Summary
הפרוטוקול המתואר במסמך זה היא שיטה למדידת endoreduplication בתוך פקעות של תפוחי אדמה (סולנום יכולת להתקשר אלי). הוא כולל פעולות החילוץ פלסמוליזה ו פרוטופלאסט כדי להקטין את רעש ופסולת בניתוח cytometric במורד הזרם.
Abstract
Endoreduplication, השכפול של הגנום הגרעיני של התא ללא ציטוקינזה עוקבות, התשואות תאים עם תוכן ה-DNA מוגברת והיא קשורה עם התמחות, פיתוח, עלייה בגודל הסלולר. בצמחים, endoreduplication נראית להקל על צמיחה והתרחבות של רקמות ואיברים מסוימים. ביניהם הוא פקעת של תפוח אדמה (סולנום יכולת להתקשר אלי), אשר עובר הרחבה ניכרת הסלולר במילוי תפקידה של פחמימות אחסון. לפיכך, endoreduplication עשוי לשחק תפקיד חשוב איך הם מסוגלים להכיל את השפע של פחמן. עם זאת, ההריסות הסלולר הנובע שיטות בידוד גרעיני גס של פקעות, שיטות שבהן ניתן להשתמש ביעילות עם עלים, מונע את ההערכה של מדד endoreduplication פקעת (EI). מאמר זה מציג שיטה להערכת פקעת endoreduplication דרך בידודו של protoplasts בזמן בהפגנות תוצאות נציג המתקבלים שונים אחרים, מידרו פקעת רקמות. המגבלות הגדולות של הפרוטוקול הן עלויות וזמן ריאגנט נדרשת הכנת הדוגמא, כמו גם תוחלת החיים קצרה יחסית של דגימות לאחר פירוק של protoplasts. בעוד הפרוטוקול הוא רגיש וריאציה טכני, הוא מייצג שיפור על השיטות המסורתיות של בידוד הגרעין של תאים מיוחדים גדולים אלה. אפשרויות לשיפורים בפרוטוקול כגון מיחזור אנזים, השימוש של כתות ומייצבים, שינויים אחרים מוצעים.
Introduction
Endoreduplication היא התהליך שבאמצעותו תא forgoes מחזור התא טיפוסי, במקום זה עובר מסלול חלופי של פיתוח בהיקף של סיבובים חוזרים ונשנים של שכפול ה-DNA ללא חטיבת הסלולר. התא שיתקבל יהיה הגדילו את הדנ א וגודל תוכן הגרעינית אשר הוא חשב לשחק תפקיד הסלולר רגולציה, הרחבה, התמחות. באופן כללי, סיבוב של endoreduplication (הנקרא endocycle) והעלייה המתאימים בתוכן DNA משויכים נפח תא גדול, התבוננות שבגינו את "תורת karyoplasmic", אשר גדל DNA תוכן נדרשת כראוי לווסת גדול יותר, אולי יותר מורכבת, תא1. תופעה זו שכיחה אצל צמחים גבוהים, שיש נצפתה במגוון של רקמות, כולל אלה בעלי מבנה/הגנתי (trichomes)2,3,4,התזונתי (האנדוספרם תירס)5ו (הכיור/אחסון עגבניות לגלעינים; פקעת תפוח אדמה)6,7,8 פונקציות. בפרי, הוצע ש-endoreduplication את תפקיד בקידום ההתרחבות המהירה של לגלעינים כפי שמעידים הקשר השלילי בין endoreduplication ופירות התפתחותית מחזור9. למשל תאים עם תוכן עד 512C (512 פעמים הפלואידי הגנום) נצפו לגלעינים עגבניות8ה-DNA. יתר על כן שבלייה et al. (2014) הוכיח כי שינויים בביטוי הגנים מחזור התא יכול להוביל מגביר רמות endoreduplication בתוך לגלעינים המביא ואז פירות גדולים10. לכן, שינוי של גנים קידום endoreduplication מספק יעד פוטנציאליים לשיפור של ביומסה או התשואה דרך פיתוח זרעים או מניפולציה גנטית. אולם, השיפור הוא מקצוע הבנה טובה יותר של הגורמים וההשלכות של endoreduplication.
