Summary
Протокол, описанные здесь, это метод для измерения endoreduplication внутри клубней картофеля (Solanum tuberosum). Она включает в себя плазмолиза и протопластов извлечения шаги для уменьшения шума и мусора в анализ гранулярных вниз по течению потока.
Abstract
Endoreduplication, репликация ядерного генома клетки без последующего цитокинез, дает клетки с повышенным содержанием ДНК и ассоциируется с специализации, развития и роста в клеточных размер. В растениях endoreduplication, как представляется, содействия росту и расширению некоторых тканей и органов. Среди них – клубней картофеля (Solanum tuberosum), который претерпевает значительные сотовой расширения в выполнении его функции хранения углеводов. Таким образом endoreduplication может играть важную роль в как клубни способны вместить это обилие углерода. Однако сотовой мусора, вытекающие из сырой изоляции ядерных методов клубней, методы, которые могут быть использованы эффективно с листьями, исключает оценки индекса endoreduplication клубней (EI). Эта статья представляет технику для оценки endoreduplication клубней через изоляции протопласта, в то время как демонстрации представитель результаты получены из различных генотипов и разобщенным тканей клубня. Основные ограничения протокола являются расходы на время и реагентов, необходимых для подготовки проб, а также относительно короткий срок образцов после лизиса протопласта. В то время как протокол чувствителен к технических вариантов, он представляет улучшение над традиционными методами ядерной изоляции от этих крупных специализированных клеток. Предлагаются возможности для усовершенствования протокола например рециркуляции фермента, использование фиксативов и другие изменения.
Introduction
Endoreduplication — это процесс, в которой клетки forgoes типичный клеточного цикла и вместо этого подвергается альтернативный курс развития, состоящий из повторяющихся раундов репликации ДНК без клеточное деление. Результирующая ячейка будет увеличена ДНК контента и ядерный размер, который считается играть определенную роль в клеточной регуляции, расширение и специализации. Как правило раунд endoreduplication (называется endocycle) и соответствующее увеличение содержание ДНК, связанные с большего объема клетки, наблюдение, что вызвало «karyoplasmic теория», что повышенное содержание ДНК требуется правильно регулировать больше, возможно, более комплекс, ячейка1. Это явление встречается в высших растений, в широкий спектр тканей, в том числе с структурных/оборонительного (трихом)2,3, было отмечено питательные (кукуруза эндосперм)4,5и раковина/хранения ( Томат околоплодника; 8 функции клубней картофеля)6,,7,. В плодах было предложено, что endoreduplication играет определенную роль в содействии быстрое расширение околоплодника, что подтверждается негативного отношения между endoreduplication и плоды развития период9. К примеру клетки с ДНК контента до 512C (512 раз гаплоидным геномом) наблюдались в томатном околоплодник8. Кроме того Шевалье et al. (2014) показал, что изменения в экспрессии генов клеточного цикла может привести к повышение уровня endoreduplication в пределах околоплодника который затем приводит к более крупные плоды10. Таким образом изменения генов, содействие endoreduplication обеспечивает потенциальной мишенью для улучшения биомассы или урожайности путем селекции растений или генетические манипуляции. Однако такое улучшение зависит от более глубокого понимания причин и последствий endoreduplication.
