Summary
このプロトコルでは、作製し、室温での x 線回折データ収集のためのマイクロ流体デバイスを操作する方法について詳しく説明します。さらに、動的光散乱法によるタンパク質の結晶化を監視する方法を説明し、処理し、分析する方法得られた回折データ。
Abstract
このプロトコルでは、ゴニオメータ ベースの固定ターゲット シリアル結晶構造解析のために最適化された低 x 線バック グラウンドで加工マイクロ流体デバイスについて説明します。デバイスはソフト ・ リソグラフィーを用いたエポキシ接着剤からパターン化されているし、室温でその場x 線回折実験に適しています。サンプル井戸低 x 線バック グラウンドを持つ回折データ収集を許可する高分子ポリイミド箔窓の両側には、蓋をします。この製作方法は多くを求めない安価です。SU 8 マスター基板の調達後、典型的な研究ラボ環境でクリーン ルーム外すべての製造を完了できます。チップの設計と試作のプロトコルは、microfluidically 定義ナノリットル サイズの液滴に水性反応を分割するキャピラリー valving を利用します。このローディング機構チャネル デッド ボリュームからサンプル損失を回避し、簡単に流体の作動のためのポンプやその他の機器を使用せず手動で実行することができます。我々 はどのように分離ナノリットル サイズ タンパク質溶液滴できますが監視対象の in situ動的光散乱制御タンパク質の結晶核生成と成長にについて説明します。適切な結晶を成長した後、室温でターゲット シリアル x 線回折その場固定ベース ゴニオ メーターを使用して完全な x 線回折データセットを収集できます。プロトコルは、ソフトウェア ツールのスイートを使用して解決し、蛋白質結晶構造を絞り込む回折データセットを処理するカスタム スクリプトを提供します。このアプローチでは、工芸品の低温保存または従来の結晶学実験の処理マニュアルの結晶中に誘発する可能性を回避できます。チップで育つ約 10-20 μ m の寸法で小さい水晶を使用して解決された 3 つの蛋白質の構造を比較し、.結晶化とその場で、処理およびそれ故に機械的回折によって壊れやすい結晶の妨害が最小限に抑えられます。プロトコルは、その場でシリアル結晶構造解析に適したカスタム x 線透明マイクロ流体チップを作製する方法を説明します。ほぼすべてのクリスタルは、回折データ収集の使用ことができます、これらのマイクロ チップ、非常に効率的な結晶配信方法です。
Introduction
蛋白質の 3 D 構造を知ることは、その機能を理解することが不可欠です。近く原子分解能の構造は、最もよく、x 線結晶構造解析によって得られるところ。このテクニックを公開タンパク質結晶 x 線放射と精製と構造決定の結果として得られる回折パターンを分析しています。伝統的な x 線結晶構造解析、完全な回折データセットは、極低温における単一、理想的には大きなクリスタルから記録されます。ただし、このような結晶が成長し、些細な大抵ないと適当な低温保存条件を識別することができますそれ自体困難になるし、時々 またネイティブ蛋白質構造5からの逸脱を引き起こす可能性があります。
X 線自由電子レーザ (FEL) および放射光ビームラインにおける最近の技術の進歩より小さい結晶構造を解決するために許可している、新しいマイクロ集束ビームライン増加 x 線ビームの輝きと改善された x 線検出器になった利用可能な6,7。通常、小さい水晶はより大きく成長し、欠陥の遊離結晶8,9やすくなっています。しかし、小さな結晶 x 線照射損傷の大きい水晶よりもはるかに高速に苦しみます。これは大きな結晶に比較するため、同等の解像に回折により小さい結晶ボリュームに高い x 線の線量を投影する必要があります。したがって、でも低温保護はしばしば不十分である単一微小結晶から完全な回折データ セットを記録です。
このハードルを克服するためにシリアルの結晶を回収して完全なデータセットを取得する多くのランダム配向結晶からの回折パターンを結合する選択の方法となっています。放射線 x 線線量が合計を広めることで誘起結晶被害を最小限高結晶5,10数以上のタンパク質の構造を解決するために使用します。'回折破壊する前に' 自由電子レーザー実験、各結晶はあくまでフェムト秒 x 線パルスを使用して 1 つの露出のため。第 3 世代放射光源でマイクロ フォーカス ビームライン順番数ミリ秒短い x 線露光11,12,13,14シリアル結晶構造解析を実行できます。水晶発振またはデータ収集中に回転、しかし、部分的なブラッグ反射だけ記録できる、それゆえ数万人またはより多くの回折パターンが通常構造決定15必要。これまでサンプル配信方法の多様なセットとして開発されたシリアルの結晶学の最近の見直し14,16,17,18,19。中で、いくつかの固定ターゲット ベース サンプル配信など大幅より少ない回折パターンを提供できる、同様に完全なデータセットも低消費しながら正常に x 線露光中に結晶回転と結合された戦略サンプルと比較して古典的なシリアルの結晶学への静止画が、実験記録7,16,20,21,22,23,24。
低 x 線バック グラウンドを持つマイクロ流体デバイスを作製するためのプロトコルを提案します。デバイスのソフト ・ リソグラフィーを用いた 5 分エポキシ接着剤からパターン化されているし、部屋の温度でその場x 線回折実験の場合として x 線セットアップに直接試料を統合するから利益を得るために適しています。次のミキシング誘起動力学18,19時間分解の研究。マイクロ流路、高分子ポリイミド箔、複合厚低 x 線背景イメージングを可能にする約 16 μ m で x 線窓の両側に蓋をします。すべての使用された材料は、良い耐溶剤性を提供します。この工法は、比較的簡単で安価なです。SU 8 マスター基板の調達後、典型的な研究ラボ設定でクリーン ルーム外すべての製造を完了できます。
ゴニオ メーター ベースの固定ターゲット シリアル結晶構造解析アプリケーションの例では、チップをについて説明します。まず、microfluidically ナノリットル サイズの液滴の選択した番号に水性反応を分割するキャピラリー valving を使用しての設計と試作に関する考慮事項を説明します。このローディング機構はチャネルのデッド ボリュームからサンプル損失を回避し、分割することができます簡単に手動で実行する流体の作動のためのポンプやその他の機器を使用せず。タンパク質溶液のような分離ナノリットル サイズ滴監視対象はその場で動的光散乱 (DLS) を使用して制御タンパク質の結晶核生成と成長します。以前、DL 測定をガラス スライド25,26に結合したポリジメチルシロキサン (PDMS) 構造体から成るマイクロ流体デバイスで実行できることが実証されています。ポリイミド膜は 550 より波長が長いため高伝送のため nm、アプローチを拡張する単位の x 線透明チップだけでなく、適切なレーザー波長27,28を使用する場合。DL の結果に基づいて、初期核生成が観察できますとさらに液滴蒸発を停止して、少ないが大きなタンパク質の結晶を得ることができます。
十分な結晶が成長した、完全な x 線回折データセット、収集できます室温でターゲット シリアル x 線回折その場固定ベース角度計を使用します。回折データセットは、蛋白質結晶構造を解決するために一連のソフトウェア ツールとカスタム スクリプトを使用して処理されます。この手法は、従来の結晶学実験で使用される低温保存中に生じる工芸品を回避できます。
