Summary
El protocolo descrito aquí es un método para medir la endorreduplicación en tubérculos de papa (Solanum tuberosum). Incluye plasmólisis y protoplasto pasos de extracción para disminuir el ruido y la suciedad en análisis cytometric del flujo aguas abajo.
Abstract
Endorreduplicación, la replicación del genoma nuclear de la célula sin citocinesis posterior, produce células con mayor contenido de ADN y se asocia con la especialización, desarrollo y aumento de tamaño celular. En las plantas, endoreduplication parece facilitar el crecimiento y expansión de ciertos tejidos y órganos. Entre ellos se encuentra el tubérculo de papa (Solanum tuberosum), que se somete a expansión celular considerable en el cumplimiento de su función de almacenamiento de hidratos de carbono. Por lo tanto, endorreduplicación puede jugar un papel importante en cómo los tubérculos son capaces de dar cabida a esta abundancia de carbono. Sin embargo, los desechos celulares resultantes de los métodos de aislamiento nuclear crudo de tubérculos, métodos que pueden utilizarse eficazmente con las hojas, impide la estimación del índice de endorreduplicación de tubérculo (IE). Este artículo presenta una técnica para evaluar la endorreduplicación del tubérculo por el aislamiento de protoplastos y demostrando resultados representativos obtenidos de diferentes genotipos compartimentados los tejidos del tubérculo. Las limitaciones principales del protocolo son los costos de tiempo y reactivos necesarios para la preparación de la muestra así como la relativamente corta vida útil de las muestras después de lisis de los protoplastos. Mientras que el protocolo es sensible a la variación técnica, representa una mejora sobre los métodos tradicionales de aislamiento nuclear de estas grandes células especializadas. Se proponen posibilidades de mejoras en el protocolo como reciclaje de enzima, el uso de fijadores y otras alteraciones.
Introduction
Endorreduplicación es el proceso por el cual una célula renuncia a ciclo celular típico y en cambio somete a un curso alternativo de desarrollo que consiste en reiteradas rondas de replicación de ADN sin división celular. La célula resultante habrá aumentado DNA tamaño contenido y nuclear que se cree que desempeñan un papel en la regulación celular, la expansión y especialización. Generalmente, una ronda de endorreduplicación (llamado un endocycle) y el correspondiente aumento en contenido de ADN se asocian con mayor volumen de la célula, una observación que precipitó la "teoría karyoplasmic" que incrementó el contenido de ADN es necesaria para bien regular un más grande, tal vez más complejo, celda1. Este fenómeno es común en las plantas superiores, que se ha observado en una amplia gama de tejidos, incluyendo los estructurales/defensivo (tricomas)2,3, nutritivo (endospermo de maíz)4,5y (fregadero/almacenamiento pericarpio de tomate; funciones de tubérculo de patata)6,7,8 . En la fruta, se ha sugerido que eso endoreduplication desempeña un papel en facilitar la rápida expansión del pericarpio evidenciada por la relación negativa entre la endorreduplicación y fruto del desarrollo período9. Por ejemplo células con contenido hasta C 512 (512 veces el genoma haploide) se han observado en el pericarpio de tomate8de ADN. Además Chevalier et al (2014) demostró que alteraciones en la expresión de genes del ciclo celular pueden conducir a aumentos en niveles de endorreduplicación dentro del pericarpio que entonces se traduce en frutas más grandes10. Así, alteración de genes promoviendo endoreduplication proporciona una diana potencial para la mejora de la biomasa o la producción a través de fitomejoramiento o manipulación genética. Sin embargo, tal mejora está condicionada a una mayor comprensión de las causas y consecuencias de la endorreduplicación.