Endoreduplication נמדד לרוב דרך cytometry זרימה לפיה מודגרת גרעינים, שיצא ברקמה גסה ההכנות11, עם fluorophore איגוד ה-DNA, כגון propidium יודיד12 (PI). הדגימות מסוננים מועברים ואז על ידי הלייזר של cytometer זרימה איפה יכול להיות שנצפו פליטה אורכי גל ספציפי fluorophore. האינטנסיביות של זריחה בלכל אירוע (קרי, גרעין) קשורה ישירות עם התוכן-דנ א של החלקיק. לפיכך, על ידי השוואת סטנדרט ידוע, התוכן של יחסיים ומוחלטים ה-DNA של תאים במדגם נתון עשוי לחשב. מדדי Endoreduplication (EI) נקבעים על-ידי קביעת המספר הממוצע של endocycles עבור כל תא בטווח מדגם על ידי התבוננות לתוכן ה-DNA סלולארי (C-ערך) ג 1 איפה התוכן ה-DNA של תא הפלואידי (נוסחת הציגה בשלב 6.7 לפרוטוקול). למשל, באורגניזם דיפלואידי, בסיס DNA תוכן תאים סומטיים הוא 2 ג אם לדוגמה יש כמה תאים עם 4C, המתאימים כדי סבב אחד של endoreduplication, או גדול הייתי של EI ליד 0; עם זאת, אם כמעט כל התאים הם 4C EI יהיה כ 1. עם זאת, כמו מספר סיבובים של endoreduplication נפוצים ערכים EI הנצפה של צמחים גבוהים יותר ייתכן גדול הרבה יותר. בעת חישוב מדדי endoreduplication אולי פשוטה יחסית, שזה דורש כי abundances היחסית של גרעינים C-ערכים להיות אמינה לקביעה, אשר היא מנעה מינים מסוימים, רקמות (כולל פקעות תפו א). סביר להניח כי ההבדלים הסלולר אנטומיה, כימיה או קיר התא הרכב13 לגרום הדוגמיות הללו להיות עקשניים על ההכנות טיפוסי באמצעות סכין גילוח כדי לשחרר את הגרעינים ישירות לתוך המתאים מאגרי משמשים עם רקמות כגון עגבניות לגלעינים, מחקרים למודל endoreduplication8.
תפוחי אדמה, הבחינה של endoreduplication בתוך פקעת נותר מוגבל ללימודים רק כמה, אולי בחלקו בשל חוסר פרוטוקול אמין כמו ההכנות גולמי הנ ל להניב תוצאות לא עקביות. עוד גישות כאלה עובד טוב עלים הדגימות פקעת חווים השפלה חמורה, שפע של רעש בצורה של פסולת, גורם הבידול של פסגות מורכבת גרעינים עם שונות C-ערכים כמעט בלתי אפשרי. אולי זה בגלל ההבדלים ההרכב הסלולר ואת בריבוי של פסולת סלולר בתוך פקעת תאים (למשל. אחסון עמילן amyloplasts). כדי להתגבר על המכשול הזה, לאחרונה פיתחנו פרוטוקול אמין יותר לרכישת פסגות ההרים להבדיל cytometry זרימה של פקעות תפוחי אדמה. התדירות של תאים בתוך כל שיא ואז ניתן לחישוב מדויק endoreduplication רמות שונות אחרים או ברקמות שונות המרכיבות את פקעת. הפרוטוקול, אשר מעסיקה הפותח של-15 14,שיטת החילוץ פרוטופלאסט ששונה שתואר קודם לכן לזרום cytometry11, הראה וריאציה ניכר בתוך תפוחי אדמה קרובי משפחה, הזנים, רקמות16 . כאן אנו מציגים את הפרוטוקול בפירוט על-ידי הערכת EI בהקשרים של פלואידיות, רקמות וגודל פקעת.
Protocol
הערה: חשוב לכלול הפקדים המתאימים, בדרך כלל בצורה של רקמת העלה פלואידיות אותם כדוגמאות ניסיוני. הסיבה לכך היא הפסגה 2C של פקעת דגימות עשוי להיות קטן, קשה לזהות.
1. תכשירים
הערה: הפתרונות המפורטים כאן עשויים להיות שהוכנו מבעוד מועד ומאוחסנים ב 4 ° C, אך אלה שהוצגו והשלבים חייבת להיעשות טרי ביום של שימוש.