私たちは約を使用して解決された 3 つの蛋白質ターゲット構造比較 10-20 μ m の小さな結晶が良いし、2 Å 分解能にチップで成長して。結晶化とその場で、処理およびそれ故に機械的回折によって壊れやすい結晶の妨害が最小限に抑えられます。このプロトコルは、タンパク質結晶回折の高解像度と低解像度 (3.0 Å に 1.7 Å) に適用できます。ほぼすべてのクリスタルは回折のために使えるので、小さなサンプルは、非常に効率的な結晶配信メソッドに浪費されています。
このプロトコルは、蛋白質結晶化と回折データ収集その場x 線透明マイクロ流体チップを準備する方法の詳細なガイドを提供します。手順は、実験室での高度な機器を必要とせずマイクロ精度の恩恵を慎重に設計されました。また、非専門家による専門的なゴニオ メーターや、結果の再現を容易にするため加湿器を必要とせず放射光ビームラインでのデータ コレクションを実行できます。紹介したテクニックは、低温保護または結晶処理によるシリアル ミリ秒結晶学データ収集のため室温照射損傷を最小限に維持しながら、成長後の結晶に応力を導入することがなく適用できます。したがって、この方法はタンパク質結晶化プロジェクトに適しています。
Protocol
1. チップ設計とマスター製作
- マスク デザイン
- 適切な CAD プログラムを使用して目的のチャンネル ジオメトリを概説します。フォトレジスト レイヤーごとに個別のマスクを準備します。このプロトコルで使用されるすべてのデザインは結果のセクションで詳細で説明している、AutoCad として利用可能な '。DWG'補足ファイル 1の形式。
注: すべて PDMS デバイスを構築するためチャネルの高さと幅の縦横比を超えない 1:10 チャネルの崩壊を防ぐために。ポリイミド箔とエポキシ樹脂硬化物は丈夫と原則として、必要があることは、高いアスペクト比で許可も。しかし、我々 意図的も超えていない、1:10 率、ので、その初期デザインは従来の PDMS デバイスとしてプロトタイプ宣言されて場合があります。 - 乳剤フィルム フォトマスクに CAD ファイルを変換します。公称 64 k DPI の解像度を使用すると、約 5 μ m のサイズまで正確な機能を許可できます。
注: これが商業サービスを介して行うことができます。画像サービスはマスク画像ファイル変換を合理化する異なる図面規則を好むことがあります。変換中に撮影困難なトラブルを避けるため事前に最寄り図面の規則についてお問い合わせください。黒の背景上の透明な機能とマスク レプリカ成形の間に機能的な PDMS マイクロ流路を生成するウェーハに SU8 フォトレジスト機能のパターンが。ターンでは、背景が透明なマスクにブラックの特徴は PDMS 金型 x 線チップ作製に適したを準備に必要な。X 線チップにデザインを変換する前に PDMS デバイスを作製する初期の試作と設計検証を許可する両方のマスクの極性の順序をお勧めします。
- 適切な CAD プログラムを使用して目的のチャンネル ジオメトリを概説します。フォトレジスト レイヤーごとに個別のマスクを準備します。このプロトコルで使用されるすべてのデザインは結果のセクションで詳細で説明している、AutoCad として利用可能な '。DWG'補足ファイル 1の形式。
- SU8 マスター作製
注: これは、クリーン ルーム内で実行する必要がある唯一のプロセスです。重要なクリーン ルーム機器を使用できない場合完了ステップは準備模様 SU8 マスターを提供する MEMS ファウンドリ サービス企業に委託することができます。データ シートの指示に従ってプロセス SU8。1.2.1 に 1.2.4 の手順は、表 1に示す 3 層 x 線チップ設計の完全なパラメーターの一般的な SU8 マスター製作ワークフローをまとめたもの。配置されている多層 SU8 入門以前29を公開。- SU8 の約 1 mL を注ぐは表 1 (図 1手順 1) で指定されている適切な回転速度と時間を使用して所望の厚さまで SU8 3 インチのウェハとスピン コートに抵抗します。数分ごとに 65 ° C および 95 ° C で層の厚さに応じてフォトレジストを焼く前。固める SU8 フォトマスクへの付着を防ぐために、(図 12 のステップ) 基板にレジストの密着性を高めるために、プリ ・ ベークを実行します。
- テーブル 1が続く 95 ° c の後露出焼く触媒 (図 1手順 3) に露光中に開始反応を完了するために指定されている UV ライトにフォトレジストを公開します。
- その後レイヤーごとにこの手順を繰り返します。[マスクア ライナーとノギス アライメント マーク29を使用するマスターとそれ以降のレイヤーのマスクを合わせます。
- すべて非公開 SU8 にイソプロパノール洗浄不要になったミルキー沈殿物 (図 1手順 4) を明らかにするまで、プロピレン ・ グリコール メチル エーテル アセテート (PGMEA) 内のウェハを開発することによって抵抗を洗い流します。加圧窒素でウェハを乾燥させます。
注: イソプロパノールは SU8 の貧溶媒との沈殿物を示す残留未硬化のまま。
- PDMS 金型製作
- ペトリ皿 (10 cm) にアルミ箔 (15 × 15 cm) の部分を置き、SU8 マスター ペトリ皿に PDMS 硬化後マスターを簡単に除去のためのアルミホイルの上に配置します。
- シリコーン系を混ぜて、硬化剤 (10:1)、瓶にヘラで精力的に 25 g の合計含有量の結果または機械的ミキサー。ペトリ皿 (10 cm) の 3 インチのウェハは、5 mm 厚スラブに発生する PDMS の約 25 g を消費します。
- いいえ、まで空気の泡を削除する高さの 4 mm. Desiccate 5 分 PDMS SU8 マスター (図 1ステップ 5) に予混合 PDMS を注ぐまたは PDMS 表面にのみほとんどの泡が残っていません。
- 1 h の 70 ° C のオーブンで PDMS を治します。メスと硬化 PDMS を切り出して、SU8 マスター (図 1のステップ 6) から PDMS 金型を慎重にはがします。剥離中に PDMS 亀裂を防ぐためにマスターまでカットします。
- 省略可能: マスターのすべて SU8 レイヤーが必要な厚さ (図 1) であることを確認する PDMS 金型の断面のスライスを準備します。初期のマイクロ チャンネル レイアウトのテストは、すべての PDMS チップで実行できます。
注: レプリカ成形 PDMS 接着できます直接ガラス基板 20 を使用して O2プラズマ活性化を介して PDMS にアクセス ポート (ステップ 3.3) を打ち抜き加工後 s, 0.4 mbar O2, 50 W、13.56 MHz。前述のセクション 1.2 で。、極性をマスク、それ故に x 線チップ作製のための輪郭をウェハ反対この必要があります。
2 x 線その場でチップの製造。
- 最終的なエタノール濃度 40 wt % のエタノールで両方のエポキシ樹脂の前駆物質を希釈します。エタノールで各エポキシ樹脂の前駆体の 0.25 g の総質量は、1 1 cm2チップに十分です。
注: これは結果 5 分エポキシ混合無気泡とレプリカ金型鋳造、簡素化して最終硬化エポキシ層の厚さを最小限に抑えるための粘度を減少します。エタノールは、硬化の段階、PDMS を通して蒸発します。 - ドガの 30 分間真空デシケータの PDMS 金型成形段階エポキシ樹脂から小さい空気泡を吸収できるように。
