 ved hjælp af software Matlab. Bruge bash script "rotation_matrix.sh" til at udtrække rotation matrix fra hver krystal fra filen XPARM. Bruge filen som input i Matlab til at beregne de Euler vinkler ved hjælp af Matlab funktion rotro2eu.m (supplerende fil).
Representative Results
Epoxy er en fremragende fyldmateriale til X-ray chip fabrikation. Det er billige, enkel og robust til proces uden at det kræver specialværktøj (figur 1). At reducere epoxy viskositet ved at fortynde det med 40 wt % ethanol lettet fjernelse af overskydende resin ovenfor krystallisering godt, hvilket resulterer i definerede X-ray windows. Højere ethanol fortyndinger resulterede i defekter i den hærdede resin. Ved at analysere X-ray chip tværsnit, bestemt vi samlede vindue tykkelsen på begge sider til at være omkring 19 µm tykt, hvilket er meget tæt på den nominelle tykkelse af de anvendte polyimid folier af 2 × 7.5 µm (figur 2)
Krystallisering forsøg blev isoleret i adskillige nanoliter størrelse reaktion rum hver, ved hjælp af en kapillær ventil mekanisme som tidligere beskrevet41. Denne 'butik-så-Opret' loading teknik forhindrer prøven tab fra kanal døde-volumen og kan nemt udføres manuelt, eliminerer behovet for at bruge pumper eller andet udstyr til væske aktivering42. Chippen er primet med fluorholdige olie før ladning den vandige prøve. Overfladespænding på grænsefladen olie-vand mellem priming olie og vandige prøveresultater i en trykforskellen via grænsefladen. Denne Laplace pres afhænger både krumningsradius og overfladespænding på grænsefladen. For at minimere sin energi, skal grænsefladen minimere dens overflade, hvilket svarer til at maksimere sin vigtigste krumningsradierne på konstant volumen. En lav krumning grænseflade i en bred kanal har en lavere Laplace tryk så en høj krumning grænseflade i en smal kanal segment. Derfor prøve plug ind fortrinsvis og løber gennem bredt omgå kanal i stedet for strømmer gennem de smalle kapillære ventil restriktioner. Endelig er stikprøve plug efterfulgt af fluorholdige olie for at adskille udsnit brønde i uafhængige dråber.
Robust og pålidelig lastning blev opnået med strømningshastigheder op til 1 mL/h i en serie og en parallel godt arrangement (figur 3). I den 'seriel' layout, er godt indløb og kapillær ventil forsnævringer sekventielt forbundet gennem en bypass kanal31. Derimod i den 'parallel' layout, to separate vigtigste kanaler slutte alle godt fjorde eller kapillær ventiler kun43. Begge arrangement begreber er tidligere blevet kombineret med formulering kontrol til skærm sammensætning, som er et nyttigt aspekt i protein krystallisering43,44. Den serielle design har kun to flydende porte, én indsugnings- og én. Det har færre porte, flydende, og derfor er enklere at opføre og drive. Den parallelle layout har 4 væske porte, 2 til den vigtigste kanal tilslutning til brønde og 2 for at linke op kapillær ventilerne at lade luft eller overskydende olie undslippe. Lastning kan derfor fortsætte fra arbejdsmarkedets parter vigtigste kanal. Dette layout er generelt lavere flow modstand for et tilsvarende antal brønde på grund af dens kortere bypass. Det er derfor bedre egnet til up-skaleret enheder med et højt antal brønde. Også, prøve brønde er orienteret tættere sammen, hvilket giver fordele til automatiseret billedbehandling.
Fuldstændig prøve godt lastning blev observeret for både layouts, hvis enten bygget som en to-højde eller en tre-højde design. I en to-højde design er både prøven godt og bypass kanaler lige høje. Tre-højde design kræver en tredje maske, en ekstra SU8 lag og en justering skridt til yderligere at sikre, at prøven brønde bliver højere end de foregående bypass kanaler. Denne højde-differentiale fremmer indtastning af prøven væske i brønden gennem den samme kapillar ventilfunktionen princip, der stopper flow på forsnævringer. Her, svarer den højere godt loft til en lavere Laplace presset fra de fremrykkende menisk og flow langs bypass retning er kun begunstiget efter wells har fyldt helt sådan, at ventilen forsnævringer blokere yderligere flow og aflede det ned bypass. Dog kræver vellykkede indlæsning ikke strengt brønde skal være højere end bypass som passende kapillær ventilfunktionen kan også opnås ved at justere kanal bredder i overensstemmelse hermed. Ikke desto mindre vores erfaring, højere brøndene udført betydeligt mere robust og defekt gratis lastning blev observeret på op til ti gange højere strømningshastigheder i alle tre-højde design i forhold til deres to-højde ækvivalenter. Denne effekt blev mere udtalt i de parallelle layout.