- ליצור אמצעי אחסון המתאים של פתרון הדגירה פלסמוליזה (PIS) (15 מ ל/דוגמה): 0.55 מ' מניטול, CaCl 2 מ מ2, 1 מ מ ח'2PO4, 1 מ MgCl2, 50 מ מ טריס מאגר pH 7.5 (מותאם עם HCl).
- ליצור אמצעי אחסון המתאים של פתרון שטיפת פלסמוליזה (PWS) (15 מ ל/דוגמה) וזה זהה PIS למעט תוספת של מניטול 0.71 מ'.
- להפוך 250 מ ל ששונה גלבריית Flow Cytometry מאגר11 (FCB): מ מ 13.6 סודיום ציטרט (trisodium), סחבות 8 מ"מ, 18 מ מ MgCl2, 0.4% v/v טריטון X-100. מערבבים במשך לפחות 30 דקות להפיץ את X-100 טריטון.
- מסנן לחטא PIS ופתרונות PWS עם מסנן polyethersulfone א-סימטרי (קופים) 0.22 מיקרומטר. השתמש יחידות סינון מונע ואקום.
-
להכין את מסנני רשת מיקרומטר 106 lysed protoplasts. להכין 1.5 mL צינורות microcentrifuge אשר עשויים להיות מקוננות ישירות לתוך צינורות איסוף, אולם ניתן להשתמש בכל שיטה של העברת המתלים דרך מסנן מיקרומטר 106.
הערה: אלה לא צריך להיות סטרילי.- אם באמצעות צינורות microcentrifuge 1.5 mL, לחתוך 1 ס מ מקצה כל שפופרת microcentrifuge. באמצעות צלחת חמה או אחרים חום מקור חום2 1 ס מ חתיכה 106 מיקרומטר פלדה רשת שינוי על פיסת נייר אלומיניום. לחץ הסוף לחתוך הצינור לתוך רשת השינוי עד שהם מתאחד.
- רחץ תפוחי אדמה מתחננות שיטעמו, הסרת כל קרקע ופסולת.
הערה: פקעת לגודל ולגיל כדאי יאה מטרות הניסוי, אך לא נראה להשפיע על איכות התוצאות. אנחנו בהצלחה החלת פרוטוקול זה פקעות אשר היו במקרר (4 ° C, 95% RH) עד 8 חודשים. בעוד פקעות עם פגמים (למשל פקעת סוף רוט, לב חלול, חום אזורי נמק) עשוי להיות קשוב, הם צריכים להימנע, במידת האפשר.
2. יום 1: Plasmolyze רקמת פקעת
הערה: בקרת דגימות עלים יכולים להיכלל כאן כדי לייצר protoplasts או בכל צעד 5.2 אם ההכנות גולמי עדיפים. זה יש לבצע עם כלי סטרילי סביבה aseptic כגון תא למינארי.
- משטח לעקר את פקעות תפוחי אדמה באמצעות טבילה 75% אתנול לפחות 5 דקות.
- הסר פקעות של אתנול, אוויר יבש. זה בדרך כלל לוקח ~ 5 דקות, זמן רב יותר אם פקעת גדולה יותר 100 גרם.
- הכנה של צינורות חרוט סטרילי 50 מ ל תווית עבור כל דגימה וכל aliquot 15 mL של מסנן לעקר PIS לתוך כל.
-
לטעום כ 1 ס מ3 של הרקמה הרצויה של פקעות סטיריליים באמצעות אזמל מעוקר או פקק בורר.
הערה: בהתאם הרקמה להיות לטעום אחד עשוי להשתמש הפקק סטיריליים בורר או סכין/ומהדקים. למשל, אם הפקק רצוי בורר הפקק עשוי לשמש כדי לקחת גרעין מן הפסגה לקצה הדיסטלי של פקעת, תוכלו לטעום את חלק הליבה המרכזית. עם זאת, בשל המורפולוגיה פנימי אסימטרי של פקעות תפוחי אדמה, זה יהיה מדויק יותר אל parenchyma מדגם או קליפת halving פקעת, excising הרקמה הרצויה. לקבלת תיאור פנימי פקעת מורפולוגיה של, ראה איור 1 .- לקצוץ גס את הרקמה באמצעות אזמל סטיריליים לתוך כ 3 מ מ3 חתיכות ורקמות העברה אל צינור חרוטי המכיל PIS. דגירה בין לילה ב 4 º C.