Endorreduplicación más a menudo se mide por citometría de flujo por el núcleo, en preparaciones de tejido crudo11, se incuba con un fluoróforo de unión al ADN, tales como yoduro de propidio12 (PI). Las muestras filtradas pasan luego por el láser de un citómetro de flujo donde se pueden observar longitudes de onda de emisión específicos para el fluoróforo. La intensidad de fluorescencia en cada caso (es decir, núcleo) está directamente relacionada con el contenido de ADN de la partícula. Así, por comparación con un estándar conocido, puede calcularse el contenido de ADN relativo y absoluto de las células en una muestra determinada. Índices de endorreduplicación (IE) se determinan estableciendo el número promedio de endocycles por la célula dentro de una muestra, observando el contenido celular de ADN (valor C) donde C 1 es el contenido de ADN de una célula haploide (fórmula presentada en el paso 6.7 del Protocolo). Por ejemplo, en un organismo diploide, el contenido base de ADN de las células somáticas es 2C. Si una muestra tiene algunas células con 4C, correspondiente a una sola ronda de endorreduplicación, o mayor tendría un EI cerca de 0; sin embargo si casi todas las células son 4C IE sería aproximadamente 1. Sin embargo, como múltiples rondas de endorreduplicación son comunes en plantas observados IE los valores más altos puede ser mucho mayores. Mientras calcula índices de endorreduplicación puede relativamente sencilla, que requiere que la abundancia relativa de núcleos C valores confiablemente determinar, que está impedido en ciertas especies y tejidos (incluyendo tubérculos de papa). Es probable que las diferencias en el celular la pared celular, la química o la anatomía composición13 causan estas muestras ser recalcitrante para las preparaciones típicas utilizando una cuchilla de afeitar para liberar los núcleos directamente en buffers adecuados que se utilizan con tejidos como el pericarpio de tomate, un modelo de endorreduplicación estudios8.
En Papa, el examen de endorreduplicación dentro el tubérculo sigue siendo limitado a los estudios un par, tal vez debidos en parte a la falta de un protocolo confiable como las mencionadas preparaciones crudas resultados inconsistentes. Si bien estos enfoques funcionan bien para las muestras de tubérculo experimentan severa degradación y una abundancia de ruido en forma de residuos, haciendo diferenciación de picos conformada por núcleos con valores C diferentes casi imposibles de hojas. Esto es quizás debido a diferencias en la composición celular y una profusión de detritos celulares dentro de las células del tubérculo (e.g. amyloplasts almacenamiento de almidón). Para superar este obstáculo, recientemente desarrollamos un protocolo más fiable para la adquisición de picos distinguibles en citometría de flujo de tubérculos de papa. La frecuencia de células dentro de cada pico puede utilizarse para calcular niveles de endorreduplicación precisa para diferentes genotipos o diferentes tejidos que componen un tubérculo. El protocolo, que emplea un antecedente de protoplasto modificado extracción método14,15 descrito previamente flujo cytometry11, mostró una variación considerable dentro de parientes de patatas, variedades y tejidos16 . Aquí presentamos el protocolo en detalle mediante la evaluación de la IE en los contextos de ploidía, tejido y tamaño del tubérculo.
Protocol
Nota: Es importante incluir controles adecuados, generalmente en forma de tejido foliar de la misma ploidía como muestras experimentales. Esto es porque el pico de 2C de las muestras del tubérculo puede ser pequeñas y difíciles de identificar.
1. preparaciones
Nota: Las soluciones enumeradas aquí pueden preparadas antes de tiempo y almacenadas a 4 ° C pero las presentadas en los pasos posteriores deben ser frescas en el día de uso.
- Hacer un volumen adecuado de solución de incubación plasmólisis (PIS) (15 mL/muestra): 0,55 M manitol, 2 mM CaCl2, 1 m m KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris buffer pH 7,5 (ajustado con ácido clorhídrico).
- Hacer un volumen adecuado de solución de lavado de plasmólisis (PWS) (15 mL/muestra) que es idéntico al PIS a excepción de la adición de 0,71 M manitol.
- Tomar 250 mL de citometría de flujo tampón11 (FCB de modificado Galbraith): 13,6 mM citrato de sodio (trisódico), TRAPEADORES de 8 mM, 18 mM de MgCl2, 0,4% v/v Triton X-100. Agitar durante al menos 30 minutos distribuir el Triton X-100.
- Filtro de esterilizar soluciones de PIS y PWS con un filtro de 0,22 μm asimétrico Polietersulfona (aPES). Usar unidades de filtración por vacío.
-
Preparación de filtros de malla de 106 μm para protoplastos sometidas a lisis. Preparar 1,5 mL tubos de microcentrífuga que pueden anidar directamente en los tubos de colección, sin embargo puede utilizarse cualquier método de suspensiones que pasan a través de un filtro de 106 μm.