Endoreduplication наиболее часто измеряется через проточной цитометрии, whereby ядер, выпущенный в сырой ткани препаратов11, инкубируют с ДНК связывающих Флюорофор, такие как пропидий йодидом12 (PI). Отфильтрованных выборок затем передаются лазером проточный цитометр, где можно наблюдать выбросов длин волн для Флюорофор. Интенсивность флуоресценции в каждом событии (то есть ядро) напрямую коррелирует с ДНК содержание частиц. Таким образом сравнивая с известным стандарта, может рассчитываться относительное и абсолютное содержание ДНК клеток в данной выборке. Endoreduplication индексы (EI) определяются путем создания среднее количество endocycles в клетку в образец, наблюдая за содержание клеточной ДНК (C-значение) где 1C является содержание ДНК клеток haploid (Формула представлены в шаге 6.7 протокол). К примеру в диплоидный организм, базовый содержание ДНК соматических клеток — 2C. Если образец имеет несколько клеток с 4C, соответствующий для одного раунда endoreduplication, или больше было бы EI около 0; Однако если почти все клетки являются 4C EI бы приблизительно 1. Однако как несколько раундов endoreduplication являются общими в высших растений наблюдается EI значения могут быть намного больше. При расчете endoreduplication индексов может быть сравнительно простой, он требует, что относительного обилия ядер C-значения будут надежно выяснена, исключающей в определенных видов и тканей (в том числе клубней картофеля). Вполне вероятно, что различия в клеточном анатомии, химии или клеточной стенки композиция13 вызывают эти примеры, чтобы быть упорствующих в типичных подготовку с помощью лезвия бритвы выпустить ядер непосредственно в соответствующие буферы, которые обычно используются с тканей, таких как томат околоплодника модель для endoreduplication исследований8.
В картофель изучение endoreduplication в пределах клубня по-прежнему ограничивается только пару исследования, возможно, отчасти объясняется отсутствием надежного протокола как вышеупомянутые сырой препараты дают противоречивые результаты. Хотя такие подходы хорошо работать для листьев, образцы клубней опыт серьезной деградации и обилие шума в виде мусора, делая дифференциации пиков, состоящая из ядер значениями различных C-почти невозможно. Это возможно из-за различий в клеточный состав и обилием сотовой мусора внутри клетки клубня (например. хранение крахмала Амилопласты). Чтобы преодолеть это препятствие, мы недавно разработали более надежный протокол для приобретения различимых пиков в проточной цитометрии клубней картофеля. Частота ячейки в пределах каждой пик затем может использоваться для расчета точной endoreduplication уровни для разных генотипов или различных тканей, которые составляют клубней. Протокол, который использует изменение протопластов извлечения метода14,15 предшествующая описано ранее потока цитометрии11, показали значительные различия в пределах картофеля родственников, сортов и тканях16 . Здесь мы представляем протокол в деталях, оценивая EI в контекстах плоидности, ткани и Размер клубня.
Protocol
Примечание: Важно включать соответствующие элементы управления, обычно в форме листовой ткани же плоидности как экспериментальные образцы. Это потому, что пик 2C образцов клубней могут быть небольшими и трудно определить.
1. Подготовка
Примечание: Решения, перечисленные здесь может быть подготовлен заранее и хранить при 4 ° C но те, которые представлены в последующих шагах должна быть свежей в день использования.
- Сделать соответствующий объем плазмолиза инкубации решение (PIS) (15 мл/образец): 0,55 М маннитол, 2 мм CaCl2, 1 мм х2PO4, 1 мм MgCl2, 50 мм трис буфер рН 7,5 (скорректировано с HCl).
- Сделать соответствующий объем плазмолиза Вымойте решения (PWS) (15 мл/образец) который идентичен PIS добавлением 0,71 М маннитол.
- Сделать 250 мл модифицированных Гэлбрейт потока буфера Cytometry11 (FCB): 13,6 мм цитрат натрия (тринатрия), MOPS 8 мм, 18 мм MgCl2, 0,4% v/v X-100 Тритон. Движение по крайней мере 30 минут для распространения X-100 Тритон.
- Фильтр стерилизовать ПРР и PWS решения с 0,22 мкм фильтром асимметричной Полиэфирсульфон (обезьян). Использование вакуумной фильтрации управляемые единицы.
-
Подготовьте 106 мкм сетки фильтры для лизированных протопласта. Приготовьте 1,5 мл microcentrifuge трубы, которые могут быть непосредственно вложенные в коллекции трубок, однако может использоваться любой метод передачи суспензий через фильтр 106 мкм.
