Summary
Il protocollo descritto nel presente documento è un metodo per la misurazione endoreduplicazione all'interno di tuberi di patata (Solanum tuberosum). Include passaggi di estrazione Plasmolisi e protoplasti per diminuire il rumore e detriti in analisi cytometric di flusso a valle.
Abstract
Endoreduplicazione, la replicazione del genoma nucleare di una cellula senza citochinesi successiva, produce cellule con maggiore contenuto di DNA ed è associato con specializzazione, lo sviluppo e l'aumento nella dimensione del cellulare. Nelle piante, endoreduplicazione sembra facilitare la crescita e l'espansione di determinati tessuti e organi. Fra loro è il tubero di patata (Solanum tuberosum), che subisce una notevole espansione cellulare nell'adempiere la sua funzione di deposito di carboidrati. Così, endoreduplicazione può svolgere un ruolo importante in quanto sono in grado di ospitare questa abbondanza di carbonio tuberi. Tuttavia, i detriti cellulari derivanti da metodi di isolamento nucleare grezza di tuberi, metodi che possono essere utilizzati efficacemente con foglie, preclude la stima dell'indice endoreduplicazione tubero (EI). Questo articolo presenta una tecnica per la valutazione endoreduplicazione tubero attraverso l'isolamento di protoplasti mentre dimostrando risultati rappresentativi ottenuti da diversi genotipi e compartimenti stagni tessuti tubero. Le principali limitazioni del protocollo sono i costi di tempo e reagenti necessari per la preparazione del campione, come pure la durata relativamente breve dei campioni dopo la lisi dei protoplasti. Mentre il protocollo è sensibile alla variazione di tecnica, rappresenta un miglioramento rispetto ai tradizionali metodi di isolamento nucleare da queste grandi cellule specializzate. Possibilità di miglioramenti al protocollo come riciclaggio degli enzimi, l'uso di fissativi e altre alterazioni sono proposti.
Introduction
Endoreduplicazione è il processo mediante il quale una cella rinuncia il tipico ciclo cellulare e subisce invece un corso alternativo di sviluppo costituito da ripetuti cicli di replicazione del DNA senza divisione cellulare. La cella risultante avrà un aumento del DNA dimensione contenuto e nucleare, che è pensato per svolgere un ruolo nella regolazione cellulare, espansione e specializzazione. Generalmente, un giro di endoreduplicazione (chiamato un endocycle) e il corrispondente aumento nel contenuto di DNA sono associati con più grande volume di cella, un'osservazione che ha precipitato la "teoria karyoplasmic" che ha aumentato il contenuto di DNA è necessario correttamente regolano una più grande, forse più complesso, cella1. Questo fenomeno è comune nelle piante superiori, avendo osservati in una gamma di tessuti, compresi quelli con strutturale/difensivo (tricomi)2,3, nutritiva (mais endosperma)4,5e lavandino/memorizzazione ( pericarpo di pomodoro; funzioni di tubero di patata)6,7,8 . Nel frutto, è stato suggerito che endoreduplicazione svolge un ruolo nel facilitare la rapida espansione del pericarpo, come dimostra la relazione negativa tra periodo inerente allo sviluppo endoreduplicazione e frutta per9. Per esempio le cellule con DNA contenuto fino a 512C (512 volte il genoma aploide) sono stati osservati nel pericarpo pomodoro8. Inoltre Chevalier et al (2014) hanno dimostrato che le alterazioni nell'espressione dei geni del ciclo cellulare possono condurre agli aumenti nei livelli endoreduplicazione entro il pericarpo che poi si traduce in più grande frutta10. Alterazione di geni promuovendo endoreduplicazione fornisce quindi un potenziale bersaglio per miglioramento della biomassa o resa attraverso allevamento vegetale o la manipolazione genetica. Tuttavia, tale miglioramento è subordinato a una maggiore comprensione delle cause e conseguenze della endoreduplicazione.