Nota: Estos no necesitan ser estériles.- Si utiliza tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, corte 1 cm de la punta de cada tubo de microcentrífuga. Usando una placa caliente u otro calor de fuente de calor un 1 cm2 pieza 106 μm acero malla en un pedazo de papel de aluminio. Presione el extremo cortado del tubo en el acoplamiento hasta que han fusionado.
- Lavar patatas a degustar, quitando todos los escombros y suelo.
Nota: Edad y tamaño deben ser apropiados para los objetivos del experimento pero no parecen afectar la calidad de los resultados. Con éxito hemos aplicado este protocolo a tubérculos que han estado en almacenamiento en frío (4 ° C, 95% HR) hasta a 8 meses. Tubérculos con defectos (por ejemplo tuber fin rot, corazón hueco, áreas necróticas de color marrón) pueden ser sensibles, debe evitar, si es posible.
2. día 1: Plasmolyze tejido de tubérculo
Nota: Las muestras de hojas de Control se pueden incluir aquí para producir protoplastos o en paso 5.2 si se prefieren los preparados crudos. Esto debe realizarse con instrumentos estériles en un ambiente aséptico como una campana de flujo laminar.
- Superficie de esterilizar los tubérculos de patata mediante inmersión en etanol al 75% durante al menos 5 minutos.
- Retirar los tubérculos del etanol y secar al aire. Esto suele ~ 5 min, más si el tubérculo es mayor que 100 g.
- Preparar y tubos cónicos de etiqueta estéril 50 mL para cada muestra y una alícuota 15 mL de filtro esterilización PIS en cada uno.
-
Muestra de aproximadamente 1 cm3 del tejido deseado de tubérculos esterilizadas mediante bisturí esterilizado o perforador del corcho.
Nota: Dependiendo del tejido que se muestra se puede usar cuchillo/escalpelo o un perforador del corcho esterilizada. Por ejemplo, si se desea la médula del perforador del corcho puede usarse para tomar una base de la apical al extremo distal del tubérculo y la fracción central del núcleo puede ser muestreada. Sin embargo, debido a la morfología interna asimétrica de tubérculos de patata, puede ser más precisa al parénquima muestra o corteza por reducir a la mitad el tubérculo y extirpando el tejido deseado. Vea la figura 1 para una descripción de la morfología del tubérculo interno.- Picar tejido con un bisturí esterilizado en aprox. 3 mm3 piezas y transferencia de tejido en tubo cónico que contenga PIS. Incubar durante una noche a 4 ° C.
Nota: Esto es para maximizar el área superficial para que el PIS, y más adelante la solución de enzima, puede impregnar completamente el tejido, dando como resultado una digestión más completa.
- Picar tejido con un bisturí esterilizado en aprox. 3 mm3 piezas y transferencia de tejido en tubo cónico que contenga PIS. Incubar durante una noche a 4 ° C.
Figura 1: morfología interna de un tubérculo de patata. La separación entre el núcleo (P) y parénquima perimedular (PM) está ilustrada con líneas negras. El anillo vascular, que separa el parénquima de la corteza (C) se denota con una flecha negra. El extremo del estolón (S) y ojos del tubérculo (E) se etiquetan así. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. día 2: Generar protoplastos de patata
Nota: Esto debe realizarse con instrumentos estériles en un ambiente aséptico como una campana de flujo laminar.
- Preparar y filtro (filtro de 0.45 μm monos) una cantidad apropiada de solución de enzima (ES) (10 mL/muestra): 0,71 M manitol, 3 mM CaCl2, 1 m m KH2PO4, 1 mM MgCl2, celulasa Onozuka R-10 de 4%, 0.8% macerozyme R-10, 1% hemicululase, 10 tampón MES mM, pH 5.8. Garantizar que los filtros adecuados se utilizan en este paso; filtros con poros de tamaño inferior a 0.45 μm son propensos a la obstrucción mientras que una membrana de unión de baja proteína, como simios, minimiza la pérdida de la enzima durante la filtración.
- Aspirar el PIS de las muestras en tubos cónicos con una pipeta serológica estéril.
- Añadir 10 mL de CE para cada muestra e invierta 2 – 3 veces.