- 約 70 × 70 mm とそれ 75 × 50 mm ガラスの裏面にテープで平らで堅い表面を得るためのテープを使用してスライド範囲にポリイミド箔をカットします。プラズマは 50 W、13.56 MHz、20 0.4 mbar O2プラズマと箔をアクティブに s、1 vol % (3-アミノプロピル) 持 (ピンズ) または 20 ° C で 5 分間 (3-glycidyloxypropyl) 持 (GPT) の水溶液中で完全な箔スライドをインキュベーションして
- 徹底的に混ぜるエポキシ両方希釈したエタノールの前駆体ソリューション硬化の最適な動作を確保します。真空チャンバーから PDMS 金型を取得し、平らな面に配置します。マイクロ ピペット (微細構造の 1 cm2につき約 10 μ L) を使用して、金型の各組織への混合樹脂の液滴をすばやく分注 (図 1ステップ 7 a)。
- 水性シラン (アパート メンツまたは GTPS) ソリューションからポリイミド箔スライド サンドイッチを取得します。加圧空気または窒素で箔を乾燥させます。
- 堆積したエポキシ樹脂 (図 1、手順 7b) に準備されたポリイミド箔ガラス スライド サンドイッチを配置します。PDMS 金型に対するポリイミド箔に接続されているスライド ガラスをしっかりと押します。スライド ガラスとし、室温でエポキシ樹脂硬化中の 1 h の最大 1.4 N/cm2の圧力を適用する沈殿物の重みに金属板を配置します。
注: 理想的には、ガレージに残っていない金型の構造体の最大の高さのあるエリアの箔。これらは、結晶化が行われるその後の結晶化の井戸に対応しています。- オプション: 小さなフィーチャの正確な成形が重要な PDMS 金型は、成形中アルミ フレームで補強することができる場合はステップ31です。
- ポリイミド箔とパターンのエポキシ ガラス スライドを削除するには、PDMS 金型 (図 1の手順 8) から剥離します。プラズマ 50 W、13.56 MHz、0.4 mbar O2プラズマ 20 パターン エポキシ側をアクティブにする s。
- プラズマ室からポリイミド箔を除去した後エポキシ模様箔を 1 vol % 水溶液アパート メンツ (または GPT) ソリューションで 20 ° C で 5 分間インキュベートします。同様に、相補的な 1 巻 %gpt (またはアパート メンツ) シラン アクティブ 2 番目非パターン化されたポリイミド箔を準備します。加圧空気と構造化および非構造化の両方の箔を乾燥、インキュベーション後。
- 平らな面、箔のカール防止のため、最大平坦性を確保するための仲介人として下の水の滴の表面張力を用いたエポキシの面を上に配置します。次に、そっとそれらを結合させると気泡の形成を避けるために反対側に 1 つのコーナーから、指で連勝の上部に 2 番目のアクティブ化されたポリイミド箔を置きます。
3. 流体配信アクセス ポート
- SU8 マスターを使用せず 4 mm 1.3.1 に 1.3.3 の手順に従ってペトリ皿に PDMS 厚板を準備します。スラブを PDMS チップの個々 の結晶のコンパートメントをカバーすることがなく、チップのすべての入口ポートをカバーする適切なサイズのブロックにカットします。
- プラズマは、両方ともアクティブにする、20 の 50 W、13.56 MHz、0.4 mbar O2プラズマ内でブロック チップと、PDMS s。化学結合、1 vol % アパート メンツまたは GPT 水溶液 20 ° C で 5 分間の各部品孵化させなさい、加圧空気で各部を乾燥し、箔チップに PDMS スラブを押します。
- 接着を改善するためにフラット PDMS スラブにチップを置くし、きれいなガラスのスライドと金属のブロックが続く、プラスチック ホイルでカバーします。最後に、約 1 時間最大 1.4 N/cm2の圧力を適用する重みを入金します。
- 入口と出口ポートがチップ デザインのマークし、テープで背中をシール各位置に 0.75 mm 生検パンチをアクセス穴をパンチします。チップは今のチューブ外径 (4.2 の手順で詳細な) として穴の直径と一致するの。
4. 表面処理
- 1:20 の準備 9 wt % フッ素樹脂株式 0.45 wt % の最終的な集中にフッ素溶媒の希薄化。4 ° C で暗闇の中で冷蔵庫に原液と希釈液を保存します。
- 1:20 を読み込む 1 mL ルアーロック注射器にフッ素樹脂希釈。27 × 5/8」を添付し、PTFE チューブ針を注射器針。
- X 線切屑の排出口にチューブを接続し、すべてのチャンネルが埋まるまで手順 4.1 で準備フッ素樹脂作業ソリューションを注入します。
- 薄膜コーティングにフルオロポリマーを入金するすべての溶媒を蒸発させるため 5 分間 190 ° C のホット プレート上を平らな面にチップを置きます。
メモ: 新しいジオメトリを使用している場合、チャンネルがこのコーティング プロセス中にフッ素樹脂が詰まっていたかどうかを確認します。もしそうなら、さらに原液を希釈します。
5 蛋白質の準備
- 凍結乾燥タウマチンの重さし、最終的なタンパク質濃度が 40 mg mL-1の適切なボリュームに表 2に掲げる緩衝液に溶かします。
- メーカー プロトコルに従って表 2に示すバッファーに対してグルコースイソメラーゼを dialyze します。
- シューベルトらによって前述のように蛋白チオレドキシンを準備します。30。
- みてにまとめて表 2、ProtParam32ソフトウェアによって計算された吸光係数を使用して最終的なタンパク質の濃度を確認します。
- 超純水を使用してすべてのソリューションを準備し、0.2 μ m フィルターでそれらをフィルタ リングします。
- 16100 × g で 15 分 20 ° C でタンパク質溶液を遠心し、結晶化実験の上澄みを取る。
6 x 線・ チップ タンパク質の結晶化
- マイクロ流体チップに蛋白質を結晶化するには、蛋白質溶液と沈殿溶液の同量をミックスします。蛋白質の集中、バッファー組成および沈殿の組成は、表 2にまとめます。マイクロ流体チップに合わせて約 20 μ L の総ボリュームを準備します。
- すぐに混合した後、薬液を注入チップを経由して注射器の入口に 27 × 5/8"針そして PTFE チューブと相まって 0.75 mm 外径 (4.2 の手順で詳述)。
注: シリアルのレイアウトの充填手順には、フッ素系のオイルは、最も簡単な入口ポートを介して結晶化溶液を注入する前に出口からフッ素オイルを読み込むことにより実行チップの事前準備が必要です。読み込み手順をすべて監視してください適用シリンジ圧と対応する流量を制御する顕微鏡を使用しています。」 - チップを記入すると後、は、チップの入口ポートにフッ素オイルを注入することによって個々 の結晶のコンパートメントを区切ります。チップは、チップのすべての入口および出口ポートをブロックすることによりシールします。これは、クリップを挿入することによってすることであります。
注: 結晶化コンパートメントはタンパク質/鉛塩法ソリューションによって満たされる、ためフッ素オイルを埋めるだけチップの入口チャネル結晶コンパートメントのソリューションに影響を与えずに。 - 蒸気拡散結晶化機構を模倣するには、周囲温度とポリイミド箔を介して水の蒸発によって縮小する結晶化コンパートメントにおける液滴を許可するように通常雰囲気で密封されたチップを置きます。
- 顕微鏡で観察される形成結晶後またはさらに x 線回折まで結晶化の井戸からの蒸発を停止する適切な沈殿ソリューションに完全なマイクロ流体チップを伝達する DLS 測定 (ステップ 7)実験を行った.