For at efterligne vapor diffusion krystallisering kinetik, blev finite permeabilitet af polyimid folien udnyttet til at styre vand fordampning over tid. Eksperimentelle fordampning priser var kvantificeres ved at overvåge ændring af droplet volumen over tid ved at sidestille drop areal og godt højde (fig. 4 c). Fordampning fra krystallisering brønde i X-ray chip fortsætte ikke i en lineær måde, som en faldende areal af drop sammenfaldende med stigende opløste fusionen resulterer i en nedsat fordampning sats over tid45. Den første inddampning efterfulgt en ca lineær sats på omkring 0,5 nL h-1 i wells af serielle layout geometri.
For bedre at forstå krystallisering kinetik, blev DLS målinger udført i krystallisering wells af mikrofluid chip. Indledende DLS målinger, blev en PDMS chip bundet på et glas dias brugt til at give bedre optiske egenskaber for lysspredning eksperiment. Denne chip havde samme godt dimensioner som X-ray chip. PDMS har en højere vanddamp permeabilitet end polyimid af polyimid windows i X-ray chip45. Da flux skalaer lineært med afstanden, kan fordampning bane af et windowed polyimid godt matches med en tilsvarende PDMS vindue af passende tykkelse.
DLS resultater viser, at radius distributionen ændrer sig over tid (figur 4A-B), viser, at DLS målinger giver mulighed for at opdage de første Nukleering, før første krystallinsk partikler observeres. Denne information kan bruges til samme og vokse enkelte krystaller pr. brønd af eksternt justere fordampning og dermed supersaturation niveauer på et tidligt stadium af Nukleering46.
X-ray chip blev løst på en 3D trykte adapter til SBS kompatibel plade goniometer på EMBL beamline af synkrotron P14 på PETRA III (figur 5A). Alternativt, en mindre 3D trykte ramme kan bruges til at montere X-ray chips til standard beamline goniometers21. Thaumatin krystaller har en størrelse på 10-20 µm (figur 5B) og diffract op til en opløsning af 2.0 Å (figur 5 c). Som forventet, X-ray baggrund bidrag af de to tynde polyimid folier vinduer fra X-ray chip er begrænset til polyimid polymer spredning ringe på 11 Å (2θ ~ 5°) og 33 Å (2θ ~ 1,7 °) for X-ray boelgelaengden 0,97 Å. Disse to ringe Forstyr ikke databehandling. Et samlet datasæt med 83 thaumatin krystaller blev indsamlet og 10 diffraktion mønstre blev indspillet fra hver krystal med en 1° rotation under hvert billede. Databehandling samt raffinement parametre og statistikken for thaumatin datasæt er opført og sammenlignet med to andre datasæt af glucose isomerase og thioredoxin, der blev også indsamlet i situ er angivet i tabel 3 og Tabel 4.
Intensitet henfald af normaliserede diffraktion magt over tid blev undersøgt af opdele thaumatin datasæt i fem sub datasæt (to diffraktion mønstre blev brugt pr. delmængde for at vedligeholde komplette datasæt). Som vist i fig. 6B, diffraktion magt begyndte at falde efter den første sub datasæt og var under 50% i det fjerde sub datasæt. Som et resultat, er Rmeas værdierne af sub datasæt også stigende over tid, med angivelse af X-ray strålingsskader under dataindsamlingen. Vi hypotesen, at frie radikaler genereret under X-ray eksponering hurtigt nedbrydes nærliggende krystaller i samme reaktion rum. For eksempel, var sådanne sekundære X-ray skader, mindre udtalt i en relaterede eksperimenterende tilgang, hvor krystaller har været fordelt over et betydeligt større område i en polyimid sandwich21. For at minimere samlede X-ray skader, bør kun et lille antal diffraktion mønstre fra en særlig krystal indsamles ved stuetemperatur. Også, skal kun en enkelt protein krystal udsættes pr. rum mikrofluid chip. Ikke desto mindre viser alle strukturmodeller raffineret ved hjælp af den forarbejdede datasæt meget god stereokemi og egnede statistikker (tabel 4). Derudover var alle endelige electron density kort af meget god kvalitet.