- Incubar las muestras durante la noche a 29 ° C con agitación horizontal de 180 rpm. Incubar las muestras durante al menos 16 h.
4. día 3: Cosecha protoplastos y protoplastos de lavado
Nota: Las condiciones asépticas son no tiempo necesarias en este punto.
- Extraer muestras de la coctelera y permitirles reposar aproximadamente 10 minutos.
-
Aspirar apagado como gran parte de la solución ES posible.
- Eliminar gran parte de la solución ES posible con una pipeta serológica, teniendo cuidado de evitar quitar el tejido digerido.
- Usando un micropipeta quitar cualquier residuo de la solución ES, otra vez evitando el tejido digerido. Esto se hace más fácilmente manteniendo el tubo en ángulo para que la solución ES fluye hacia la tapa, mientras que el tejido digerido queda en la parte inferior.
- Añadir 15 mL de PWS a cada muestra e inviértalo suavemente 2 a 3 veces. Permiten protoplastos a reposar 10 minutos.
- Quitar PWS con una pipeta serológica. Utilice una micropipeta para quitar cualquier líquido restante.
Nota: Este paso es imprescindible para garantizar la integridad de los núcleos de la muestra durante la citometría de flujo. En la resolución de problemas, este paso fue encontrado para ser la fuente más probable de fracaso en una muestra.
5. día 3: Preparar las muestras para citometría de flujo
Nota: Las muestras deben mantenerse sobre hielo desde aquí a menos que se indique lo contrario.
- Preparar soluciones de RNasa y yoduro de propidio (propidio de 0,4 mg yoduro/mL FCB) (Rnasa A 0,8 mg / mL FCB) disolviendo cada uno en FCB.
PRECAUCIÓN: El yoduro de propidio es altamente tóxico. Evite el contacto con la piel o los ojos. Usar el EPP adecuado. -
Añadir 1,5 mL de hielo frío FCB para cada muestra. Brevemente sacudida o vortex cada muestra para romper agregados tejido. Es importante romper los grumos de tejido de tubérculo para que el FCB completamente puede penetrar las células y liberar los núcleos. Diferentes muestras pueden requerir más o menos agitación dependiendo del tejido y el genotipo.
Nota: El FCB descompone mediante lisis los protoplastos, liberando los núcleos. Por lo tanto, la necesidad de mantener las muestras en hielo para evitar la degradación.- Si no se incluyeron muestras de citometría de flujo de control en el paso de generación del protoplasto puede incluir aquí. Si un control debe ser agregado, picar una hoja pequeña (~ 3 cm2) en 1,5 mL de hielo frío FCB usando una cuchilla de afeitar. Muestras de control deben ser el mismo ploidía como las muestras experimentales, preferentemente el mismo genotipo. Plántulas in vitro tienden a dar picos limpiador de efecto invernadero o las plantas de producción.
-
Pasar 1 mL de la suspensión FCB y tejidos a través de un filtro de malla 106 μm. Utilizar un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con la punta cortada y malla de metal derretido en la parte inferior como se describe en el paso 1.5.1. Este tubo de microcentrífuga puede anidar directamente en un tubo de microcentrífuga de 2 mL y la muestra pasa directamente a través de. Si utiliza otro método de filtración, el filtrado puede recogido en una placa de Petri helada y luego se transfiere a un tubo de 2 mL.
Nota: a veces los restantes agregados y detritos celulares pueden obstruir el filtro de malla. En este caso, basta con pinchar los dos tubos de microcentrífuga anidado un par de veces para desalojar los desechos. - Añadir 250 μl de la solución de Rnasa a cada muestra. Invierta la placa e incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
Nota: Este paso pretende eliminar RNA de las muestras, hacia menos ruido durante la citometría de flujo. Sin embargo, como los núcleos son de breve duración, los investigadores podrán disminuir el tiempo de incubación o realizar en hielo si están experimentando degradación severa de sus muestras. - Añadir 125 μl de la solución de yoduro de propidio para cada muestra. Invierta la placa e incubar en hielo durante 30 minutos.
Nota: Puede usarse muestras para citometría de flujo tan pronto como sea posible mientras que la degradación es evidente dentro de 2 h, incluso en el hielo.