Endoreduplicazione è più spesso misurati tramite flusso cytometry per cui nuclei, rilasciati in tessuto greggio preparazioni11, sono incubati con un fluoroforo legante il DNA, come ad esempio propidio ioduro12 (PI). I campioni filtrati vengono quindi passati dal laser di un citometro a flusso, dove possa essere osservati lunghezze d'onda di emissione specifici per il fluoroforo. L'intensità di fluorescenza in ogni evento (cioè, nucleo) è direttamente correlata con il contenuto di DNA della particella. Pertanto, confrontando a uno standard conosciuto, può essere calcolato il contenuto di DNA relativo e assoluto delle celle in un dato campione. Endoreduplicazione indici (EI) sono determinati stabilendo il numero medio di endocycles per cella all'interno di un campione osservando il contenuto di DNA cellulare (C-valore) dove 1C è il contenuto di DNA di una cellula aploide (formula presentata nel passaggio 6.7 del protocollo). Per esempio, in un organismo diploide, contenuto di base del DNA delle cellule somatiche è 2 C. Se un campione ha poche cellule con 4C, corrispondente a un singolo round di endoreduplicazione o maggiore avrebbe un EI vicino a 0; Tuttavia se quasi tutte le cellule sono 4C EI sarebbe circa 1. Tuttavia, come più Arrotonda di endoreduplicazione è comuni a più alti valori osservati di EI piante può essere molto maggiore. Durante il calcolo di indici endoreduplicazione può essere relativamente semplice, che richiede che le abbondanze relative dei nuclei C-valori essere attendibilmente accertato, che è precluso in determinate specie e tessuti (tra cui tuberi di patata). È probabile che le differenze nella composizione di anatomia, chimica o parete cellulare cellulare13 causano questi campioni ad essere recalcitrante ai tipici preparati utilizzando una lama di rasoio per rilasciare i nuclei direttamente nel buffer appropriato che sono comunemente usati con tessuti come pericarpo di pomodoro, un modello per endoreduplicazione studi8.
Patata, l'esame della endoreduplicazione entro il tubero rimane limitata agli studi solo un paio, forse dovuti in parte alla mancanza di un protocollo affidabile come il sopraccennato preparazioni grezze producono risultati incoerenti. Mentre tali approcci funzionano bene per foglie i campioni di tubero esperienza grave degrado e un'abbondanza di rumore sotto forma di detriti, rendendo la differenziazione delle cime composto da nuclei con differenti valori di C quasi impossibili. Questo è forse dovuto le differenze nella composizione cellulare e una profusione di detriti cellulari all'interno delle cellule di tubero (ad es. amido-immagazzinare amiloplasti). Per superare questo ostacolo, recentemente abbiamo sviluppato un protocollo più affidabile per l'acquisizione di picchi distinguibili in citometria a flusso di tuberi di patata. La frequenza delle cellule all'interno di ogni picco quindi può essere utilizzata per il calcolo accurato endoreduplicazione livelli per genotipi diversi o diversi tessuti che compongono un tubero. Il protocollo, che impiega un antecedente di15 14,di protoplasti modificate estrazione metodo descritto in precedenza flusso cytometry11, ha mostrato una notevole variazione all'interno di parenti di patata, cultivar e tessuti16 . Qui vi presentiamo il protocollo nel dettaglio valutando EI in contesti di ploidia, tessuto e dimensione del tubero.
Protocol
Nota: È importante includere i controlli appropriati, solitamente sotto forma di tessuto fogliare della ploidia stesso come campioni sperimentali. Questo è perché il picco di 2C di campioni di tuberi può essere piccoli e difficili da identificare.
1. preparati
Nota: Le soluzioni elencate qui possono essere preparate prima del tempo e conservate a 4 ° C, ma quelli presentati nei passaggi successivi deve essere fatta fresche il giorno di utilizzo.
- Rendere un appropriato volume della soluzione di incubazione Plasmolisi (PIS) (15 mL/campione): 0,55 M mannitolo, 2mm CaCl2, 1mm KH2PO4, 1mm MgCl2, 50 mM Tris tampone a pH 7,5 (regolato con HCl).
- Rendere un appropriato volume della soluzione di lavaggio Plasmolisi (PWS) (15 mL/campione) che è identico al PIS tranne aggiunta di 0,71 M mannitolo.
- Fare 250 mL di flusso Cytometry Buffer11 (FCB di Galbraith modificate): 13,6 mM sodio citrato (trisodico), MOPS di 8 mM, 18 mM MgCl2, 0,4% v/v Triton X-100. Agitare per almeno 30 min distribuire il X-100 Triton.
- Filtro sterilizzare PIS e PWS soluzioni con un filtro di 0,22 µm asimmetrica in polietersulfone (aPES). Utilizzare unità di filtrazione sotto vuoto guidato.