Примечание: Это не нужно быть стерильными.- При использовании microcentrifuge 1.5 мл пробирок, вырежьте 1 см от кончика каждого пробки microcentrifuge. С помощью плита или других тепла источника тепла 1 см2 мкм кусок 106 стальной сетки на кусок алюминиевой фольги. Нажмите Вырезать конец трубки в сетке до тех пор, пока они слиты.
- Вымойте картофель для выборки, удаление грунта и мусора.
Примечание: Размер клубня и возраста должны быть подходящими для целей эксперимента, но никак не влияют на качество результатов. Мы успешно применяется этот протокол для клубней, которые были в холодного хранения (4 ° C, 95% RH) до 8 месяцев. В то время как клубни с дефектами (например клубней конец гниль, полые сердца, коричневые омертвевшие районах) может быть гибкой, их следует избегать, если возможно.
2. день 1: Plasmolyze тканей клубня
Примечание: Управления лист образцы могут быть включены здесь производят протопласта или на шаг 5.2 Если сырой препараты являются предпочтительными. Это должна быть выполнена с стерильных инструментов в асептической среде например, Ламинарный шкаф.
- Поверхность стерилизации клубней картофеля через погружение в 75% этанола для по крайней мере 5 минут.
- Удаление клубней из этанола и высохнуть на воздухе. Это обычно занимает ~ 5 мин, больше, если больше чем 100 g клубня.
- Подготовить и лейбл стерильные 50 мл конические трубы для каждого образца и аликвота 15 мл фильтра стерилизации ПРР в каждой.
-
Образец примерно 1 см3 желаемого ткани от стерилизации клубней с помощью Стерилизованный скальпель или Корк буром.
Примечание: В зависимости от ткани производится выборка одно может использовать стерилизованные Корк буром или нож/скальпель. Например если пробковые Борер пробки могут быть использованы для взять ядро от апикального к дистальному концу клубня и Центральная часть ядра могут отведать. Однако, вследствие асимметричного внутренняя морфология клубней картофеля, это может быть более точным в паренхиме образца или коры вдвое клубня и иссечения желаемого ткани. Смотрите Рисунок 1 для изображением внутренних клубней морфологии.- Грубо нарезать ткани с помощью Стерилизованный скальпель на приблизительно 3 мм3 куски и передачи ткани в коническую пробирку, содержащую ПРР. Инкубируйте на ночь при 4 ° C.
Примечание: Это увеличить площадь поверхности так, что ПРР, и позднее решение фермента, может полностью пронизывают ткани, что приводит к более полной пищеварение.
- Грубо нарезать ткани с помощью Стерилизованный скальпель на приблизительно 3 мм3 куски и передачи ткани в коническую пробирку, содержащую ПРР. Инкубируйте на ночь при 4 ° C.
Рисунок 1: внутренняя морфология клубня картофеля. Разделение между пробковые (P) и perimedullary паренхимы (PM) иллюстрируется с черными линиями. Сосудистого кольца, который отделяет паренхимы из коры (C) обозначается с черной стрелкой. А также помечены Столон конца (S) и глаз tuber (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
3. день 2: Генерировать картофеля протопластов
Примечание: Это должны быть выполнены с стерильных инструментов в асептической среде например, Ламинарный шкаф.
- Подготовить и фильтр (фильтр обезьян 0,45 мкм) соответствующей суммы из раствора фермента (ES) (10 мл/образец): 0.71 М маннитол, 3 мм CaCl2, 1 мм х2PO4, 1 мм MgCl2, 4% Онодзука R-10 целлюлаза, 0,8% macerozyme R-10, 1% hemicululase, 10 буфер MES мм, pH 5,8. Убедитесь, что соответствующие фильтры используются в этом шаге; фильтры с поры размер меньше, чем 0,45 мкм подвержены засорению в то время как низкое содержание белка привязки мембраны, таких как обезьяны, минимизирует потери фермента при фильтрации.
- Аспирационная покинуть ПРР от сэмплов в конические трубы с использованием стерильных Серологические Пипетки.
- Добавить 10 мл ES для каждого образца и инвертировать 2 – 3 раза.