6. día 3: Citometría de flujo de los núcleos de tubérculo de patata
Nota: Software y operación del citómetro de flujo variará dependiendo del instrumento y el fabricante. Se proporcionarán instrucciones detalladas sobre el funcionamiento específico de la citometría de flujo en Guía del usuario del instrumento.
- Crear dos parcelas de punto usando la escala logarítmica de forward scatter vs dispersión de lado y lado de vs (PI) el yoduro de propidio dispersión. También crear un histograma con PI en el eje x. Escala logarítmica es necesaria para que todos los eventos son en escala como núcleos pueden diferir enormemente en fluorescencia.
-
Cargar un tubo de muestra de control conocidos y ajustar la tensión de modo que todos los eventos son a escala. Utilizamos tejido foliar in vitro de un genotipo de muestra. Si ejecutar muestras de ploidías diferentes, debe incluir una muestra control para cada uno.
- Tome nota del canal del pico de 2 C en la muestra de control. Los picos de 2C de las muestras experimentales deben caer en el mismo lugar.
- Carga una muestra experimental (tubérculo) y otra vez Asegúrese de que todos los eventos son a escala. Si los ajustes son requeridos, repita paso 6.2 para identificar el canal de C 2 picos.
- Manualmente la puerta los núcleos de protoplasto con la trama de vs PI la dispersión lateral.
- Ajuste del histograma de PI para mostrar sólo la región de los núcleos de protoplasto cerrada.
- Recoger el número de eventos de cada muestra. Con frecuencia los investigadores utilizan 10.000 eventos cerradas para citometría de flujo; sin embargo utilizamos 2.000 eventos para muestras de protoplasto tubérculo para acomodar más muestras y muestras con concentraciones bajas.
- Calcular IE de cada muestra de los histogramas de PI mediante la fórmula siguiente:
IE =
donde el porcentaje de núcleos que son 4C (que representa a una sola ronda de endoreduplication) 4C, 8C es el porcentaje 8C, y así sucesivamente. Ver figura 4 ejemplos de histogramas y valores de C de picos.
Representative Results
Producción de protoplastos
La generación de protoplastos es necesaria para lograr resultados de citometría de flujo repetible de tubérculos de papa, la morfología general de los que se muestra en la figura 1. Los investigadores deseen asegurar protoplastos de alta calidad se han producido antes de la adición de la FCP, especialmente en el caso de que resolución de problemas es necesario. La mayoría de los protoplastos debe ser esférica con salientes mínimo (figura 2) y puede variar grandemente en tamaño, que tal vez es un reflejo de las diferencias en IE.
Figura 2: Representante protoplastos de hojas y tubérculos adquiridos a paso 4.4 protocolo de. Protoplastos aislados deben ser esférica y simétrica con membrana plasmática intacta. Tenga en cuenta la diferencia de tamaño entre hojas (A-c) y protoplastos de tubérculo (D, E) así como las diferencias en tamaño dentro de un tejido que puede indicar diferentes niveles de endorreduplicación. Protoplastos de hojas contienen cloroplastos mientras que amyloplasts son visibles dentro de los protoplastos de tubérculo. Barras de escala = 1.000 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Evaluación de resultados de la citometría de flujo
El éxito o fracaso de un experimento puede evaluarse de la anchura de los picos y su separación en los histogramas de citometría de flujo. Como endoreduplication medición requiere calcular la abundancia relativa de núcleos en cada pico, mera presencia o ausencia de picos no es suficiente si hay demasiado ruido para dibujar límites significativos entre ellos. Figura 3 muestra la variación en los resultados, los investigadores pueden encontrar en el flujo cytometry diagramas de dispersión e histogramas. Posibles causas de muestras se presentan dentro de la discusión.