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Preparare 106 µm filtri a rete per lisato protoplasti. Preparare 1,5 mL microcentrifuga che può direttamente essere annidate in tubi di raccolta, tuttavia può essere utilizzato qualsiasi metodo di sospensioni di passaggio attraverso un filtro di 106 µm.
Nota: Questi non devono essere sterili.- Se utilizzando provette per microcentrifuga da 1,5 mL, tagliare 1 cm la punta ogni tubo del microcentrifuge. Utilizzando una piastra calda o altri calore di fonte di calore un 1 cm2 pezzo 106 µm in acciaio maglia su un pezzo di carta stagnola. Premere l'estremità tagliata del tubo nella maglia fino a quando essi si sono fusi.
- Lavare le patate da campionare, rimuovendo tutto il suolo e detriti.
Nota: Età e dimensione del tubero deve essere appropriate per gli obiettivi dell'esperimento, ma non sembrano influenzare la qualità dei risultati. Abbiamo applicato con successo questo protocollo ai tuberi che sono stati in celle frigorifere (4 ° C, 95% RH) fino a 8 mesi. Mentre tuberi con difetti (ad es. tubero marciume, cava di cuore, zone necrotiche marroni) possono essere reattivi, essi dovrebbero essere evitati, se possibile.
2. giorno 1: Plasmolyze tessuto di tuberi
Nota: I campioni di foglia di controllo possono essere inclusi qui per produrre i protoplasti o al punto 5.2 se preparazioni grezze sono preferiti. Questa deve essere eseguita con strumenti sterili, in un ambiente asettico come una cappa a flusso laminare.
- Superficie sterilizzare tuberi di patata tramite immersione in etanolo di 75% per almeno 5 min.
- Rimuovere i tuberi da etanolo e lasciare asciugare all'aria. Questo di solito prende ~ 5 min, più a lungo se il tubero è maggiore di 100 g.
- Preparare e provette coniche da etichetta sterile 50 mL per ogni campione e aliquota 15 mL di filtro sterilizzato PIS in ciascuno.
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Campione di circa 1 cm3 del tessuto desiderato da tuberi sterilizzati mediante bisturi sterilizzato o trivellatore di sughero.
Nota: A seconda del tessuto campionato si può usare un trivellatore di sughero sterilizzato o un coltello/bisturi. Per esempio, se il midollo è desiderato il trivellatore di sughero può essere utilizzati per prendere un nucleo da apicale all'estremità distale del tubero e la frazione centrale del nucleo si può campionare. Tuttavia, a causa della morfologia interna asimmetrica di tuberi di patata, può essere più preciso di parenchima campione o corteccia di dimezzare il tubero e asportando il tessuto desiderato. Vedere la Figura 1 per una rappresentazione della morfologia interna tubero.- Tritare grossolanamente tessuto usando un bisturi sterilizzato in circa 3 mm3 pezzi e trasferimento del tessuto a tubo conico contenente PIS. Incubare per una notte a 4 ° C.
Nota: Si tratta di massimizzare la superficie affinché il PIS, e più tardi la soluzione di enzima, completamente può permeare il tessuto con conseguente digestione più completa.
- Tritare grossolanamente tessuto usando un bisturi sterilizzato in circa 3 mm3 pezzi e trasferimento del tessuto a tubo conico contenente PIS. Incubare per una notte a 4 ° C.
Figura 1: morfologia interna di un tubero di patata. La separazione tra midollo (P) e perimidollari parenchima (PM) è illustrata con linee nere. Anello vascolare, che separa il parenchima dalla corteccia (C) viene indicata con una freccia nera. La fine stolone (S) e il tubero gli occhi (E) sono etichettati come bene. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. giorno 2: Generare protoplasti di patate
Nota: Questo deve essere eseguito con strumenti sterili, in un ambiente asettico come una cappa a flusso laminare.
- Preparare e filtro (filtro di scimmie 0,45 µm) un quantitativo adeguato della soluzione di enzima (ES) (10 mL/campione): 0,71 M mannitolo, 3 mM CaCl2, 1mm KH2PO4, 1mm MgCl2, cellulasi Onozuka R-10 4%, 0.8% macerozyme R-10, hemicululase 1%, 10 tampone MES mM, pH 5,8. Garantire che filtri appropriati vengono utilizzati in questo passaggio; filtri con pori di dimensione inferiore a 0,45 µm sono inclini a intasamento mentre una membrana di associazione povera in proteine, come scimmie, minimizza la perdita dell'enzima durante la filtrazione.