7. 動的光散乱測定チップの結晶化の井戸で
注: DL 測定はレーザー出力の出力は 100 mW、波長 660 nm、散乱光は散乱角は 142 ° で検出されました。調査サンプルのすべてのソリューション水溶液から水の屈折 (n = 1.33) すべての計算に使用されました。
- 場所、マイクロ流体チップで、8.1 の手順に従ってアダプターを使用して、DLS 音色の SBS 形式プレート ホルダーに。デバイスにアダプターを挿入します。
- 慎重に、モーターを備えられた x, y, z ステージを用いたマイクロ流体チップのコンパートメントの中レーザーの焦点を調整します。マイクロ流体チップは非常に薄いので、小さなインクリメントの手順を適用することによって z レベルを調整します。
注: 正しい調整は高インターセプトと DLS 測定結果の自己相関関数の滑らかな尾によって確認されます。校正ファイルは、マイクロ チップは、時間の経過とともにいくつかのコンパートメントに自動 DL 測定が可能で各の個々 の結晶の位置を一致するように作成できます。 - 30 s と繰り返しの 293 K で各 DL 測定を行う測定結晶化実験が終了するまで 5 分ごと。
注: 初期核の後に、時間をかけて DL 測定の半径方向分布され、成功した結晶形成することができます並行 DL プレート リーダーの内蔵の顕微鏡。
8. 回折データ収集
- ビームラインのゴニオ メーター用アダプター
- プレート計用のアダプターを配置および結晶学的データの収集中に x 線のチップを回転するを印刷します。
- 既定のパラメーター設定を使用して、製造元の推奨どおり趣味等級 3 D プリンターの基本計用アダプターを作製します。
注: アダプターは、3 D Cad を使用して設計されていたし、アダプターの座標ファイルがのアタッチされます '。STL'-サプリメントのファイル形式。 - 両面テープを使用してアダプターに x 線のチップを修正します。
-
その場x 線結晶構造解析
- 12.8 のエネルギーを持つ x 線 296 k. 使用でビーム径 10 × 5 μ m (ガウス分布の半値幅) を使った回折データ収集 keV と 2.2 · フラックス1011光子 ·s-1弱毒ビームとピラタス 6 M ハイブリッド ピクセル検出器を用いた回折パターン。
注: タウマチンを含むマイクロ流体デバイス、グルコース異性化酵素、チオレドキシン結晶 EMBL ビームライン P14 ペトラ III シンクロトロンの場x 線結晶学的実験に使用されます。使用可能なビーム焦点サイズとフラックスは、他の x 線源で異なる場合があります。露出したタンパク質結晶、各結晶、露出あたり振動角度範囲と露出時間から記録された回折パターン数の数は、表 3にまとめます。 - XDS33プログラムを使用して個別に 2 つの連続した回折パターンの処理を設定します。サプリメントは、"xds.sh"の bash スクリプトを使用します。
- すべての結晶から各データセットの HKL ファイルを作成し、XSCALE33ソフトウェアを使用してそれらを拡張します。XSCALE の入力ファイルを作成するのに、サプリメントで bash スクリプト"xscale.sh"を使用します。
注: 90%、同型の高度を示すより大きい相関係数を有する結晶のデータセットのみのスケーリングが必要です。保守的な基準 ‹I/σ (I) › (> 2) 最高解像度シェルを使用する必要があります。MOLREP34 CCP4 スイート35からプログラムを使用して分子の置換を使用して、さらにモデルを表 3に示す蛋白質のデータ ・ バンク (PDB) の 3 D の座標を使用して構築のフェーズを取得できます。 - 同位体 Refmac535,36を使用してすべての構造を調整し、最終的なモデルの外観検査オオバン37を使用します。
注: 溶媒分子は洗練されたプロセス中に自動的に追加する必要がありますおよび化学的に妥当な位置を確認するチェックする必要があります。すべてのモデルは、ラマチャンドランは外れ値を識別するために点検しなければなりません。
- 12.8 のエネルギーを持つ x 線 296 k. 使用でビーム径 10 × 5 μ m (ガウス分布の半値幅) を使った回折データ収集 keV と 2.2 · フラックス1011光子 ·s-1弱毒ビームとピラタス 6 M ハイブリッド ピクセル検出器を用いた回折パターン。
9. データの評価
- 放射線損傷
- オーウェンら38で説明したメソッドを使用して時間をかけて回折力の崩壊を分析します。このため、各評価回折データセット (2 連続した回折パターン)、参照値として使用するすべてのインデックス付き反射の I/σ(I) (XDS33によって提供される) の合計を計算します。サプリメントから bash スクリプト"ISigma.sh"を使用します。
- 最初のデータセットの平均の回折電力各データセットの回折電力を正規化します。
- XDS33 (サプリメントからの bash スクリプト「Rmeas.sh」) から入手したCorrect.LPファイルから Rmeas 値を取ることによって時間をかけて Rmeas 値変化を分析します。
- 結晶方位
- 研究室の座標系を尊重し結晶格子方向の分布に関する情報を取得するオイラー角を決定します。XPARM39ソフトウェア Matlab を使用して出力ファイルの指定された XDS 方向行列からオイラー角を計算します。Bash スクリプト"rotation_matrix.sh"を使用して、XPARM ファイルから各結晶から回転行列を抽出します。Matlab で入力として出力ファイルを使用して、オイラー角を Matlab の関数 rotro2eu.m (補助ファイル) を使用して計算します。
注: 計算の詳細な説明は、Zarrine Afsarら40によって公開されています。 - 得られるオイラー角をラジアンから度に変換します。10 ° のクラスでのすべての 3 つの回転平面 (xy、xz、斉次) の得られるオイラー角をグループ化し、Origin9 ソフトウェアを使用してそれらをプロットします。
- 研究室の座標系を尊重し結晶格子方向の分布に関する情報を取得するオイラー角を決定します。XPARM39ソフトウェア Matlab を使用して出力ファイルの指定された XDS 方向行列からオイラー角を計算します。Bash スクリプト"rotation_matrix.sh"を使用して、XPARM ファイルから各結晶から回転行列を抽出します。Matlab で入力として出力ファイルを使用して、オイラー角を Matlab の関数 rotro2eu.m (補助ファイル) を使用して計算します。
Representative Results
エポキシは x 線チップ作製のための優秀な充填材料です。特殊なツール (図 1) を必要とせず安価、シンプルで堅牢なプロセスです。40 wt % のエタノールで薄めてエポキシ粘度を減らすと、x 線で定義したウィンドウの結果上記の結晶だけでなく、余分な樹脂の除去が促進されます。高いエタノールの希釈は、樹脂硬化物の欠陥で起因しました。チップ断面を x 線を分析することによって我々 は 2 × 7.5 μ m (図 2) に使用されるポリイミド箔の公称厚さの近くに非常にある約 19 μ m、厚さに両側の窓の総厚さを決定
結晶化試験ごとに、いくつかのナノリットル サイズ反応区画に41を前述のように、キャピラリー バルブ機構を使用して隔離されました。この 'ストア、作成' 読み込み技術チャネル デッド ボリュームからサンプル損失を回避し、簡単に実行できます手動で、流体作動42のポンプやその他の機器を使用する必要があります。チップは水のサンプルをロードする前にフッ素オイルと準備万端します。プライミング油とインターフェイス間の圧力差で水溶液サンプルの結果の油水界面における表面張力。このラプラスの圧力は、曲率半径とインターフェイスの表面張力の両方に依存します。インターフェイスする必要がありますそのエネルギーを最小限に抑えるため、その主要な一定音量で曲率半径を最大化することに相当する、表面を最小限にします。ワイド チャンネルの曲率が小さくインターフェイス低いラプラス圧狭チャネル セグメントの高曲率のインターフェイスを持っています。したがって、サンプルのプラグインに優先的に入るし、広い流れるバイパス チャネル狭い毛細血管バルブ制限に流れるのではなく。最後に、サンプルの井戸を独立した液滴に分割するフッ素オイル サンプル プラグが続きます。