Figura 3: resultados representativos obtenidos de citometría de flujo de los núcleos del protoplasto de intacto y degrada las muestras de médula. Núcleos intactos (A) Mostrar limpia separación entre picos para cuantificar la abundancia relativa de las células en cada usando el software apropiado Considerando que picos en muestras degradadas (B) muestran bases de cambiado de puesto, amplia y superpuestas. En los diagramas de dispersión de intacto (C) y degradados (D) muestras, cajas negras indican evento nuclear gating de histogramas y el agrupamiento de eventos se refleja en la anchura de los picos del histograma. Eventos fuera de las puertas indican residuos núcleos severamente degradados y otros agregados. PI-H corresponde a la intensidad de la fluorescencia que es medida en unidades arbitrarias. Métodos de solución de problemas para evitar la degradación de la muestra se discuten en el texto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Endorreduplicación diferencias entre los tejidos
Hemos divulgado previamente que tubérculo médula tejido tiene significativamente mayores niveles de endorreduplicación de corteza tejido16. Para confirmar y ampliar en este analizamos niveles de endorreduplicación de tres tejidos diferentes en CV Superior: médula parénquima perimedular y corteza, replicado por triplicado con 2.000 eventos cerradas por muestra. Nuestros resultados confirman nuestra observación anterior que tejido de médula tiene IE significativamente mayor que el tejido cortical con medios de endocycles 1.79 y 1.12 por celda, respectivamente (p = 0.018; De prueba t de Student). Sorprendentemente, el tejido de parénquima demostró un perfil similar a la corteza y también fue significativamente diferente del tejido de la médula (media = 1,14; p = 0.013; De prueba t de Student). Estos resultados se resumen en la figura 4.
Figura 4: endorreduplicación en tres tejidos de CV Superior. Histogramas de hoja (A), (B) de la corteza del tubérculo, parénquima (C) y los tejidos de la médula (D) se muestran junto con el valor EI calculado a partir de los histogramas. Diferencias en la abundancia relativa de núcleos que comprende cada pico son evidentes, especialmente entre los tejidos de la hoja y tubérculo. También se muestran valores de C para cada pico. PI-H corresponde a la intensidad de la fluorescencia que es medida en unidades arbitrarias. Significa que las comparaciones de la IE de los tejidos del tubérculo aparecen en E donde el asterisco indica diferencia significativa (p < 0,05) y barras de error indican la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Influencia del tamaño del tubérculo y ploidía
Hemos divulgado previamente que, para un genotipo dado, tubérculos de diferentes tamaños pero similar madurez no muestran una diferencia correspondiente en IE16. El objetivo fue confirmar este resultado, así como evaluar la relación entre la ploidía y endorreduplicación. Para este experimento, se utilizaron tres repeticiones de tejido de parénquima de tres genotipos diferentes: CV Superior (x 4), VT_SUP_19 (2 x) que es un dihaploid extraen de CV Superior por prickle polinización17y VT_SUP_19 4 x que es una doble dihaploid 18 isogénicas a VT_SUP_19. Se incluyeron un conjunto de réplicas para grande (90 – 130 g) y pequeño (< 35 g) tubérculos para CV Superior mientras que tubérculos para los otros dos genotipos fueron de 90 a 130 g. Los tubérculos fueron extraídas de invernadero cultivado plantas en plena madurez, es decir, las puntas de las plantas tenían senescentes. Se observó una diferencia significativa entre VT_SUP_19 y su progenitor Superior (p = 0,04); sin embargo, no hubo diferencias significativas entre VT_SUP_19 y VT_SUP_19 x 4 (p = 0,69). Esto indica que mientras que hay un probable componente genético a la endorreduplicación, como desenmascarado por la reducción genómica, no obedece a ploidía, al menos en este contexto. Por último, una vez más no observamos ninguna diferencia significativa entre CV. grandes y pequeños tubérculos Superior como se muestra en la figura 5.
Figura 5: endorreduplicación en dos tamaños de tubérculos de la variedad Superior y diploide (VT_Sup_19) y tetraploide (VT_Sup_19 x 4) derivados. El gráfico de barras muestra la media de pequeño (< 35 g) y tubérculos Superior de CV grande (90 – 130 g) así como tubérculos grandes (90 – 130 g) de la dihaploid VT_SUP_19 y el dihaploid doblado isogénicas VT_SUP_19 4 x. Diferencias significativas (p < 0,05) se indican en el informe de carta conexión. Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El protocolo aquí presentado ofrece los investigadores un medio para evaluar endorreduplicación en tubérculos de papa, cuyo celular modificado contenido y mayor tamaño de la célula aparentemente excluye otras preparaciones de citometría de flujo. El protocolo se basa en la generación de protoplasto como un medio para reducir el ruido y la suciedad mientras que mantiene integridad nuclear. Previamente, los investigadores han descrito preparaciones similares para las muestras de citometría de flujo especialmente recalcitrante como utilizaron protoplastos de tubérculo para estudiar una variedad de temas como la patogenesia19,20. Sin embargo, a nuestro conocimiento, ningunos han combinado el uso de esos protoplastos de tubérculo con citometría de flujo con el fin de estudiar la endorreduplicación. Por otra parte, encontramos el uso de protoplastos más fiables de preparaciones típicas de crudo, así como la técnica utilizada en los dos solamente otros estudios para evaluar tubérculo endoreduplication6,7. Aquí discutimos las deficiencias del Protocolo, peligros potenciales en su ejecución y muestra la preparación y resultados de un experimento típico que lo emplea.