- Aspirate fuori PIS da campioni in provette coniche utilizzando una pipetta sterile e sierologica.
- Aggiungere 10 mL di ES a ciascun campione e invertire 2 – 3 volte.
- Incubare i campioni durante la notte a 29 ° C con agitazione orizzontale 180 giri/min. Incubare i campioni per almeno 16 h.
4. giorno 3: Harvest protoplasti e lavaggio protoplasti
Nota: In condizioni asettiche sono no lunghi necessari a questo punto.
- Rimuovere i campioni da shaker e permettere loro di stabilirsi per ~ 10 min.
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Aspirate fuori tanto della soluzione ES come possibile.
- Rimuovere la maggior quantità di soluzione ES come fattibile con una pipetta sierologica, avendo cura di evitare di rimuovere il tessuto digerito.
- Utilizzando una micropipetta, rimuovere eventuali residui di soluzione ES, evitando nuovamente il tessuto digerito. Ciò avviene più facilmente da tenendo il tubo ad angolo in modo che la soluzione ES fluisce verso il coperchio mentre il tessuto digerito rimane nella parte inferiore.
- Aggiungere 15 mL di PWS per ogni campione e invertire delicatamente 2 – 3 volte. Permettono di protoplasti di stabilirsi per 10 min.
- Rimuovere PWS con una pipetta sierologica. Utilizzare una micropipetta per rimuovere il liquido rimanente.
Nota: Questo passaggio è assolutamente fondamentale per garantire l'integrità dei nuclei del campione durante la citometria a flusso. Risoluzione dei problemi, questo passaggio è stato trovato per essere la fonte più probabile di guasto in un campione.
5. giorno 3: Preparare i campioni per citometria a flusso
Nota: I campioni devono essere tenuti sul ghiaccio da qui se non specificato diversamente.
- Preparare soluzioni RNasi e ioduro di propidio (0,4 mg propidio ioduro/mL FCB) (0,8 mg RNasi A / mL FCB) sciogliendo ciascuno in FCB.
Attenzione: Ioduro di propidio è altamente tossico. Evitare il contatto con la pelle o gli occhi. Indossare appropriati PPE. -
Aggiungere 1,5 mL di ghiaccio freddo FCB per ogni campione. Brevemente agitare o vortex ciascun campione per spezzare aggregati dei tessuti. È importante rompere i grumi di tessuto di tubero affinché il FCB completamente può permeare le cellule e i nuclei di rilascio. Diversi campioni possono richiedere più o meno agitazione a seconda del tessuto e del genotipo.
Nota: Il FCB Lisi i protoplasti, rilasciando i nuclei. Da qui la necessità di mantenere i campioni sul ghiaccio per prevenire il degrado.- Se esempi di citometria a flusso di controllo non sono stati inclusi nel passaggio di generazione di protoplasti possono essere inclusi qui. Se un controllo deve essere aggiunto, tritare finemente una piccola foglia (~ 3 cm2) in 1,5 mL di ghiaccio freddo FCB utilizzando una lama di rasoio. Campioni di controllo dovrebbero essere la stessa ploidia dei campioni sperimentali, preferibilmente lo stesso genotipo. In vitro piantine tendono a dare picchi di pulitore di serra o piante coltivate in campo.
-
Passare 1 mL della sospensione FCB/tessuto attraverso un filtro a maglia 106 µm. Utilizzare un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL con la punta tagliata e maglia metallica fusa a fondo come descritto al punto 1.5.1. Questo tubo del microcentrifuge può essere nidificato direttamente in una provetta da microcentrifuga da 2 mL e il campione passare direttamente attraverso. Se si utilizza un altro metodo di filtrazione, il filtrato può essere raccolto in una piastra di Petri ghiacciata e poi trasferito in una provetta da 2 mL.
Nota: a volte i restanti aggregati e detriti cellulari possono intasare il filtro a rete. In questo caso, è sufficiente toccare la microcentrifuga nidificato due un paio di volte per rimuovere i detriti. - Aggiungere 250 µ l della soluzione RNasi a ciascun campione. Capovolgere e incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA).