堅牢で信頼性の高い荷は、シリアルとパラレルの坑井配置 (図 3) では 1 mL/h までの流量で達成されました。「シリアル」のレイアウトでよく入口および毛細血管の弁狭窄順次を介して接続されますバイパス チャネル31。対照的に、'並列' のレイアウトでは、2 つのメイン チャンネルはすべてよく口を接続または毛管バルブのみ43。両方の配置の概念は、以前蛋白質結晶化43,44の便利な側面である画面構成する定式化制御と組み合わされています。シリアルの設計では、2 つの流体ポート、1 つの入口と一つの出口を持っています。少ない液体ポートがあり、このため、構築・運用する方が簡単です。並列のレイアウトでは、4 の流体ポート、井戸を接続するメイン チャンネルの 2 とエスケープ余分な油を抜くためキャピラリ バルブをリンクするための 2 を持っています。読み込みしたがって、メイン チャネルの両側から進むことができます。このレイアウトは全体的に、その短いバイパスによる井戸の等しい数の流れの抵抗を下げます。それはそれ故により良い井戸の数が多いとアップ スケール デバイスに適しています。また、サンプル井戸がある自動化イメージングの利点を提供する一緒に近い指向します。
どちらかはまたは 3 高さ設計の 2 つの高さとして組み込まれている場合も読み込み完了サンプル両方のレイアウト観察されました。2 高さ設計でよくサンプルおよびバイパス チャネルの両方は、同じ高さは。3 高さデザインで必要な 3 つ目のマスク、SU8 層を追加し、さらにサンプル井戸が上記より高くなることを確保するための配置手順をバイパス チャネル。この高さの差動は、後代の流れを停止し、原則を弁体同じ毛細血管を通じてよくサンプル液の入るを推進しています。ここでは、よく天井が高く前進メニスカスとバイパス方向流のラプラス圧は弁狭窄部の流れを遮断するバイパスをそらすため、井戸を完全に入力した後支持のみ下に対応します。ただし、厳密に正常にロードは適切な毛管 valving チャネル幅をそれに応じて調整することによって達成することができます、バイパスより高い井戸を必要ありません。それにもかかわらず、我々 の経験でより高い井戸かなり堅牢を行い欠陥無料ロードは、2 つの高さに相当するすべての 3 つの高さ設計で高い流量に比べて最大 10 倍で観察されました。この効果は、並列のレイアウトでもっと発音されました。
蒸気拡散結晶化機構を模倣するには、ポリイミド箔の有限の透磁率は時間の経過とともに蒸発する水を制御する悪用されました。実験蒸発速度はドロップ表面積とよく高さ (図 4) を等化, 液滴体積の経時的変化を監視することによって定量化されました。X 線チップで結晶井戸から蒸発時間45蒸発が減少率の溶質濃度値を大きくとドロップの縮小面積として直線的に続行されません。初期の蒸発後 0.5 nL h-1シリアル レイアウト ジオメトリの井戸での線形近似率です。
結晶化機構については、マイクロ流体チップの結晶井戸の DLS 測定を行った。初期の DLS 測定スライド ガラスに接着した PDMS チップ光散乱実験のためより良い光学特性を提供するために使用しています。このチップは、x 線のチップと同じよく寸法を持っていた。PDMS は x 線チップ45ポリイミド windows のポリイミドよりも高い水蒸気透過性です。フラックスは、距離に比例して増加、のでウィンドウ ポリイミドの蒸発軌道は、よく、適切な膜厚の対応する PDMS ウィンドウを照合できます。
DLS を示した最初の結晶粒子が観測される前に、初期の核形成を検出する DLS 測定することを示す (図 4 a・ B)、時間の経過と共に変更された半径方向分布。核し、外部から蒸発速度を調整することによってウェルあたりの単結晶を成長するこの情報を使用することができます、したがって過飽和レベル46の核形成の初期の段階。
X 線チップは、ペトラ III (図 5 a) にシンクロトロン P14 の EMBL のビームライン SBS 互換性のあるプレート ゴニオメータの 3 D プリント アダプターを修正しました。また、標準ビームラインのゴニオ メーター21にチップをマウント x 線小さい 3 D 印刷フレームを使用可能性があります。タウマチン結晶サイズは 10-20 μ m (図 5 b)、最大 2.0 の分解能回折 Å (図 5)。11 Å で予想通り、x 線チップの 2 つの薄いポリイミド箔ウィンドウの x 線背景の貢献はポリイミド ポリマー散乱リングに限定 (2 θ ~ 5 °) および 33 Å (2 θ 〜 1.7 °) 0.97 Å の x 線波長。これらの 2 つのリングには、データ処理が不可します。83 タウマチン結晶の全データセットを集め、10 の回折パターンは各フレームの間に 1 ° 回転と各結晶から記録されました。データ処理と洗練されたパラメーターとしてタウマチン データセットの統計情報、また表 3とで収集した場で表示されたグルコース異性化酵素、チオレドキシンの他の 2 つのデータセットと比較表 4。
5 つのサブのデータセットにタウマチン データセットを分割することによって時間の経過と共に標準化された回折力の強度減衰を調べた (2 つの回折パターンは、完全なデータセットを維持するためにはサブセットごと使用された)。図 6Bに示されている、回折電力最初のサブ データセット後減少に転じて、4 番目のサブ データセット内の 50% 以下であった。その結果、サブ データセットの Rmeas 値が時間の経過と共に増えています、データ収集中に x 線照射損傷を示します。我々 はすぐに x 線露光中に生成されるフリーラジカルに同じ反応区画に隣接結晶が劣化すること仮説します。たとえば、そのような二次 x 線損傷だった関連実験的アプローチで顕著で小さい結晶がポリイミド サンドイッチ21の大幅に大きい領域に配布されています。全体的な x 線損傷を最小限に抑えるために部屋の温度に特定の結晶からの回折パターンの数が少ないを集めておくこと。また、マイクロ流体チップのコンパートメントあたり 1 つだけの単結晶を公開する必要があります。それにもかかわらず、処理されたデータセットを使用して洗練されたすべての構造のモデルは、非常に良い立体と適切な統計 (表 4) を示しています。さらに、すべての最終的な電子密度マップは非常に良い品質のだった。
X 線透明チップで従来の結晶学アプローチで方位と結晶の配置が結晶方向40のランダム分布を取得を意図的に操作するか、結晶の動きによって得られました。液体層21内このプロトコルで記述されている x 線透明マイクロ流体チップの結晶方位を評価するには、研究所座標系に関してすべての露出の結晶の単位セル方向が決定しました。我々 はグルコース異性化酵素の結晶 (図 7 b) の広範な分布を得られるモリブデンフラックス タウマチン結晶のわずかな設定 (図 7 a) を認めた.私たちは、ナノメートル スケールのほとんどの材料展示重要な粗さと推論しました。したがって、結晶が自発的に核大幅以下の偏った方向に表面に自発的にことができます。このような小さな結晶核は、サーフェスの法線を基準にして方向転換することがなく適切なサイズに成長を続けながら、方向にロック可能性があります。実際には、表面を介した結晶核形成はプロセスの結晶を損なうことがなく表面を離れて接続されている結晶をループするしようとして crystallographers に迷惑をずっと。ここでは、我々 は直接そのような結晶回折データ収集を利用できます。ただし、システムの特定の制限事項が存在する、チオレドキシンは xy、xz と yz 面 (図 7) ある特定の方向のための強い好みを明らかに。示した例は、生育環境、結晶形にも方位分布がのみに依存しないことを示します。チオレドキシン結晶モリブデンフラックス正方晶タウマチンの結晶または斜方晶グルコース異性化酵素の結晶はこの現象を示さない間、最寄りの方向に成長する傾向がある図形を延長しています。ただし、すべてのケースで配向結晶回転のアクセス可能な範囲がすべての相互スペースおよびそれ故に完全なデータ セットの十分なカバレッジの結果があってもに蛋白質を調査します。したがって、x 線露光用結晶を選択するときに実行する追加措置はなかった。