A pesar de la utilidad y la repetibilidad del Protocolo de citometría de flujo de tubérculo, que tiene algunas debilidades que deben ser discutidas. Para empezar, el protocolo es tiempo intensivo, que requieren dos incubaciones durante la noche. Además, el protocolo requiere algunos reactivos costosos, particularmente la celulasa y macerozyme. Además, las preparaciones son muy sensibles al tiempo, degradantes dentro de unas horas, que pueden limitar el rendimiento en un solo día, especialmente si se desean que los eventos. Por último, el protocolo, mientras que es confiable, es sensible a errores en la preparación de la muestra todos los cuales parecen resultar en daños a los núcleos y resultados de calidad inferiores. Por ejemplo, contaminación microbiana puede ocurrir durante la plasmólisis y protoplasto generación (1 – 3,4) debido a la inadecuada técnica aséptica. Contaminación de las muestras, mientras que no siempre el éxito de una muestra, parece disminuir considerablemente la calidad de los histogramas obtenidos, otra vez probablemente debido al daño a los núcleos.
Como se dijo anteriormente, los principales inconvenientes del protocolo son costos, tiempo y sensibilidad a los errores. Los investigadores deseen tomar medidas para mitigar cada uno de ellos. En cuanto a costo, los investigadores con la intención de aplicar el protocolo para muchas muestras pueden considerar modificar las concentraciones de enzima o duración de la etapa de digestión como diferentes tejidos y genotipos pueden variar en respuesta. Esto incluye la posibilidad de filtrar y reciclar el que previamente se ha demostrado pero no ES empleado aquí21. En cuanto a tiempo, en nuestra observación, es posible prescindir de la primera incubación (paso de plasmólisis) y todavía Extracto de protoplastos; sin embargo, verá afectada su integridad y abundancia, que afecta negativamente los resultados. Para reducir el deterioro de las muestras los investigadores pueden considerar que algunos métodos de citometría de flujo incluyen el uso de fijadores (p. ej., formaldehído) para preservar la integridad de muestra22. Esto puede ser un medio útil tanto evitar su deterioro y permitir muestra almacenamiento en lugar de protoplasto imposición y flujo cytometry que ocurren el mismo día tal como se presenta. Otra forma de prevenir el desgaste de los núcleos puede ser incluir un inhibidor de nucleasas en la CE y/o FBC; mientras que el 2-Mercaptoetanol había efectuada sin cambios durante el desarrollo, otros inhibidores no han sido probados en el presente.
En nuestra observación, el solo paso más crítico es paso 4.4, la extracción de solución de lavado plasmólisis todos antes de la adición del buffer de citometría de flujo (FCB). Si incluso un pequeño volumen (< 10 μl) restos, las muestras son mucho más propensos a ser degradados que pueden conducir a una muestra de pobre o incluso fracasada. Esto es probablemente debido a las impurezas en la solución de la enzima (e.g. nucleasas, proteasas)23,24 que degradan rápidamente los núcleos durante los períodos de incubación y el tiempo entre muestras, incluso a bajas concentraciones. Otra consideración importante es la duración de los pasos de incubación PI y Rnasa. Como se señala en el protocolo, las muestras no permanecen estables durante más de unas pocas horas después de adición de la FCB por lo que los investigadores pueden decidir reducir la duración de estas medidas para acomodar más muestras o citometría de flujo largo procedentes de núcleos baja concentraciones. Esto también requiere que el investigador a considerar el equilibrio entre el número de eventos por muestra y el número total de muestras para ejecutar o considerar el uso de fijadores según lo mencionado previamente.