I tidligere krystallografi tilgange på X-ray gennemsigtige chips, orientering og arrangement af krystaller skulle være manipuleret bevidst for at opnå en tilfældig fordeling af krystal retningslinjer40 eller blev fremstillet af krystal bevægelser inden for flydende lag21. For at evaluere krystal orienteringen i X-ray gennemsigtige mikrofluid chips er beskrevet i denne protokol, var fast besluttet på enhed celle orientering af alle udsatte krystaller med hensyn til laboratoriet koordinatsystem. For bipyramidal thaumatin krystaller, blev en svag præference observeret (figur 7A), mens vi opnået en bred distribution til glucose isomerase krystaller (figur 7B). Vi ræsonnerede, at de fleste materialer på nanometer skala, udviser betydelige ruhed. Dermed kan krystaller spontant samme på overflade i betydeligt mindre forudindtaget retningslinjer spontant. Sådan en lille krystal kernen kan være låst i en orientering, mens de fortsætter med at vokse til passende størrelse uden at omlægge i forhold til normalitet overflade. Faktisk har overflade medieret krystal Nukleering længe været et irritationsmoment at crystallographers forsøger at sløjfe en vedhæftet krystal fra overfladen uden at beskadige krystal i processen. Her kan vi direkte bruge sådanne krystaller til diffraktion dataindsamling. Dog findes system specifikke begrænsninger, som thioredoxin afslørede en stærk præference for visse retningslinjer i xy-, xz- og yz-fly (figur 7C). Eksemplerne viste viser, at orientering distribution ikke kun afhænger af vækstmiljø, men også på figuren krystal. Thioredoxin krystaller har aflange figurer, som har tendens til at vokse i foretrukne retning, mens tetragonal bipyramidal thaumatin krystaller eller ændres glukose isomerase krystaller ikke vis dette problem. Dog i alle tilfælde, selv med foretrukne retningslinjer det tilgængelige udvalg af krystal rotationer resulterede i tilstrækkeligt god dækning af gensidige plads og dermed komplet datasæt for alle undersøgte proteiner. Ingen yderligere foranstaltninger skulle således tages, når du vælger krystaller til Xray eksponering.
Figur 1 : Ordningen af mikrofluid X-ray chip fabrikation. (1) SU-8 er udleveret på en silicium substrat og spin-belagt for at opnå den ønskede lagtykkelse. (2) Photoresist er udsat for UV-stråling gennem en maske. (3) eksponerede photoresist er derefter udviklet væk af fortløbende vask med PGMEA og isopropanol, hvilket resulterer i (4) en SU-8 master ophaling yderligere skridt. (5) PDMS er hældt på, og (6) efter hærdning formen PDMS er skrællet fra SU-8 master. (7a) Epoxy lim er udleveret på PDMS mug og (7b) en aktiveret polyimid folie er kemisk bundet til epoxyharpiks,. (8) efter hærdning, er polyimid folie med mønstrede tynde epoxy film skrællet fra formen PDMS. (9) i et sidste skridt, er enheden låg med en anden polyimid folie til at give en lukket lav X-ray baggrund mikrofluid chip. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Fotografi (venstre) og mikroskopi billeder af tværsnit af de endelige chips. En repræsentativ kanal segment (i midten) og en krystallisering godt (til højre) fra to separate chips er vist. Pilene angiver målte afstande. Alle dimensioner er i µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Skemaer af krystallisering godt design med [en] parallel eller [B] serie layout, set ovenfra og fra siden, med dimensioner er angivet i µm. Typiske kanalen højder var: 50 µm omgå, 50-60 µm krystallisering godt, 5-10 µm kapillær ventil, svarende til godt bind af omkring 2,5 nL (parallel layout) og 8 nL (serial layout). Repræsentant godt ladning opførsel er vist ved hjælp af farvestoffer til levnedsmidler. Chippen blev PRIMES med 12 wt % 1H, 1 H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol i FC-43, før food dye blev injiceret i opbevaring brønde. Hvide pile angiver retningen af flow. Oversigt over billeder af lastede enheder Vis alle brønde indlæst defekt gratis, illustrerer robust prøve lastning. Den parallelle layout er illustreret som en tre-højde design, med krystallisering wells højere end bypass, mens det serielle layout er afbildet som en to-højde design med brønde og omgå at have samme højde. Typiske strømningshastigheder var omkring 150 µL/h under lastning, men defekt gratis lastning blev observeret for flowhastighed af op til 1 mL/h i en tre højde-design. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : In situ dynamiske lys spredning af en krystallisering godt over tid. [A] mikroskopisk billede serie af krystallisering godt. Den lagrede droplet kontinuerlig krymper som vanddamp fordamper med tiden. Første thaumatin microcrystals kan observeres efter 4 h. [B] tilsvarende hydrodynamiske radius fordelingen af de thaumatin partikler målt af DLS under samme krystallisering processen fotograferet i [A]. Dannelsen af en anden radius brøkdel, med angivelse af indledende Nukleering begivenheder kan ses efter ca 1-2 h. [C] repræsentativ mængde falde af to droplet referenceværker på grund af fordampning vandtab over tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : indsamling af data i situ diffraktion. [A] enkelte mikrofluid chips er monteret af et 3D trykte adapter (blå) på en plade goniometer. [B] Thaumatin krystaller i mikrofluid chip under X-ray eksponering som afbildet af i-line mikroskop på beamline P14. [C] diffraktion af thaumatin krystaller blev indspillet til en opløsning af 2.0 Å, med en negligibly lav baggrund. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Data evaluering af diffraktion data fra thaumatin krystaller i mikrofluid chip, indspillet ved en stuetemperatur. [A] electron density af raffineret thaumatin model ved hjælp af rammen 1-2 datasæt kun (blå konturer på 1,5 σ). [B] intensitet henfald af thaumatin krystaller som en funktion af X-ray dosis. [C] udviklingen af Rmeas værdien over X-ray dosis. Boksen parceller i [B] og [C] med kvartiler (øvre værdier 75%, median værdier 50%, lavere værdier 25% og middelværdi) og whiskers med 95% konfidensintervaller repræsenterer henfald af diffraktion intensitet og Rmeas af alle udsatte krystaller (n = 83). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Distribution af enhed celle retningslinjer i mikrofluid chip folie med hensyn til laboratoriet koordinatsystem. [A] bipyramidal thaumatin krystaller viste en bred distribution af retningslinjer, der dækker næsten 180° i xy-(blå), xz-fly (grøn) og yz-(red) plan. [B] glukose isomerase viser også en omfattende distribution, mens [C] thioredoxin viste en stærk præference for visse retningslinjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| SU8-lag | Spin frakke | Før bages | Udsætte | Efter bages |
| [65 / 95 ° C] | [65 / 95 ° C] | |||
| 1st lag: Wells | 1000 RPM | 0 / 10 min | 200 mJ/cm2 | 1 / 4 min |
| 15 µm SU8-3010 | ||||
| 2nd lag: Bypass | 2000 RPM | 0 / 16 min | 220 mJ / cm2 | 1 / 5 min |
| 35 µm SU8-3025 | ||||
| 3rd lag: ventiler | 3000 RPM | 0 / 3 min | 150 mJ / cm2 | 1 / 2 min |
| 5 µm SU8-3005 |
Tabel 1: SU8 proces eksempel for tre-lags parallelle X-ray chip design. Dette lag bestilling vil give mulighed for støbning en PDMS skimmel for X-ray chip fabrikation. For at direkte skimmel en PDMS under prototyping, reverse laget bestilling under master fabrikation at starte fra de 3rd til slut med 1st -laget i stedet.
| Protein | Proteinkoncentration | Protein buffer | fældningsmiddel | Plads gruppe, FBF post | Extinction koefficient [M-1 cm-1] |
| Thaumatin (Thaumatococcus daniellii) | 40 mg mL-1 | 50 mM Bis-Tris, pH 6,5 | 1.1 M natrium tartrat, 50 mM Tris, pH 6,8 | I4222, 1LR2 | 29420 |
| Glukose isomerase (Streptomyces rubiginosus) | 25 mg mL-1 | 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7,0 | 100 mM Bis-Tris, 2,7 M ammoniumsulfat, pH 5.7 | I222, 4ZB2 | 46410 |
| Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) | 34 mg mL-1 | 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0 | 27,5% PEG1500, 100 mM SPG buffer, pH 6.3 | P41212, 4FYU | 24075 |
Tabel 2: Krystallisering betingelser og plads grupper af protein krystaller forberedt, herunder udryddelse koefficient og FBF kode.