שימו לב: זאת כדי למקסם את שטח הפנים כך PIS, ולא מאוחר יותר הפתרון אנזים, ייתכן מלא מחלחלים הרקמה וכתוצאה מכך מפורט יותר לעיכול.
- לקצוץ גס את הרקמה באמצעות אזמל סטיריליים לתוך כ 3 מ מ3 חתיכות ורקמות העברה אל צינור חרוטי המכיל PIS. דגירה בין לילה ב 4 º C.
איור 1: מורפולוגיה פנימי של פקעת תפוח אדמה. ההפרדה בין הפקק (P) perimedullary parenchyma (PM) מומחש עם קווים שחורים. הטבעת כלי דם, אשר מפריד parenchyma בין קליפת המוח (ג) זה מסומן עם חץ שחור. בסוף stolon (S) ו פקעת עיניים (E) מסומנות גם כן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
3. יום 2: ליצור Protoplasts תפוחי אדמה
הערה: זה יש לבצע עם כלי סטרילי סביבה aseptic כגון תא למינארי.
- להכין ולסנן (מיקרומטר 0.45 הקופים מסנן) הכמות המתאימה של אנזים פתרון (ES) (10 מ"ל/דוגמה): 0.71 מ' מניטול, CaCl 3 מ מ2, 1 מ מ ח'2PO4, 1 מ MgCl2, cellulase Onozuka R-10 4%, 0.8% macerozyme R-10, hemicululase 1%, 10 מ מ MES מאגר, pH 5.8. להבטיח כי המסננים המתאימים משמשים בשלב זה; מסננים עם גודל קטן יותר 0.45 מיקרומטר נוטים סתימת ואילו קרום מחייב חלבון נמוכה, כגון קופים, ממזערת אובדן של האנזים במהלך סינון הנקבוביות.
- וארוקן את PIS מדגימות חרוט צינורות באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילי.
- להוסיף 10 מ של ES אחד לטעום, היפוך 2 – 3 פעמים.
- דגירה דגימות בן לילה ב 29 ° C ברעידות אופקי 180 סל ד. דגירה בדגימות לפחות 16 h.
4. יום 3: Protoplasts הקציר, שטיפת Protoplasts
הערה: Aseptic התנאים לא זמן הכרחי בשלב זה.
- להסיר דגימות של שייקר ולאפשר להם להסתפק ~ 10 דקות.
-
האחות את כל כך הרבה של הפתרון ES ככל האפשר.
- להסיר כמה הפתרון ES ככל ריאלי עם פיפטה סרולוגית, מקפיד להימנע הסרת הרקמה מעוכל.
- באמצעות הסרה micropipette של כל פתרון ES הנותרים, הימנעות שוב הרקמה מעוכל. הדבר מתבצע בקלות הרבה ביותר על-ידי החזקת את הצינור בזווית כך הפתרון ES זורם לכיוון המכסה בעוד הרקמה מתעכל נשאר בתחתית.
- להוסיף 15 מ"ל של PWS כל דגימה, היפוך בעדינות 2 – 3 פעמים. לאפשר protoplasts להתפשר על 10 דקות.
- הסר PWS עם פיפטה סרולוגית. השתמש micropipette כדי להסיר את כל הנוזל הנותר.
הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לוודא את התקינות של גרעינים מדגם במהלך cytometry זרימה. פתרון בעיות, שלב זה נמצאו להיות המקור הסביר ביותר של כשל במדגם.
5. יום 3: הכנת דוגמאות עבור Cytometry זרימה
הערה: הדגימות יש לשמור על קרח מכאן. אלא אם כן צוין אחרת.
- להכין propidium יודיד (0.4 מ"ג propidium יודיד/מ"ל FCB) ופתרונות RNase (0.8 מ ג RNase A / mL FCB) על ידי המסת כל FCB.