- Проинкубируйте образцы Ночевка в 29 ° C горизонтальной встряхивании 180 об/мин. Проинкубируйте образцы для по крайней мере 16 h.
4. день 3: Урожай протопласта и мыть протопластов
Примечание: Асептических условиях необходимы не долго в этот момент.
- Удаление образцов из шейкер и позволять им селиться на ~ 10 мин.
-
Аспирационная покинуть столько ES решения как можно скорее.
- Удалите столько ES решения как возможно с Серологические Пипетки, заботясь, чтобы избежать удаления переваривается ткани.
- С помощью микропипеткой удалить любой оставшийся раствор ES, снова избежать переваривается ткани. Проще всего это делается путем проведения трубки под углом, так что решение ES течет к крышке переваривается ткани остается на дне.
- Добавляют 15 мл PWS для каждой выборки и осторожно перевернуть 2 – 3 раза. Разрешить протопласта соглашаться на 10 мин.
- Удаления PWS с Серологические Пипетки. Использование микропипеткой для удаления любых оставшихся жидкости.
Примечание: Этот шаг является абсолютно решающее значение для обеспечения целостности образца ядер при проточной цитометрии. При устранении неполадок, этот шаг оказался наиболее вероятным источником сбоя в образце.
5. день 3: Подготовка образцов для проточной цитометрии
Примечание: Образцы должны храниться на льду отсюда на если не указано иное.
- Подготовить пропидий йодидом (0,4 мг пропидий йодидом/мл FCB) и решения РНКазы (0,8 мг РНКазы A / мл FCB) растворяют в FCB.
Предупреждение: Пропидий йодидом высоко токсичен. Избегайте контакта с кожей или глазами. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты. -
Добавить 1,5 мл лед холодной FCB для каждого образца. Кратко поколебать или водоворот каждого образца с распадаются агрегированы ткани. Важно, чтобы порвать пряди ткани клубней так что FCB может полностью пронизывают клетки и релиз ядра. Различные образцы может потребовать более или менее агитации в зависимости от ткани и генотип.
Примечание: FCB лизирует протопласта, выпустив ядер. Отсюда необходимость поддержания образцов на льду для предотвращения деградации.- Если образцы цитометрии потока управления не были включены в шаге поколения протопластов они могут быть включены здесь. Если элемент управления должен быть добавлен, мелко нарезать небольшой лист (2~ 3 см) в 1,5 мл лед холодной FCB, с помощью лезвия бритвы. Примеры элементов управления должно быть же плоидности как экспериментальных образцов, предпочтительно же генотипа. В vitro саженцы, как правило, дают чистых пиков чем парниковых или растений, выращенных в поле.
-
1 мл суспензии FCB/ткани проходят через сетчатый фильтр 106 мкм. Используйте пробки microcentrifuge 1,5 мл с наконечником, отрезать и металлические сетки растаял в нижней, как описано в шаге 1.5.1. Это пробки microcentrifuge могут быть вложены непосредственно в 2-мл пробирку microcentrifuge и образец передается непосредственно через. Если используется другой метод фильтрации, фильтрат может собраны в ледяной пластины Петри и затем переведен в 2-мл пробирку.
Примечание: иногда остальные агрегаты и сотовой мусора может засорить сетчатый фильтр. В этом случае, просто нажмите два вложенных microcentrifuge трубы несколько раз чтобы выбить мусора. - Добавьте 250 мкл раствора РНКазы каждого образца. Инвертировать и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре (RT).
Примечание: Этот шаг предназначен для удаления РНК из образцов, ведущих к меньше шума во время проточной цитометрии. Однако как ядра недолговечны, исследователи могут решили уменьшить время инкубации или выполнить его на льду, если они испытывают серьезной деградации их образцы. - Мкл 125 пропидий йодидом решения для каждого образца. Инвертировать и инкубировать на льду за 30 мин.
Примечание: Образцы должны использоваться для проточной цитометрии как можно скорее как деградация проявляется в течение 2 ч, даже на льду.