図 1: マイクロ x 線チップ作製のスキーム。(1) SU 8 がシリコン基板と目的の層の厚さを取得するスピンコートに分配されます。(2) フォトレジストは、マスクを通して紫外線に公開されます。(3) 非公開のフォトレジストを連続する PGMEA とイソプロパノール洗浄することにより離れて開発しています、さらに鋳造の SU 8 マスターのステップ (4) の結果します。(5) PDMS の上に、注がれています SU 8 マスターから剥離は PDMS 金型の硬化後 (6) とします。(7 a) エポキシ接着剤が PDMS 金型に分配される (7 b) 活性化ポリイミド箔は化学的にエポキシ樹脂に接着します。(8) 硬化後パターン エポキシ フィルム ポリイミド箔、PDMS モールドから剥離します。(9) の最後のステップでは、デバイスは囲まれた低 x 線背景のマイクロ流体チップをもたらす第 2 ポリイミド箔で蓋をします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 写真 (左) と最終的なチップの断面の顕微鏡画像。代表的なチャネル セグメント (中央) と (右) 2 つの独立したチップからの結晶化も表示されます。矢印は、測定距離を示します。すべてのディメンションは、μ mこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 結晶化の模式図の [パラレル ポートまたは [B] シリアル レイアウトとデザインも μ m で示される寸法を上からと横からを見た。典型的なチャネル ハイツだった: 50 μ m のバイパスは、50-60 μ m の結晶も、まあ約 2.5 のボリュームに対応する 5-10 μ m キャピラリー バルブ nL (並列レイアウト) と 8 nL (シリアル レイアウト)。代表も読み込み動作は、食用色素を使用しています。チップ評価された食品染料だったペンストレージ井戸に注入される前に 12 wt %1 H、1 H、2 H、2 H-ペルフルオロ-1-オクタノール FC-43 へ。白い矢印は、フローの方向を示します。すべての井戸が読み込まれるの読み込まれたデバイス ショーの概要画像無料、示す堅牢なサンプル読み込みを欠陥します。シリアルのレイアウトの井戸 2 高さデザインとして描かれているし、同じ高さを持つバイパス、バイパスより高い結晶井戸 3 高さデザインとして並列のレイアウトが示されています。典型的な流量は、読み込み中に約 150 μ L/h をされたが、3 つの高さ設計で 1 mL/h までの流量の観察された欠陥無料ロード。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: よく時間をかけて結晶化その場観察動的光散乱します。[よく結晶化 A] 顕微鏡画像シリーズ。連続ストアドの液滴は、時間の経過とともに蒸発する水蒸気を縮小します。[A] の撮影同じ結晶化プロセス中に DL を用いてタウマチン粒子の 4 h [B] 対応する流体力学的半径分布後最初タウマチン微結晶を観察できます。約 1-2 h. [C] 代表ボリューム後初期核生成イベントを見ることができるを示す、2 番目の半径分数の形成は、時間をかけて蒸発水損失のための 2 つの参照液滴ボリュームの減少します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 回折データ収集の in situ 。【 A 】 個々 のマイクロ チップは、プレート ゴニオメータ上 (青) 3 D プリント アダプターでマウントされます。[B] タウマチン結晶、マイクロは、P14 のビームライン ラインで顕微鏡によって撮影された x 線露光中にチップします。[C] タウマチン結晶の回折は 2.0 の解像度に記録された Å、サイドスの背景を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 部屋の温度でマイクロ流体チップでタウマチン結晶からの回折データのデータ評価を記録します。[1-2 データセットのみ (1.5 σ で青い輪郭) フレームを用いた洗練されたタウマチン モデルの A] 電子密度。[X 線照射量の関数としてタウマチン結晶の強度 B] 崩壊。[C] x 線線量を Rmeas 値の進化。ボックス プロット [b] と [C] 四分位数 (上限値 75%、中央値 50%、下限値 25% と平均) とひげの 95% 信頼区間を表す回折強度の減衰と露出のすべての結晶の Rmeas (n = 83)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 単位セル内の方位分布研究所座標系に関してマイクロ流体チップ箔します。[A] モリブデンフラックス タウマチンの結晶は、xy - (青)、xz 平面 (緑)、yz-(red) 面でほぼ 180 ° をカバーの向きの広範な分布を示した。[[C] チオレドキシン強い選好を示した特定の方向 B] グルコースイソメラーゼはまた広範囲な分布を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| SU8 層 | スピン コート | プリ ・ ベーク | 公開します。 | 後焼く |
| [65/95 ° C] | [65/95 ° C] | |||
| 1stレイヤー: 井戸 | 1000 RPM | 0/10 分 | 200 mJ/cm2 | 1/4 分 |
| 15 μ m SU8-3010 | ||||
| 2ndレイヤー: バイパス | 2000 RPM | 0/16 分 | 220 mJ/cm2 | 1/5 分 |
| 35 μ m SU8-3025 | ||||
| 3rdレイヤー: バルブ | 3000 RPM | 0/3 分 | 150 mJ/cm2 | 1/2 分 |
| 5 μ m SU8-3005 |
表 1: 3 層平行 x 線チップ設計の SU8 プロセスの例です。この層の秩序に x 線チップ作製の PDMS を鋳型になります。直接、PDMS を金型試作中に、レイヤーの 3rdから 1stレイヤーで代わりに終了を開始するマスター製作中に順序を逆に。
| タンパク質 | 蛋白質の集中 | タンパク質バッファー | 沈殿 | 空間群、PDB エントリー | 消散係数 [M-1 cm-1] |
| タウマチン (Thaumatococcus daniellii) | 40 mg mL-1 | 50 mM ビス-トリス、pH 6.5 | 1.1 50 mM トリス、pH 6.8 酒石酸ナトリウム M | I4222、1LR2 | 29420 |
| グルコースイソメラーゼ (放線菌 rubiginosus) | 25 mg mL-1 | 10 mM HEPES、1 mM MgCl2, pH 7.0 | 100 mM ビス トリス、2.7 M のアンモニウムの硫酸塩、pH 5.7 | 4ZB2 含ま I222 | 46410 |
| チオレドキシン (バンクロフト糸状虫) | 34 mg mL-1 | 20 mM トリス-HCl、5 mM 150 mM 塩化ナトリウム、EDTA、pH 8.0 | 27.5 %peg1500、100 mM SPG バッファー、pH 6.3 | P41212、4FYU | 24075 |
表 2: 結晶化条件と消光係数と pdb コードを含む準備、タンパク質結晶の空間群。