התראה: Propidium יודיד הוא רעיל מאוד. יש להימנע ממגע עם העור או העיניים. ללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי המתאים. -
להוסיף 1.5 מ של קרח FCB קר אל כל דגימה. בקצרה טלטול או מערבולת כל מדגם להיפרד מצטברים ברקמות. חשוב להיפרד כגיהנום רקמת פקעת כך FCB עשויים לחדור לתאים ולשחרר הגרעינים באופן מלא. דוגמאות שונות עשויים לדרוש פחות או יותר עצבנות בהתאם רקמות גנוטיפ.
הערה: FCB lyses את protoplasts, משחררים את הגרעינים. ומכאן הצורך לשמור דגימות על קרח כדי למנוע השפלה.- אם בקרת זרימה cytometry דגימות לא נכללו בשלב דור פרוטופלאסט הם עשויים להיות כלולים כאן. אם ישנו פקד שיתווספו, קוצצים את עלה קטן (2~ 3 ס מ) 1.5 מ של קרח קר FCB באמצעות סכין גילוח. דגימות הבקרה צריך להיות פלואידיות אותו כמו הדגימות ניסיוני, רצוי גנוטיפ באותה. שתילי במבחנה נוטים לתת פיקס נקי יותר מאשר חממה או צמחים שגודלו שדה.
-
עוברים 1 מ"ל של ההשעיה FCB/רקמות מסנן רשת 106 מיקרומטר. השתמש צינור microcentrifuge 1.5 mL עם קצה מנותקים, מתכת רשת שינוי מומסת לתחתית כפי שמתואר בשלב 1.5.1. הצינור microcentrifuge הזה עשוי להיות מקוננות ישירות לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל, הדגימה עברו ישירות. אם משתמש בשיטה אחרת של סינון, ייתכן פילטרט של שליקט צלחת פטרי קפואים ויש הועבר לאחר מכן צינור 2 מ"ל.
הערה: לפעמים פסולת הסלולר אגרגטים הנותרים עלולה להיסתם המסנן ' רשת '. במקרה זה, פשוט הקש על הצינורות microcentrifuge מקונן שני מספר פעמים להוציא את הלכלוך. - להוסיף 250 µL של הפתרון RNase כל דגימה. היפוך, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: שלב זה נועד להסיר את ה-RNA הדגימות, שמוביל פחות רעש במהלך cytometry זרימה. עם זאת, כמו הגרעינים הם קצרי מועד, חוקרים עלולים להחליט להקטין את זמן הדגירה או לבצע אותו על קרח. אם הם חווים השפלה חמורה של דוגמאות שלהם. - להוסיף µL 125 של הפתרון יודיד propidium כל דגימה. היפוך, דגירה על קרח למשך 30 דקות.
הערה: דגימות אמור לשמש עבור cytometry זרימה ברגע ככל האפשר השפלה בולטת בתוך שעתיים, אפילו על קרח.
6. יום 3: Cytometry זרימה של גרעינים פקעת תפוח אדמה
הערה: זרימה cytometer מבצע ותוכנה משתנה בהתאם המכשיר והיצרן. הוראות מפורטות על פעולת ספציפיים cytometer זרימה יינתן במדריך למשתמש של הכלי.
- צור שתי חלקות נקודה באמצעות סרגל לוגריתמי של פיזור קדימה לעומת הצד פיזור ופיזור propidium יודיד (PI) לעומת צד. גם ליצור היסטוגרמה עם PI בציר ה-x. סרגל לוגריתמי נדרש כדי להבטיח שכל האירועים נמצאים בקנה מידה כמו גרעינים עשוי להשתנות במידה רבה זריחה.
-
לטעון צינור דגימת הבקרה ידוע ולהתאים את המתח כך כל האירועים הם בקנה מידה. אנו משתמשים רקמת העלה במבחנה של גנוטיפ לדוגמה. אם דוגמיות של ploidies שונים לפעול, דגימת הבקרה עבור כל אחד צריך להיות כלול.
- רשום של ערוץ 2C השיא במדגם שליטה. הפסגות 2C של הדגימות נסיוני אמור ליפול באותו מיקום.
- לטעון דוגמה ניסיוני (פקעת), שוב להבטיח כי כל האירועים הם בקנה מידה. אם התאמות נדרשים, חזור על שלב 6.2 לזיהוי הערוץ של 2C פסגות.
- שער ידני גרעינים פרוטופלאסט באמצעות העלילה vs PI פיזור בצד.