6. день 3: Проточной цитометрии ядер клубней картофеля
Примечание: Потока цитометр операции и программное обеспечение будут варьироваться в зависимости от инструмента и производителя. Подробные инструкции по конкретной операции проточный цитометр будет представлена в руководстве пользователя документа.
- Создайте два точка участков, с использованием логарифмической шкалы вперед разброс против стороны точечной и пропидий йодидом (PI) против стороны разброс. Также Создайте гистограмму с Пи на оси x. Логарифмическая шкала требуется убедиться, что все события в масштабе как ядра может значительно отличаться в флуоресцировании.
-
Загрузить образец трубки известный управления и отрегулировать напряжение, так что все события на шкале. Мы используем ткани в пробирке листа от генотипа образца. Если для запуска образцов различных ploidies, образец элемента управления для каждого должны быть включены.
- Запишите канала пик 2C в примере элемента управления. 2C вершины экспериментальных образцов должны падать в том же месте.
- Загрузить пример экспериментальный (клубней) и снова убедитесь, что все события, по шкале. Если изменения требуется, повторите шаг 6.2 определить канал 2C пиков.
- Вручную ворота протопластов ядер с помощью стороне точечная против PI.
- Установите PI гистограммы для отображения только условным протопластов ядер региона.
- Соберите нужное количество событий из каждого образца. Часто исследователи используют 10000 закрытом события для проточной цитометрии; Однако мы используем 2000 события для клубней протопластов образцов для размещения больше образцов и образцов с низкой концентрации.
- Рассчитайте каждый образец EI от PI гистограммы, с использованием следующей формулы:
EI =
4C, где процент ядер, которые являются 4C (представляющих один раунд endoreduplication), 8C является процент, который составляет 8C и так далее. Смотрите Рисунок 4 примеры гистограмм и C-значения вершин.
Representative Results
Производство протопластов
Поколение протопласта необходим для достижения результатов цитометрии повторяемые потока от клубней картофеля, Общая морфология которых отображается на рисунке 1. Исследователи, возможно, пожелает обеспечить высокое качество протопласта были произведены до того FCP, особенно в том случае, если устранение неисправностей не требуется. Большинство протопласта должно быть сферической с минимальными выступов (рис. 2) и могут значительно отличаться в размере, который, возможно, отражает различия в EI.
Рисунок 2: представитель листьев и клубней протопласта, приобретенных на шаг 4.4 протокола. Изолированных протопластов должно быть сферической и симметрично с плазматической мембраны неповрежденными. Обратите внимание на размер разницу между листьев (A-C) и протопласта клубней (D, E), а также различия в размерах в ткани, которая может указывать на различные уровни endoreduplication. Лист протопласта содержат хлоропластов, тогда как Амилопласты видны внутри клубней протопласта. Масштаб баров = 1000 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Оценка результатов цитометрии потока
Успех или провал эксперимента может оцениваться от ширины пиков и их разделения в гистограммах цитометрия потоков. Как измерения endoreduplication требует расчета относительное обилие ядер в каждом пик, простое присутствие или отсутствие пиков является недостаточным, если есть слишком много шума, чтобы нарисовать обоснованных границ между ними. Рисунок 3 отображает различия в результатах, исследователи могут столкнуться в поток цитометрии точечные участки и гистограммы. Возможные причины неудачного образцов представлены в рамках обсуждения.