Nota: Questo passaggio è destinato a rimuovere il RNA dai campioni, che conduce a meno rumore durante la citometria a flusso. Tuttavia, come i nuclei sono di breve durati, i ricercatori possono decidere di ridurre il tempo di incubazione o eseguirla sul ghiaccio se si verificano gravi riduzione dei loro campioni. - Aggiungere 125 µ l di soluzione di ioduro di propidio per ogni campione. Capovolgere e incubare in ghiaccio per 30 min.
Nota: I campioni devono essere utilizzati per citometria a flusso più presto possibile, come il degrado è evidente entro 2 h, anche su ghiaccio.
6. giorno 3: Flusso Cytometry di Nuclei di tubero di patata
Nota: Software e funzionamento citometro a flusso variano a seconda dello strumento e del produttore. Istruzioni dettagliate per il funzionamento specifico del citofluorimetro è prevista nel manuale utente dello strumento.
- Creare due appezzamenti di dot utilizzando la scala logaritmica di forward scatter vs side scatter e dispersione laterale di propidio ioduro (PI) vs. Anche creare un istogramma con PI sull'asse x. Scala logaritmica è necessaria per garantire a che tutti gli eventi sono all'interno di scala come i nuclei possono differire notevolmente in fluorescenza.
-
Caricare una provetta del campione di controllo conosciuto e regolare la tensione in modo che tutti gli eventi sono su scala. Usiamo il tessuto fogliare in vitro da un genotipo di campione. Se i campioni di diversi Ploidie devono essere eseguiti, un campione di controllo per ciascuna deve essere incluso.
- Prendere nota del canale del picco 2C del campione di controllo. I picchi di 2C dei campioni sperimentali dovrebbero cadere nella stessa posizione.
- Caricare un campione sperimentale (tubero) e ancora assicurarsi che tutti gli eventi sono su scala. Se le regolazioni sono necessarie, ripetere passo 6.2 per identificare il canale 2 c picchi.
- Manualmente i nuclei di protoplasti utilizzando la dispersione del vs PI lato del cancello.
- Impostare l'istogramma di PI per mostrare solo la regione di nuclei di protoplasti gated.
- Raccogliere il numero desiderato di eventi di ogni campione. I ricercatori utilizzano frequentemente 10.000 eventi gated per citometria a flusso; Tuttavia utilizziamo 2.000 eventi per i campioni di protoplasti di tubero per ospitare più campioni e campioni con concentrazioni basse.
- Calcolare EI di ogni campione dagli istogrammi di PI utilizzando la seguente formula:
EI =
dove 4C è la percentuale di nuclei che sono 4C (che rappresenta un singolo round di endoreduplicazione), 8C è la percentuale che sono 8C e così via. Vedere Figura 4 per esempi di istogrammi e C-valori delle cime.
Representative Results
Produzione dei protoplasti
La generazione dei protoplasti è necessaria per conseguire risultati di citometria a flusso ripetibile da tuberi di patata, la morfologia generale dei quali viene visualizzata in Figura 1. I ricercatori potrebbero voler garantire protoplasti di alta qualità sono state prodotte prima dell'aggiunta di FCP, soprattutto nel caso in cui è necessaria la risoluzione dei problemi. La maggior parte dei protoplasti dovrebbe essere sferica con minime sporgenze (Figura 2) e può differire notevolmente in dimensioni, che forse sono riflettente delle differenze in EI.
Figura 2: rappresentante protoplasti del tubero e della foglia, acquistati presso passo 4.4 del protocollo. Protoplasti isolati dovrebbero essere sferica e simmetrica con membrana plasmatica intatta. Si noti la differenza di dimensioni tra foglia (A-C) e protoplasti di tubero (D, E), nonché le differenze nella dimensione all'interno di un tessuto che può indicare diversi livelli di endoreduplicazione. Protoplasti foglia contengono cloroplasti mentre amiloplasti sono visibili all'interno i protoplasti di tubero. Scala bar = 1.000 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Valutazione dei risultati di citometria a flusso
Il successo o il fallimento di un esperimento può essere desunta dalla larghezza dei picchi e la loro separazione negli istogrammi di citometria a flusso. Come misura endoreduplicazione richiede un calcolo relativa abbondanza dei nuclei in ogni picco, mera presenza o assenza di picchi è insufficiente se c'è troppo rumore per disegnare i confini significativi tra di loro. Figura 3 Visualizza la variazione nei risultati i ricercatori possono verificarsi sia nel flusso cytometry grafici a dispersione e istogrammi. Possibili cause per campioni non riusciti sono presentate nella discussione.