| Protein | Antallet af udsatte krystaller | Antallet af diffraktionsmønster pr. krystal | Svingning udvalg pr. eksponering [°] | Eksponeringstiden [ms] | FBF indrejse for MR |
| Thaumatin (Thaumatococcus daniellii) | 103 | 10 | 1 | 40 | 1LR2 |
| Glukose isomerase (Streptomyces rubiginosus) | 69 | 100 | 0,1 | 80 | 4ZB2 |
| Thioredoxin (Wuchereria bancrofti) | 68 | 10 | 1 | 40 | 4FYU |
Tabel 3: røntgen diffraktion data indsamling parameter.
| Data indsamling statistiken | thaumatin (Billede 1-20) |
glukose isomerase (Frame 1-100) | thioredoxin (Billede 1-10) |
| Beamline | P14 | ||
| Bølgelængde [Å] | 0.96863 | ||
| Plads gruppe | P41212 | I222 | P42212 |
| Enhed celle parametre: en = b, c [Å] | 58.62, 151.48 | 93.91, 99.60, 103.04 | 58.45, 151.59 |
| Antallet af krystaller | 101 | 41 | 34 |
| Samlede svingning [°] | 10 | 10 | 10 |
| Resolution [Å] | 30.1.1989 (1.95 – 1.89) |
30.1.1975 (1,80-1,75) |
30.3.2000 (3,20-3,00) |
| Temperatur [K] | 296 | 296 | 296 |
| R p.i.m.b | 7.5 (25,5) | 8.8 (28,0) | 9.1 (33.2) |
| Målte refleksioner | 1553200 | 690000 | 1111196 |
| Unikke refleksioner | 21850 | 48942 | 44449 |
| Gennemsnitlige I/σ(I) | 6,07 (1,78) | 5,85 (1.66) | 4,08 (1,47) |
| MN(I) halv-sæt korrelation CC(1/2) | 96.2 (72,2) | 95,8 (68,2) | 97,9 (75.3) |
| Fuldstændighed [%] | 99,8 (100,0) | 100,0 (99,9) | 99,9 (100,0) |
| Redundans | 71,1 | 14.1 | 25 |
| Raffinement statistik | |||
| Opløsning vifte [Å] | 1/30/1989 | 30-1-1975 | 3/30/2000 |
| R / Rgratis [%] | 18.8/23.9 | 18.1/20.5 | 18.9/23.1 |
| Protein atomer | 1550 | 3045 | 1129 |
| Vandmolekyler | 51 | 111 | 56° |
| Ligand molekyler | 20 | 0 | 0 |
| RMS afvigelse | |||
| Bond-længde [Å] | 0.02 | 0.026 | 0,01 |
| Bond vinkel [°] | 2.04 | 2.22 | 1.43 |
| B faktor [Å2] | |||
| Protein | 22,6 | 20 | 50 |
| Vand | 25.1 | 27.1 | 29,7 |
| Ligand | 20.4 | ||
| Ramachandran plot analyse | |||
| Mest begunstigede regioner [%] | 97.67 | 95.32 | 96.13 |
| Tilladte regioner [%] | 2,44 | 4.16 | 3.64 |
| Generøst tilladt regioner [%] | 0,49 | 0,52 | 0,23 |
| a: værdier i parenteser er for den højeste opløsning shell. | |||
b: ( ), hvor jeg (hkl) er den gennemsnitlige intensitet af refleksioner hkl, Σhkl er sum over alle refleksioner og Σi er summen over jeg målinger af refleksion hkl. |
|||
Tabel 4: Data indsamling statistik af datasæt fra thaumatin, glucose isomerase og thioredoxin.