Рисунок 3: представитель результаты полученные из проточной цитометрии протопластов ядер нетронутыми и деградированных пробковые образцы. Нетронутыми ядер (A) показывают чистое разделение между пиками для количественного определения относительного изобилия клеток в каждом с использованием соответствующего программного обеспечения, тогда как пики в деградированных образцов (B) Показать сдвигом, широкий и перекрывающихся баз. В scatterplots нетронутыми (C) и деградированных образцов (D) черные ящики указывают, что ядерных событий стробирования для гистограмм и группирование событий отражается в ширины пиков гистограммы. События за воротами указывают мусора, сильно деградированных ядер или других агрегатов. PI-H соответствует интенсивности флуоресценции, которая измеряется в произвольных единицах. Методы устранения неполадок для предотвращения деградации выборки рассматриваются в тексте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Endoreduplication различия между тканей
Ранее мы сообщали, что тканей клубня сердцевина имеет значительно более высокие уровни endoreduplication чем ткани коры16. Чтобы подтвердить и расширить это мы посмотрели на endoreduplication уровне трех различных тканей в cv. Superior: сердцевина, perimedullary паренхимы и коры, реплицируются в трех экземплярах с 2000 закрытых мероприятий на сэмпл. Наши результаты подтвердили наши ранее наблюдения, что сердцевина ткани имеет значительно большую EI чем кортикального слоя ткани с средствами 1.79 и 1.12 endocycles в клетку, соответственно (p = 0,018; T критерия Стьюдента). Немного удивительно, ткани паренхимы продемонстрировал профиль подобен коре и был также значительно отличается от истинного ткани (означает = 1,14; p = 0,013; T критерия Стьюдента). Эти результаты приводятся на рисунке 4.
Рисунок 4: Endoreduplication в трех тканях cv. Superior. Наряду с значение EI вычисляется из этих гистограмм отображаются гистограммы листьев (A), клубней коры (B), паренхимы (C) и пробковые (D) тканей. Различия в относительное обилие ядер, включая каждый пик очевидны, особенно между тканями листьев и клубней. C-значения для каждой пик также отображаются. PI-H соответствует интенсивности флуоресценции, которая измеряется в произвольных единицах. Означать сравнения EI тканей клубня отображаются в E, где звездочка указывает на существенное различие (p < 0,05) и погрешностей показать стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Влияние размера клубней и плоидности
Ранее мы сообщали, что, для данного генотипа, клубни разного размера, но аналогичные зрелости не отображается соответствующая разница в EI16. Мы стремились подтвердить этот результат, а также оценить взаимосвязь между плоидности и endoreduplication. Для этого эксперимента, мы использовали три реплицирует ткани паренхимы из трех различных генотипов: cv. Superior (4 x), VT_SUP_19 (2 x) который dihaploid извлекается из cv. Superior колючка опыление17, и VT_SUP_19 4 x, которая вдвое dihaploid 18 isogenic VT_SUP_19. Мы включили набор реплицирует для больших (90-130 g) и малых (< 35 g) клубней для cv. Superior клубней для двух других генотипов были 90-130 г. Клубни были все собрано из парниковых выращенных растений при полной зрелости, то есть верхушки растений было senesced. Наблюдается значительная разница между VT_SUP_19 и его прародителя Superior (p = 0,04); Однако, не было никакого существенного различия между VT_SUP_19 и VT_SUP_19 4 x (p = 0,69). Это означает, что пока есть вероятно генетический компонент endoreduplication, как разоблачил геномной сокращение, это не диктуется плоидности, по крайней мере на этом фоне. И наконец мы вновь наблюдали статистически значимых различий между большими и малыми cv. Улучшенный клубни как показано на рисунке 5.
Рисунок 5: Endoreduplication в двух размерах клубней cv. Superior Диплоидные (VT_Sup_19) и его тетраплоидные (VT_Sup_19 4 x) производных. Линейчатая диаграмма показывает среднее для малых (< 35 g) и большие (90-130 g) cv. Улучшенный клубней, а также большой (90-130 g) клубни dihaploid VT_SUP_19 и isogenic вдвое dihaploid VT_SUP_19 4 x. Существенные различия (p < 0,05) обозначаются соединения письмо доклада. Планки погрешностей изображают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Протокол, представленные в настоящем документе обеспечивает исследователей с средства для оценки endoreduplication в клубнях картофеля, чьи модифицированных сотовых контента и увеличение размер ячейки казалось бы исключать другие препараты цитометрии потока. Протокол опирается на протопластов поколения как средство для снижения шума и мусора при сохранении ядерного целостности. Ранее исследователи описанные аналогичные препараты для особо упорствующих потока цитометрии образцов, а также использованы клубней протопласта изучать различные темы, такие как патогенеза19,20. Однако к нашему знанию, ни объединили использование таких протопласта клубней с проточной цитометрии с целью изучения endoreduplication. Кроме того мы нашли применение протопласта более надежными, чем типичный сырой препаратов, а также техника используется в двух только другие исследования для оценки клубней endoreduplication6,7. Здесь мы обсуждаем недостатки протокола, потенциальные проблемы в ее подготовке исполнения и образца и результаты типичный эксперимента, который использует его.