Diferencias entre los tejidos y los genotipos
Para proporcionar a resultados representante del protocolo hemos diseñado dos experimentos simples para confirmar variación previamente divulgado por el tejido y examinar la influencia de la ploidía y el genotipo. Los resultados del experimento tejido demuestran que el protocolo produce resultados reproducibles, como tejido de médula una vez más fue encontrado para tener el IE más alto. Algo sorprendente tejido de parénquima, que previamente no había sido evaluado, tenía un valor de IE similar al tejido cortical y significativamente menor que la médula. Se trataba de imprevistos como las células del parénquima son típicamente más grandes que ya sea de médula o de células corticales, por lo menos en la madurez. Una posible explicación es que los tubérculos (90 – 130 g) eran demasiado inmaduros para las células del parénquima, que constituyen la mayoría del volumen del tubérculo en la madurez, han ampliado y alcanzó sus máximos valores de C25. Esto también puede explicar por qué el dihaploid (VT_SUP_19) y el dihaploid doblado (VT_SUP_19 4 x) demostró EI significativamente mayor que los tubérculos Superior de CV; mientras que de cada genotipo, se tomaron muestras de tubérculos de aproximadamente igual tamaño, el tamaño máximo de los tubérculos de VT_SUP_19 o tetraploide isogénicas es mucho más pequeño que el de la progenitora. Así, puede ser que muestre mayor IE simplemente porque eran más grandes en relación a su tamaño máximo alcanzable. Por otra parte, la diferencia puede ser una consecuencia del complemento genético que vt_sup_19 recibido de su progenitora tetraploide. Otra posibilidad es que la reducción genómica que ocurrió en la extracción de la dihaploid de la tetraploide puede haber desenmascarado a alelos deletéreos en tensión toda la planta, que también se ha demostrado que contribuyen a la elevada IE26. Sin embargo, esto demuestra que los investigadores de la consideración cuidadosa deben emplear al seleccionar tubérculos y tejidos para ser utilizado para la comparación de los valores de la IE, especialmente entre los genotipos.
Futuras aplicaciones
El protocolo descrito en este artículo ofrece a los investigadores una importante herramienta para comprensión endorreduplicación en Papa. Puede permitir los estudios en los componentes genéticos y ambientales de la endorreduplicación, el curso del tiempo de desarrollo a través de los tejidos del tubérculo y la evaluación de la variación natural. En última instancia, endorreduplicación puede hacer un objetivo prometedor para la mejora de la patata, la empresa que requiere un medio confiable de evaluación.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por la nacional Science Foundation Premio número 1237969, "Desenredando el heterocigoto, la composición alélica y variación en número de copias de la papa" y USDA especial beca 2014-34141-22266 (Universidad de Maine) a RV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
- Wilson, E. The karyoplasmic ratio. 727, 3rd edn, The Macmillan Company. (1925).
- Szymanski, D. B., Marks, M. D. GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).
- Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).
- Grafi, G., Larkins, B. A. Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases. Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).
- Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication. Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2. Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth. Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).
- Cheniclet, C., et al. Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth. Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).
- Pirrello, J., et al. How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches. Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).
- Chevalier, C., et al. Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory. J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).
- Galbraith, D. W., et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).
- Doležel, J., Greilhuber, J., Suda, J. Flow Cytometry with Plants: An Overview. Flow Cytometry with Plant Cells. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 41-65 (2007).
- Doležel, J., Bartoš, J. A. N. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).
- Doke, N., Tomiyama, K. Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues. Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).
- Davis, D. A., Currier, W. W. The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts. Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).
- Laimbeer, F. P. E., et al. Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops. Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).
- Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination. Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).
- Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants. Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).
- Doke, N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity. Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).
- Doke, N., Tomiyama, K. Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans. Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).
- Saxena, P. K., King, J. Reuse of enzymes for isolation of protoplasts. Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).
- Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. Cytometry and flow cytometry of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants. Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).
- Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. Tissue and cell culture. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , Springer. 39-50 (2013).
- Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement. Advances in Cell Culture. Maramorosch, K. 1, Elsevier. 241-279 (1981).
- Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions. Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).
- Scholes, D. R., Paige, K. N. Plasticity in ploidy: a generalized response to stress. Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).