- הגדר ההיסטוגרמה PI להראות רק את האזור גרעינים פרוטופלאסט מגודרת.
- לאסוף את המספר הרצוי של אירועים כל דגימה. לעתים קרובות חוקרים משתמשים 10,000 אירועים מגודרת עבור cytometry זרימה; אולם אנו משתמשים אירועים 2,000 לדוגמאות פרוטופלאסט פקעת כדי להכיל עוד דוגמאות ודוגמאות עם ריכוזים נמוכים.
- לחשב EI של כל דגימה מ פי היסטוגרמות באמצעות הנוסחה הבאה:
EI =
איפה 4C האחוז של גרעינים אשר 4C (ייצוג סבב אחד של endoreduplication), 8C הוא האחוז אשר נמצאים 8C, וכן הלאה. ראה איור 4 עבור דוגמאות היסטוגרמות ו- C-ערכי של פסגות.
Representative Results
הפקה של protoplasts
הדור של protoplasts יש צורך להגיע לתוצאות cytometry זרימה הדיר של פקעות תפוחי אדמה, המבנה הכללי של אשר מוצג באיור1. חוקרים, ייתכן שתרצה להבטיח איכות גבוהה protoplasts הופקו לפני התוספת של FCP, במיוחד במקרה שבו פתרון נדרש. הרוב המכריע של protoplasts צריכה להיות כדורית עם בליטות מינימלי (איור 2), עשויים להיות שונים במידה רבה בגודל, שהוא אולי משקפת הבדלי EI.
איור 2: נציג protoplasts עלה, פקעת רכשה צעד 4.4 של הפרוטוקול. Protoplasts מבודד צריך להיות כדורית סימטרית עם קרום פלזמה ללא פגע. שים לב להבדל בגודל בין עלים (A-C) ו protoplasts פקעת (D, E), כמו גם את ההבדלים בגודל בתוך רקמה אשר עשוי להצביע על רמות שונות של endoreduplication. עלה protoplasts מכילים מהכלורופלסט ואילו amyloplasts גלויים בתוך protoplasts פקעת. גודל ברים = 1,000 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הערכה של תוצאות cytometry זרימה
ההצלחה או הכישלון של ניסוי עשוי להיות נאמד מול תורתו רוחבה של פסגות והפרדה שלהם ב היסטוגרמות cytometry זרימה. כמו endoreduplication מדידה דורש חישוב שפע יחסי של גרעינים כל שיא, עצם נוכחות או היעדרות של פסגות אינו מספיק אם יש יותר מדי רעש כדי להציב גבולות משמעותיים ביניהם. איור 3 מציג את הווריאציה בתוצאות חוקרים עשוי להיתקל ב לזרום cytometry פיזור החלקות והן היסטוגרמות. סיבות פוטנציאליות לקבלת דוגמאות שנכשלו מוצגים בתוך הדיון.
איור 3: תוצאות נציג המתקבל cytometry זרימה של פרוטופלאסט הגרעינים של שלם והשפילו הפקק דגימות. גרעינים שלמים (A) להראות נקי הפרדה בין פסגות לכמת שפע יחסי של תאים בכל באמצעות תוכנה מתאימה ואילו פסגות בדגימות מפורק (B) להראות בסיסים שהוסטו, רחב, חופפים. ב scatterplots של שלמה (C) ודוגמאות (D) מפורק, תיבות שחורות ציין לאירוע אטומי ורדיולוגי gating עבור היסטוגרמות ואישכול של אירועים בא לידי ביטוי ברוחב של הפסגות היסטוגרמה. אירועים מחוץ לשערים מציינים פסולת, גרעינים מפורק קשות או צבירות אחרות. PI-H מקביל עוצמת קרינה פלואורסצנטית הנמדדת ביחידות שרירותי. שיטות לפתרון בעיות כדי למנוע השפלה מדגם נידונות בתוך הטקסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Endoreduplication הבדלים בין רקמות
קודם לכן אנחנו דיווח פקעת הפקק רקמות יש רמות גבוהות באופן משמעותי של endoreduplication מאשר רקמת קליפת16. לאשר ולהרחיב על זה הסתכלנו endoreduplication רמות שלוש רקמות שונות cv. מעולה: הפקק perimedullary parenchyma, קליפה, לשכפל שהפקידים 2,000 מגודרת לאירועים לכל דגימה. התוצאות שלנו אישר שלנו תצפית קודמות כי הפקק רקמות יש EI גדול יותר באופן משמעותי מאשר רקמת קורטיקלית עם אמצעים endocycles 1.79 ו- 1.12 בכל תא, בהתאמה (p = 0.018; -T-test הסטודנט). באופן מפתיע למדי, הרקמה parenchyma הפגינו פרופיל דומה קליפת והיה גם שונה באופן מהותי מן הפקק רקמות (כלומר = 1.14; p = 0.013; -T-test הסטודנט). תוצאות אלה מסוכמות באיור4.