Несмотря на полезность и повторяемость протоколом cytometry потока клубней он имеет несколько недостатков, которые следует обсудить. Чтобы начать, протокол является время интенсивных, требуя две ночи инкубаций. Кроме того протокол требует некоторых дорогостоящих реагентов, особенно целлюлазы и macerozyme. Кроме того ведется подготовка время высокочувствительных, унижающего достоинство в течение нескольких часов, которые могут ограничить пропускную способность в течение одного дня, особенно если много событий. И наконец протокол, в то время, как надежный, чувствителен к ошибок в пробоподготовки, все из которых, как представляется, привести к повреждению ядер и Нижняя качественных результатов. К примеру микробной контаминации может произойти во время плазмолиза и протопластов поколения шаги (1 – 3.4) из-за неправильного асептической техники. Пример загрязнения, хотя не всегда исключает успех образца, как представляется, резко снизить качество полученных гистограмм, снова скорее всего из-за повреждения ядра.
Как отмечалось ранее основных недостатков протокола являются расходы, время и чувствительность к ошибкам. Исследователи, возможно, пожелает принять меры для смягчения каждого из них. Что касается стоимости исследователи, намеревающиеся применять протокол для многих образцов может рассмотреть вопрос об изменении концентрации фермента и/или продолжительности переваривания шаг как различных тканей и генотипов могут варьироваться в реагировании. Это включает в себя возможность фильтрации и рециркуляции ES, которая ранее была продемонстрирована но не работающих здесь21. Что касается времени, в наши наблюдения можно обойтись с первой инкубации (плазмолиза шаг) и по-прежнему извлекать протопласта; Однако будут страдать их целостности и изобилия, который негативно влияет на результаты. Для уменьшения износа образцов исследователи могут считают, что некоторые потока цитометрии подходы включают использование фиксативов (например, формальдегид) для сохранения целостности образец22. Это может быть полезным средством предотвращения ухудшения и разрешить для выборки хранения, вместо того, чтобы протопластов взыскание и потока цитометрии происходящих в тот же день, как представил. Еще одним средством предотвращения истощения ядер может быть включить ингибитор нуклеиназы ES и/или СКС; в то время как 2-меркаптоэтанол осуществлено без заметных изменений в процессе разработки, другие ингибиторы не были протестированы здесь.
В нашем наблюдении единственным наиболее важным шагом является шагом 4.4, удаление всех плазмолиза промывочный раствор перед добавлением цитометрии буфера потока (FCB). Если даже небольшой объем (< 10 мкл) остается, образцы имеют гораздо больше шансов к деградации, которая может привести к бедным или даже сбой образца. Это, вероятно, из-за примесей в рамках решения фермента (например nucleases, протеаз)23,24 , которая быстро деградируют ядра во время инкубационного периода и время между запусками образца, даже при низких концентрациях. Еще одним важным фактором является продолжительность PI и РНКазы шагов инкубации. Как отмечено в протоколе, образцы не остаются стабильными более чем на несколько часов после добавления FCB исследователи могут решили сократить продолжительность эти шаги, чтобы вместить больше образцов или длительных проточной цитометрии результате низкой ядер концентрации. Это также требует исследователя рассмотреть компромисс между число событий каждого образца и общее количество выборок, запускать или рассмотреть использование фиксативов как упоминалось ранее.