| タンパク質 | 公開されている結晶の数 | 回折結晶あたりの数 | 露出 [°] あたりの振動の範囲 | 露出時間 [ms] | MR の PDB エントリー |
| タウマチン (Thaumatococcus daniellii) | 103 | 10 | 1 | 40 | 1LR2 |
| グルコースイソメラーゼ (放線菌 rubiginosus) | 69 | 100 | 0.1 | 80 | 4ZB2 |
| チオレドキシン (バンクロフト糸状虫) | 68 | 10 | 1 | 40 | 4FYU |
表 3: x 線回折データ コレクションのパラメーター。
| データ コレクションの統計情報 | タウマチン (枠 1-20) |
グルコースイソメラーゼ (フレーム 1-100) | チオレドキシン (枠 1-10) |
| ビームライン | P14 | ||
| 波長 [Å] | 0.96863 | ||
| スペース グループ | P41212 | 含ま I222 | P42212 |
| 単位セル パラメーター: = b、c [Å] | 58.62, 151.48 | 103.04、99.60 93.91 | 58.45、151.59 |
| 結晶の数 | 101 | 41 | 34 |
| 合計発振 [°] | 10 | 10 | 10 |
| 解像度 [Å] | 30.1.1989 (1.95-1.89) |
30.1.1975 (1.80-1.75) |
30.3.2000 (3.20-3.00) |
| 温度 [K] | 296 | 296 | 296 |
| R p.i.m.b | 7.5 (25.5) | 8.8 (28.0) | 9.1 (33.2) |
| 測定された反射 | 1553200 | 690000 | 1111196 |
| ユニークな反射 | 21850 | 48942 | 44449 |
| 平均 I/σ(I) | 6.07 (1.78) | 5.85 (1.66) | 4.08 (1.47) |
| Mn(I) 半セット相関 CC(1/2) | 96.2 (72.2) | 95.8 (68.2) | 97.9 (75.3) |
| 完全性 [%] | 99.8 (100.0) | 100.0 (99.9) | 99.9 (100.0) |
| 冗長性 | 71.1 | 14.1 | 25 |
| 洗練された統計情報 | |||
| 解像度範囲 [Å] | 1989/01/30 | 1975/01/30 | 2000/03/30 |
| R/R無料[%] | 18.8/23.9 | 18.1/20.5 | 18.9/23.1 |
| タンパク質原子 | 1550 | 3045 | 1129 |
| 水の分子 | 51 | 111 | 164 |
| リガンド分子 | 20 | 0 | 0 |
| Rms の偏差 | |||
| 付着長 [Å] | 0.02 | 0.026 | 0.01 |
| 結合角 [°] | 2.04 | 2.22 | 1.43 |
| B 要因 [Å2] | |||
| タンパク質 | 22.6 | 20 | 50 |
| 水 | 25.1 | 27.1 | 29.7 |
| 配位子 | 20.4 | ||
| ラマチャンドラン プロット解析 | |||
| 最も支持された地域 [%] | 97.67 | 95.32 | 96.13 |
| 許可された地域 [%] | 2.44 | 4.16 | 3.64 |
| 寛大 [%] の領域を許可 | 0.49 | 0.52 | 0.23 |
| a: 括弧内の値は、最高解像度シェルです。 | |||
b: ( )、(hkl) は反射 hkl の平均強度、Σhkl は合計すべての反射、Σi が合計反射 hkl の測定。 |
|||
表 4: データ コレクション タウマチン、グルコース異性化酵素、チオレドキシンからデータセットの統計情報です。
Supplementry ファイル 1: chip_geometry.dwg です。使用チップ形状の CAD ファイルです。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Supplementry ファイル 2: goniometer_adapter.stl です。X 線チップ ゴニオメータ アダプターを指定する STL ファイル。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Supplementry ファイル 3: xds.sh です。XDS による回折データのウェッジを処理する入力ファイルを作成するためのスクリプトは bash します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Supplementry ファイル 4: xscale.sh です。Bash スクリプトのサブセットからの回折データをマージし、HKL ファイルを作成します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Supplementry-ファイル 5: ISigma.sh.すべての個別のサブセットから ISigma の値を抽出するためのスクリプトは bash します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Supplementry-ファイル 6: Rmeas.sh です。すべての個別のサブセットから Rmeas の値を抽出するためのスクリプトは bash します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Supplementry ファイル 7: rotation_matrix.sh です。Bash スクリプト Matlab 回転行列からオイラー角を計算するための入力ファイルを準備します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
窓材として材料とポリイミド箔を充填エポキシ樹脂のパターニングによる x 線回折その場観察のためのマイクロ流体デバイスを作製します。私たちの手順は、以前 x 線チップ デザイン16,21以上作製プロセスの様々 なステップを最適化されています。我々 はウィンドウの厚さを減少、それにより作製も緩和しながら散乱背景として少ないプロセスの手順が必要です。その場で結晶化が記述されているプロトコルを使用してには、実質的な利点があります。室温で回折データ収集し、それによっていくつかのケースでタンパク質構造の人工物を導入するリスクを含んだ低温保護の必要性を除外します。さらに、ネイティブな環境から結晶の転送を避けることができるため、結晶はありません物理的なストレスの対象となります。このプロシージャを介して結晶は最高品質を維持し、任意の治療に苦しむしません。
私たちの経験ではプロトコルの中で最も重要な手順の結晶化プロセスを制御する中心です。適切な寸法と適切な結晶を x 線を取得するパラメーターを経験的に識別する必要があり、蒸気拡散実験から直接撮影することはできません。同一濃度のタンパク質と鉛塩法を使用して常にされませんでした別のチップ、または時同じチップ内でさまざまな坑井の結晶。これは結晶の核生成と成長に影響を与えるすべての要因を (蒸発軌道) を通じて母酒の組成や結晶化速度など、慎重に検討する必要があることを示します。大きい水晶は、高い解像度に回折、適当に大きな結晶が理想的に成長してください。結晶核生成と成長のプロセスは、DLS 測定後すること。~ 50 μ m の中レーザーの焦点を調整するチップの薄い結晶コンパートメントは挑戦することができ、慎重に手動位置合わせを必要とする場合があります。100 μ m よりも深い井戸を用いたレーザー自動整列だった可能で信頼性が高く、自動取得スキームを通じて複数の井戸を監視することが。