Figura 3: risultati rappresentativi ottenuti da citometria a flusso dei nuclei di protoplasti di intatto e degradato campioni di midollo. Nuclei intatti (A) mostrano la netta separazione tra i picchi di quantificare l'abbondanza relativa delle cellule in ogni utilizzando il software appropriato, mentre picchi nei campioni degradati (B) Visualizza basi spostate, vasta e sovrapposte. In scatterplot intatto (C) e degradate (D) campioni, scatole nere indicano evento nucleare gating per istogrammi e il raggruppamento degli eventi si riflette nella larghezza dei picchi istogramma. Eventi fuori dai cancelli indicano detriti, i nuclei gravemente degradati o altri aggregati. PI-H corrisponde all'intensità della fluorescenza che viene misurata in unità arbitrarie. Metodi di risoluzione dei problemi per prevenire il degrado del campione sono discussi all'interno del testo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Endoreduplicazione differenze tra tessuti
Precedentemente abbiamo segnalato che tessuto di midollo di tuberi ha livelli significativamente maggiori di endoreduplicazione di corteccia tessuto16. Per confermare ed espandere su questo abbiamo guardato endoreduplicazione livelli di tre diversi tessuti in CV. Superior: midollo, parenchima perimidollari e corteccia, replicato in triplice copia con 2.000 eventi gated per campione. I nostri risultati hanno confermato la nostra osservazione precedente che tessuto di midollo ha EI significativamente maggiore di tessuto corticale con mezzi di endocycles 1.79 e 1,12 per cella, rispettivamente (p = 0,018; Test t di Student-). Abbastanza sorprendentemente, il tessuto di parenchima ha dimostrato un profilo simile alla corteccia e inoltre era significativamente differente dal tessuto di midollo (dire = 1,14; p = 0,013; Test t di Student-). Questi risultati sono riassunti nella Figura 4.
Figura 4: endoreduplicazione in tre tessuti di CV Superior. Gli istogrammi di foglia (A), corteccia di tubero (B), parenchima (C) ed in tessuti di midollo (D) sono mostrati insieme al valore EI calcolato da quelli istogrammi. Differenze in abbondanza relativa dei nuclei che comprende ogni picco sono immediatamente evidenti, soprattutto tra i tessuti del tubero e della foglia. C-valori per ogni picco vengono anche visualizzati. PI-H corrisponde all'intensità della fluorescenza che viene misurata in unità arbitrarie. Dire i confronti di EI tessuti tubero vengono visualizzati in E dove l'asterisco indica differenza significativa (p < 0,05) e barre di errore indicano deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Influenza della dimensione del tubero e della ploidia
Precedentemente abbiamo segnalato che, per un dato genotipo, tuberi di dimensioni diverse ma simili maturità non hanno visualizzato una differenza corrispondente all'EI16. Abbiamo mirato a confermare questo risultato, nonché di valutare la relazione tra ploidia ed endoreduplicazione. Per questo esperimento, abbiamo utilizzato tre replicati del tessuto parenchima da tre diversi genotipi: CV. Superior (4x), VT_SUP_19 (2x) che è un dihaploid estratte da CV. Superior di pungiglione impollinazione17e VT_SUP_19 x 4 che è un dihaploid raddoppiato 18 isogeniche per VT_SUP_19. Abbiamo incluso un set di repliche per grandi (90 – 130 g) e piccole (< 35 g) tuberi per CV Superior mentre tuberi per gli altri due genotipi erano 90 – 130 g. I tuberi sono stati tutti raccolti dalla serra piante coltivate a piena maturità, cioè le cime delle piante avevano senesced. Abbiamo osservato una differenza significativa tra il VT_SUP_19 e il suo progenitore Superior (p = 0,04); Tuttavia, non c'era differenza significativa tra VT_SUP_19 e VT_SUP_19 x 4 (p = 0,69). Questo indica che mentre c'è una componente genetica probabile a endoreduplicazione, come smascherato dalla riduzione genomica, esso non è dettato dalla ploidia, almeno in questo sfondo. Infine, abbiamo ancora una volta non osservato nessuna differenza significativa tra grandi e piccoli CV. Superior tuberi come dimostrato nella Figura 5.