Различия между тканей и генотипов
Чтобы обеспечить результаты представитель протокола мы разработали два простых экспериментов для подтверждения сообщалось ранее вариации, ткани и изучить влияние плоидности и генотип. Результаты эксперимента ткани продемонстрировать, что протокол дает воспроизводимые результаты, как сердцевина ткани было вновь установлено высоким EI. Несколько удивительно паренхимы ткани, которая ранее не была проведена, имел значение EI аналогичны кортикального слоя ткани и значительно ниже, чем сердцевина. Это был непредвиденные, как клетки паренхимы, обычно больше, чем сердцевина или корковых клеток, по крайней мере в конце срока. Одно из возможных объяснений заключается, что клубни (90-130 g) были слишком незрелыми для паренхиме клеток, которые составляют большинство объема клубней на зрелость, чтобы полностью расширились и достигло своей максимальной C-значения25. Это может также объяснить, почему dihaploid (VT_SUP_19) и два раза dihaploid (VT_SUP_19 4 x) продемонстрировала значительно более EI чем cv. Улучшенный клубней; в то время как клубни примерно одинакового размера были взяты пробы от каждого генотипа, максимальный размер клубней от VT_SUP_19 или isogenic тетраплоидный гораздо меньше, чем прародителя. Таким образом, может быть, что они отображаются более EI просто потому, что они были больше относительно их максимальный достижимый размер. Кроме того разница может быть следствием генетических комплемента, VT_SUP_19 получил от его тетраплоидные прародителя. Другая возможность заключается, что геномной сокращения, которое произошло по добыче dihaploid от тетраплоидные может разоблачили пагубные аллели привело завод-стресс, который также был показан вносить повышенных EI26. Тем не менее это демонстрирует, что тщательного изучения исследователи должны использовать при выборе клубни и тканей использоваться для сравнения значения EI, особенно между генотипов.
Будущие приложения
Протокол, описанные в этой статье обеспечивает исследователей с важным инструментом для понимания endoreduplication картофеля. Это может позволить для исследований в генетических и экологических компонентов endoreduplication, время курс развития через тканей клубня и оценки естественной изменчивости. В конечном счете endoreduplication может сделать перспективных мишенью для улучшения картофеля, обязательство, которое потребует надежным средством оценки.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось национальной науки фонд премии номер 1237969, «Распутывая гетерозиготности, аллельные состав и скопировать номер вариации картофеля» и USDA Специальный грант 2014-34141-22266 (Университет штата Мэн) для RV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
- Wilson, E. The karyoplasmic ratio. 727, 3rd edn, The Macmillan Company. (1925).
- Szymanski, D. B., Marks, M. D. GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).
- Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).
- Grafi, G., Larkins, B. A. Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases. Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).
- Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication. Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2. Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth. Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).
- Cheniclet, C., et al. Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth. Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).
- Pirrello, J., et al. How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches. Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).
- Chevalier, C., et al. Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory. J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).
- Galbraith, D. W., et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).
- Doležel, J., Greilhuber, J., Suda, J. Flow Cytometry with Plants: An Overview. Flow Cytometry with Plant Cells. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 41-65 (2007).
- Doležel, J., Bartoš, J. A. N. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).
- Doke, N., Tomiyama, K. Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues. Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).
- Davis, D. A., Currier, W. W. The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts. Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).
- Laimbeer, F. P. E., et al. Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops. Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).
- Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination. Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).
- Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants. Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).
- Doke, N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity. Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).
- Doke, N., Tomiyama, K. Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans. Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).
- Saxena, P. K., King, J. Reuse of enzymes for isolation of protoplasts. Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).
- Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. Cytometry and flow cytometry of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants. Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).
- Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. Tissue and cell culture. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , Springer. 39-50 (2013).
- Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement. Advances in Cell Culture. Maramorosch, K. 1, Elsevier. 241-279 (1981).
- Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions. Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).
- Scholes, D. R., Paige, K. N. Plasticity in ploidy: a generalized response to stress. Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).