Yderligere-fil 1: chip_geometry.dwg. CAD-fil af de chip geometrier anvendes. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Yderligere-fil 2: goniometer_adapter.stl. STL-filen angiver X-ray chip goniometer adapter. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Yderligere-fil 3: xds.sh. Bash script til oprettelse af input-filer for at behandle kiler af diffraktion data af XDS. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Yderligere-fil 4: xscale.sh. Bash script til at flette diffraktion data fra delmængder og oprette en HKL fil. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Yderligere-fil 5: ISigma.sh. Bash script til at udtrække ISigma værdierne fra alle individuelle undersæt. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Yderligere-fil 6: Rmeas.sh. Bash script til at udtrække Rmeas værdierne fra alle individuelle undersæt. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Yderligere-fil 7: rotation_matrix.sh. Bash script til at forberede inputfilen for Matlab til at beregne Euler vinklerne fra rotation matrix. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Vi fabrikere mikrofluid enheder for i situ røntgen diffraktion af mønster epoxyharpiks som fylde materiale og polyimid folie som vindue materiale. Vores procedure optimeret forskellige trin af fabrikationsproces over tidligere X-ray chip designs16,21. Vi reduceret vindue tykkelse og derved baggrunden spredning samtidig også lette fabrikation som færre procestrin er påkrævet. i situ krystallisering ved hjælp af beskrevet protokollen har betydelige fordele. Det giver mulighed for diffraktion dataindsamling ved stuetemperatur og udelukker derved brug af cryo beskyttelse, hvilket i nogle tilfælde indeholder risikoen for indslæbning af artefakter i protein struktur. Derudover er krystallerne ikke underlagt fysiske stress, fordi overførslen af krystallerne fra deres indfødte miljø kan undgås. Gennem denne procedure krystallerne opretholde deres højeste kvalitet og lider ikke af nogen form for behandling.
Vores erfaring kredser de mest kritiske trin i protokollen omkring styring af krystallisering processen. Parametre at opnå X-ray egnet krystaller med passende dimensioner skal identificeres empirisk og ikke kan tages direkte fra vapor diffusion eksperimenter. Ved hjælp af identiske koncentrationer af protein og fældningsmiddel resulterede ikke altid i krystaller i forskellige chips, eller til tider i forskellige brønde inden for samme chip. Dette angiver, at alle faktorer, der påvirker krystal Nukleering og vækst bør overvejes nøje, som mor liquor sammensætning eller krystallisering kinetik (gennem fordampning bane). Som større krystaller diffract til højere opløsning, dyrkes ideelt passende store krystaller. Processen med krystal Nukleering og vækst kan følges med DLS målinger. Justere laser fokus inde ~ 50 µm tynde krystallisering rum chip kan være udfordrende og måske kræver omhyggelig Manuel justering. Ved hjælp af brønde dybere end 100 µm, var laser auto-justering gennemførlige og pålidelig, således at flere brønde kan overvåges via automatiseret erhvervelse ordninger.
Polyimid baseret X-ray chips producerer kun en lav baggrund og vi demonstrere egnetheden af disse anordninger til rutine røntgen diffraktion dataindsamling ved at løse strukturer for tre model proteiner. Den bedste opløsning fremstillet i chip afveg, sammenlignet med tidligere opnåede resolutioner fra betydeligt større protein krystaller og konventionelle røntgen dataindsamling. Dette kan skyldes flere faktorer og krystallisering betingelse optimering yderligere kan forbedre diffraktion. Det var muligt at indsamle i situ diffraktion data op til 1,8 Å opløsning udlignende krystal med dimensioner mindre end 30 µm. En detaljeret analyse af thaumatin diffraktion data givet indsigt om strålingsskader. For at begrænse omfanget af strålingsskader, skal kun en enkelt krystal udsættes pr. rum i enhedens mikrofluid som diffusion af radikaler og i tilstødende krystaller kan forekomme. For at forbedre hastigheden af dataindsamling, skal dette automatiseres i fremtiden.
På grund af krystal morfologi, i nogle tilfælde kan en foretrukne orientering forekomme. Det var for eksempel tilfældet med thioredoxin datasæt, hvor krystaller havde en stærkt foretrukne orientering i forhold til vinduerne chip. Selv her kunne vi samle et komplet diffraktion datasæt. Hvis krystaller udviser en foretrukne orientering i chip og især hvis tilsvarende plads gruppen har også en lav symmetri, derefter fuldstændigheden af datasættet bør overvåges under samlingen som tilstrækkelig diffraktion mønstre cane indsamlet.