Figura 5: endoreduplicazione in due dimensioni di tuberi CV. Superior diploide (VT_Sup_19) e tetraploide (VT_Sup_19 x 4) derivati. Il grafico a barre Mostra la media per le piccole (< 35g) e tuberi superiore di grandi dimensioni (90 – 130 g) CV, nonché tuberi di grandi dimensioni (90 – 130 g) di dihaploid VT_SUP_19 e il dihaploid raddoppiato isogeniche VT_SUP_19 4x. Differenze significative (p < 0,05) sono indicati nella relazione di lettera comunicanti. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo presentato qui fornisce i ricercatori con un mezzo per valutare endoreduplicazione all'interno di tuberi di patata, cui cellulare modificate contenuti e una maggiore dimensione della cellula apparentemente precludono altre preparazioni di citometria a flusso. Il protocollo si basa sulla generazione di protoplasti come mezzo per ridurre il rumore e detriti mantenendo integrità nucleare. In precedenza, i ricercatori hanno descritto preparazioni simili per campioni di cytometry di flusso particolarmente recalcitranti come pure utilizzato protoplasti di tubero per studiare una varietà di argomenti quali la patogenesi19,20. Tuttavia, a nostra conoscenza, nessuno hanno combinato l'uso di tali protoplasti di tubero con citometria a flusso per lo studio endoreduplicazione. Inoltre, abbiamo trovato l'uso dei protoplasti di essere più affidabile di tipiche preparazioni grezze come pure la tecnica utilizzata in due solo altri studi per valutare il tubero endoreduplicazione6,7. Qui discutiamo le carenze del protocollo, trabocchetti potenziali nella sua esecuzione e preparazione di campioni e risultati di un esperimento tipico che si impiega.
Nonostante l'utilità e la ripetibilità del protocollo tubero flusso cytometry, ha alcuni punti deboli che devono essere discussi. Per cominciare, il protocollo è tempo intensivo, che richiede due incubazioni overnight. Il protocollo prevede inoltre che alcuni reagenti costosi, in particolare la cellulasi e macerozyme. Inoltre, i preparativi sono altamente sensibili al fattore tempo, degradante entro poche ore, che possono limitare la velocità effettiva in un solo giorno, soprattutto se molti eventi sono desiderati. Infine, il protocollo, mentre affidabile, è sensibile a errori all'interno di preparazione del campione che sembrano causare danni ai nuclei e risultati di qualità inferiore. Ad esempio, la contaminazione microbica può verificarsi durante le fasi di generazione Plasmolisi e protoplasti (1 – 3.4) a causa di impropria tecnica asettica. Contaminazione del campione, mentre non sempre che preclude il successo di un campione, sembra diminuire drasticamente la qualità di istogrammi ottenuti, ancora una volta probabilmente dovuto ai danni dei nuclei.
Come affermato in precedenza, gli svantaggi principali del protocollo sono costi, tempo e sensibilità agli errori. I ricercatori potrebbero desiderare di prendere provvedimenti per attenuare ciascuno di questi. Per quanto riguarda il costo, i ricercatori intendono applicare il protocollo di molti campioni possono considerare modificando le concentrazioni negli enzimi e/o la durata della fase di digestione come tessuti differenti e genotipi possono variare nella capacità di risposta. Questo include la possibilità di filtraggio e riciclo l'ES che precedentemente è stata dimostrata ma non impiegato qui21. Per quanto riguarda il tempo, nella nostra osservazione, è possibile erogare con la prima incubazione (il passo di Plasmolisi) e ancora estrarre protoplasti; Tuttavia, l'integrità e la abbondanza soffrirà, che impatti negativamente i risultati. Per ridurre il deterioramento dei campioni i ricercatori possono considerare che alcuni approcci di citometria a flusso implicano l'uso di fissativi (ad es. formaldeide) per preservare l'integrità di esempio22. Questo può essere un mezzo utile per impedire il deterioramento sia consentire per esempio deposito piuttosto che del protoplasto concussione e flusso cytometry che accade lo stesso giorno come presentato. Un altro mezzo per prevenire il logorio dei nuclei potrebbe essere di includere un inibitore di nucleasi dell'ES e/o FBC; mentre 2-mercaptoetanolo non effettuato nessun cambiamenti notevoli durante lo sviluppo, altri inibitori non sono stati testati nel presente documento.