ポリイミド ベース x 線チップ生産のみ低バック グラウンドと 3 つのタンパク質のモデル構造を解くことによってルーチン x 線回折データ収集のためのこれらの装置の適合性を示します。大きくタンパク質結晶と従来の x 線データ コレクションから以前達成の解像度と比較してチップの最高解像度が異なっていた。さらに結晶化条件の最適化がさらに回折を向上、これはいくつかの要因かもしれません。最大適用クリスタルが 30 μ m より小さい寸法 1.8 Å 分解能その場回折データを収集することが可能だった。タウマチン回折データの詳細な分析は、放射線被害についての洞察を提供しました。放射線被害の拡張を制限するには、隣接結晶とラジカルの拡散が起こり、マイクロ流体デバイスのコンパートメントあたり 1 つだけの単結晶を公開する必要があります。データ収集の速度を向上させる、これを将来に自動化する必要があります。
結晶形態のためいくつかのケースで配向が発生ことができます。これだったたとえばチオレドキシン データセットの場合、結晶強く配向チップ windows を基準。ここでも、完全な回折データセットを収集することができます。結晶がチップの配向を展示し、特に対応する空間群にも低対称性がある場合、データセットの完全性監視してくださいコレクションされている十分な回折パターン杖、その場合収集。
ポンプ ・ プローブによる反応を誘起光を用いた場合、これらのチップを用いた時間分解研究が直接可能です。ポンプ レーザー用ポリイミド箔の光透過が解明する、また、ポリイミドを光学的にオフする必要があります。 または coc 認証も使用できます。現在のマイクロ形状は基板結晶が成長した後に実験を混合できないようにします。しかし、このような両方の時間分解 x 線回折のためのデザインを混合し同様散乱アプローチ19にも適応するのに記載されている x 線チップ作製プロトコルを見込んでいます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、ピア シード基金 PIF-2015-46 によって支えられた、BMBF 付与、ドイツの '超高速イメージング-構造、ダイナミクス、原子スケールでの物質の制御のためのハンブルク中心部' 卓越したクラスターと 05K12GU3、05K16GUA研究振興協会 (DFG)。自由電子レーザー研究センターと共著の作業指向プログラム資金によるヘルムホルツ協会によって資金を供給されました。EMBL ハンブルクでペトラ III ストレージ リング (DESY, ハンブルク, ドイツ) で放射光 MX データを集めた P14 運営のビームラインが。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 3000 Series | MicroChem Corp. | SU-8 3000 | Photoresist |
| PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
| Isopropyl alcohol | Solvent | ||
| Ethanol | Solvent | ||
| Epoxy glue | UHU | Plus Schnellfest 5 min | Epoxy glue |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
| Kapton foil | Dupont/ American Durafilm | HN grade, gauge 30 (7.5 μm) | polyimide foil |
| APTS | Sigma-Aldrich | 440140 | Chemical |
| GPTS | Sigma-Aldrich | 440167 | Chemical |
| Cytop CTX-109AE | Asahi Glass Co. Ltd | Cytop CTX-109AE | Cytop fluoropolymer coating |
| CT-Solv 100E | Asahi Glass Co. Ltd | CT-Solv 100E | Cytop fluoro-solvent |
| HFE-7500 | 3M | Novec 7500 | Fluorinated oil |
| AutoCAD | AutoDesk Inc. | AutoCAD | CAD Software |
| Biopsy Punch | Harris | Uni-core 0.75 mm | |
| Photo mask | JD Photo Data | ||
| 3 inch wafer | University Wafer | Silicon wafer | |
| Mask aligner | SÜSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner |
| PDMS mixer | Thinky | ARE-250 | |
| Plasma machine | Diener electronic | Zepto | |
| Thaumatin | Sigma Aldrich | T7638 | Protein |
| Glucose Isomerase | Hamton Research | HR7-102 | Protein |
| Bis-Tris | Sigma Aldrich | B9754 | Chemical |
| Sodium Tartrate | Merck | 106664 | Chemical |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10812846001 | Chemical |
| HEPES | Carl Roth | 6763.2 | Chemical |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 208337 | Chemical |
| Ammonium Sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Chemical |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Chemical |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 1064060250 | Chemical |
| PEG1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | Chemical |
| SPG buffer | Jena Bioscience | CSS-389 | Chemical |
| SpectroLight600 | XtalConcepts | DLS Instrument | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Spectrophotometer | |
| Zentrifuge | Eppendorf | ||
| Ultimaker2 | Ultimaker | 3D printer | |
| Form2 | Formlabs | 3D printer | |
| Amicon Filter | Sartorius Stedim | 0.2 µm filter | |
| Tubing | Adtech Polymer Engineering Ltd | Bioblock/05 | PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter |
| Syringes | BD | 309628 | 1ml Luer-Lock Tip |
| Needle | Terumo Agani Needle | AN*2716R1 | 27Gx5/8" |
References
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