Tidsopløst undersøgelser ved hjælp af disse chips er direkte muligt når ved hjælp af lys fremkaldt reaktioner med en pumpe-sonde tilgang. Polyimid folie lystransmission for pumpen laser skal være belyst og alternativt optisk klare polyimid eller COC kunne bruges. De nuværende mikrofluid geometrier tillader ikke for substrat blanding eksperimenter efter krystaller er vokset. Vi forventer dog beskrevet X-ray chip fabrikation protokollen skal også være egnet til sådan blanding designs for begge tidsopløst røntgen diffraktion samt spredning tilgange19.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af PIER frø fonden PIF-2015-46, BMBF grants 05K16GUA og 05K12GU3, og 'The Hamburg centrum for ultrahurtig Imaging-struktur, dynamik og kontrol af sagen på atomare skala' excellence klynge af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Arbejdet i forfattere tilknyttet Center for fri-elektron Laser videnskab blev finansieret af Helmholtz Association gennem orienterede midler. Synkrotron MX data blev indsamlet på beamline P14 drives af EMBL Hamburg på PETRA III storage ring (DESY, Hamburg, Tyskland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 3000 Series | MicroChem Corp. | SU-8 3000 | Photoresist |
| PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
| Isopropyl alcohol | Solvent | ||
| Ethanol | Solvent | ||
| Epoxy glue | UHU | Plus Schnellfest 5 min | Epoxy glue |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
| Kapton foil | Dupont/ American Durafilm | HN grade, gauge 30 (7.5 μm) | polyimide foil |
| APTS | Sigma-Aldrich | 440140 | Chemical |
| GPTS | Sigma-Aldrich | 440167 | Chemical |
| Cytop CTX-109AE | Asahi Glass Co. Ltd | Cytop CTX-109AE | Cytop fluoropolymer coating |
| CT-Solv 100E | Asahi Glass Co. Ltd | CT-Solv 100E | Cytop fluoro-solvent |
| HFE-7500 | 3M | Novec 7500 | Fluorinated oil |
| AutoCAD | AutoDesk Inc. | AutoCAD | CAD Software |
| Biopsy Punch | Harris | Uni-core 0.75 mm | |
| Photo mask | JD Photo Data | ||
| 3 inch wafer | University Wafer | Silicon wafer | |
| Mask aligner | SÜSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner |
| PDMS mixer | Thinky | ARE-250 | |
| Plasma machine | Diener electronic | Zepto | |
| Thaumatin | Sigma Aldrich | T7638 | Protein |
| Glucose Isomerase | Hamton Research | HR7-102 | Protein |
| Bis-Tris | Sigma Aldrich | B9754 | Chemical |
| Sodium Tartrate | Merck | 106664 | Chemical |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10812846001 | Chemical |
| HEPES | Carl Roth | 6763.2 | Chemical |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 208337 | Chemical |
| Ammonium Sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Chemical |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Chemical |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 1064060250 | Chemical |
| PEG1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | Chemical |
| SPG buffer | Jena Bioscience | CSS-389 | Chemical |
| SpectroLight600 | XtalConcepts | DLS Instrument | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Spectrophotometer | |
| Zentrifuge | Eppendorf | ||
| Ultimaker2 | Ultimaker | 3D printer | |
| Form2 | Formlabs | 3D printer | |
| Amicon Filter | Sartorius Stedim | 0.2 µm filter | |
| Tubing | Adtech Polymer Engineering Ltd | Bioblock/05 | PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter |
| Syringes | BD | 309628 | 1ml Luer-Lock Tip |
| Needle | Terumo Agani Needle | AN*2716R1 | 27Gx5/8" |
References
- Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K. Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).
- Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K. Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).
- Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals. Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).
- Huang, C. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).
- von Dreele, R. B. Multipattern Rietveld refinement of protein powder data. J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Gati, C. Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources. , Dissertation, Hamburg (2015).
- Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).
- Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
- White, T. A., et al. CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography. J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).
- Perry, S. L., et al. A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction. Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).
- Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).
- Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).
- Heymann, M., et al. Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction. IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).
- Schubert, R., et al. A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution. IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat. Commun. 5, 3309 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Cohen, A. E., et al. Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).
- Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).
- Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index. J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).
- Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements. Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).
- Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles. Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).
- Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks. J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).
- Walker, J. M. The Proteomics Protocols Handbook. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
- Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).
- Murshudov, G. N., et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Owen, R. L., et al. Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography. Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).
- Kabsch, W. Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns. J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).
- Zarrine-Afsar, A., et al.
- Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).
- Shemesh, J., et al. Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).
- Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition. Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).
- Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579 (2017).