Nella nostra osservazione, la singola fase più critica è passo 4.4, la rimozione di tutte le soluzione di lavaggio Plasmolisi prima dell'aggiunta del buffer di citometria a flusso (FCB). Se anche un piccolo volume (< 10 µ l) resti, i campioni sono molto più propensi a essere degradato che può condurre ad un campione di povero o addirittura non riuscito. Ciò è probabilmente dovuto le impurità all'interno della soluzione di enzima (ad es. nucleasi, proteasi)23,24 che degradano rapidamente i nuclei durante i periodi di incubazione e il tempo tra le esecuzioni di campione, anche a basse concentrazioni. Un'altra considerazione importante è la durata delle fasi di incubazione PI e RNasi. Come indicato nel protocollo, i campioni non rimangono stabili per più di un paio d'ore dopo aggiunta del FCB così i ricercatori possono decidere di ridurre la durata di questi passi per ospitare ulteriori campioni o citometria a flusso lunga esecuzione derivanti dai nuclei Bassi concentrazioni. Questo richiede anche il ricercatore a considerare il compromesso tra il numero di eventi al campione e il numero totale di campioni da essere eseguito o considerare l'uso di fissativi come accennato in precedenza.
Differenze tra genotipi e tessuti
Per fornire rappresentante risultati del protocollo abbiamo progettato due semplici esperimenti per confermare la variazione precedentemente segnalati dal tessuto ed esaminare l'influenza della ploidia e genotipo. I risultati dell'esperimento tessuto dimostrano che il protocollo produce risultati riproducibili, come tessuto di midollo ancora una volta è stato trovato per avere il più alto EI. Abbastanza sorprendentemente tessuto di parenchima, che non era stata precedentemente valutato, ha avuto un valore EI simile a tessuto corticale e significativamente più basso di midollo. Questo è stato imprevisto come le cellule parenchima sono in genere più grande o di midollo o di cellule corticali, almeno a maturità. Una possibile spiegazione è che i tuberi (90 – 130 g) erano troppo immaturi per le cellule del parenchima, che costituiscono la maggior parte del volume di tubero a maturità, per completamente ampliato e ha raggiunto il loro massimo C-valori25. Questo potrebbe anche spiegare perché il dihaploid (VT_SUP_19) e il dihaploid raddoppiato (VT_SUP_19 x 4) dimostrato significativamente maggiore EI di tuberi Superior CV; mentre tuberi di approssimativamente uguali dimensioni sono state campionate da ciascun genotipo, la dimensione massima dei tuberi da VT_SUP_19 o il tetraploide isogeniche è molto più piccola di quella del progenitore. Pertanto, potrebbe essere che essi visualizzati maggiore EI semplicemente perché erano più grandi rispetto alla loro dimensione massima raggiungibile. In alternativa, la differenza può essere una conseguenza del complemento genetico che vt_sup_19 ricevuto dal suo progenitore tetraploide. Un'altra possibilità è che la riduzione di genomica che si sono verificati sull'estrazione della dihaploid dalla tetraploide può hanno smascherato alleli deleteri conseguente sforzo di tutto l'impianto, che ha anche dimostrato di contribuire a elevata EI26. Tuttavia, ciò dimostra che i ricercatori di attenta considerazione devono impiegare quando si seleziona tuberi e tessuti da utilizzare per il confronto dei valori EI, soprattutto fra i genotipi.
Applicazioni future
Il protocollo descritto in questo articolo fornisce ai ricercatori uno strumento importante per comprensione endoreduplicazione nella patata. Può consentire per studi nei componenti genetiche ed ambientali di endoreduplicazione, il corso di tempo di sviluppo attraverso tessuti tubero e valutazione della variazione naturale. In definitiva, endoreduplicazione può rendere un bersaglio promettente per miglioramento di patate, un'impresa che richiederà un mezzo affidabile di valutazione.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal National Science Foundation Award numero 1237969, "Dipanare l'eterozigosi, composizione allelica e variazione numero di copia della patata" e USDA speciale Grant 2014-34141-22266 (University of Maine) a RV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
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