איור 4: Endoreduplication ברקמות שלושה של cv. מעולה- היסטוגרמות של ליף (A), פקעת (B), parenchyma (C), ואת קליפת רקמות הפקק (D) מוצגים יחד עם הערך EI שמחושבים היסטוגרמות האלה. ההבדלים בשפע היחסי של גרעינים הכוללת כל שיא הם בולט לעין, ובעיקר בין רקמות עלים, פקעת. C-ערכים עבור כל שיא מוצגים גם הם. PI-H מקביל עוצמת קרינה פלואורסצנטית הנמדדת ביחידות שרירותי. כלומר השוואות של EI של רקמות פקעת מוצגים ב- E איפה הכוכבית מציינת הבדל משמעותי (p < 0.05) קווי שגיאה מראים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
ההשפעה של גודל פקעת פלואידיות
בעבר דיווחנו כי עבור גנוטיפ נתון, פקעות של גודל שונה אך דומה בגרות לא להציג הבדל מקביל EI16. אנחנו נועדו לאשר את תוצאה זו, כמו גם להעריך את הקשר בין פלואידיות endoreduplication. עבור ניסוי זה, השתמשנו משכפל שלושה של רקמה parenchyma מתוך שלושה אחרים שונים: cv. סופריור (4x), VT_SUP_19 (2x) אשר dihaploid מופק cv. ממונה על ידי האבקה prickle17, VT_SUP_19 4 x אשר dihaploid כפולים 18 isogenic כדי VT_SUP_19. כללנו ערכה של משכפל עבור גדול (90-130 גרם) וקטנים (< 35 g) פקעות עבור cv. סופריור בזמן פקעות עבור אחרים אחרים שני היו 90-130 גרם. כולם היו פקעות שנקטפו החממה גדל צמחים בגרות מלאה, כלומר החלק העליון של הצמחים היו senesced. ראינו הבדל משמעותי בין VT_SUP_19 שלה קדמון סופריור (p = 0.04); עם זאת, היה הבדל משמעותי בין VT_SUP_19 לבין VT_SUP_19 4 x (p = 0.69). הדבר מציין כי אמנם יש מרכיב גנטי סביר endoreduplication, כמו מסיכה על ידי הפחתת גנומית, לא מוכתב על ידי פלואידיות, לפחות ברקע הזה. ולבסוף, שוב הבחנו אין הבדלים משמעותיים בין cv. קטנים וגדולים פקעות מעולה כפי שמתואר באיור5.
איור 5: Endoreduplication בשני גדלים של פקעות של cv. מעולה, שלה דיפלואידי (VT_Sup_19) tetraploid (VT_Sup_19 4 x) המעו ף. הגרף מציג את הממוצע לעסקים קטנים (< 35 g), פקעות סופריור cv. גדולים (90-130 גרם), כמו גם פקעות גדולים (90-130 גר') של dihaploid את VT_SUP_19, את dihaploid כפולים isogenic VT_SUP_19 4 x. הבדלים משמעותיים (p < 0.05) מסומנים באמצעות ח מכתב המחבר. קווי שגיאה מתארים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
פרוטוקול שהוצגו במסמך זה מספק חוקרים עם אמצעי כדי להעריך endoreduplication בתוך פקעות תפוחי אדמה, אשר הסלולר ששונה מוגברת ושביעות רצון תא גודל לכאורה למנוע תכשירים אחרים cytometry זרימה. הפרוטוקול נשענת על הדור פרוטופלאסט כאמצעי להפחתת רעש ופסולת תוך שמירה על שלמות הגרעין. בעבר, חוקרים יש תיאר תכשירים דומים לדוגמאות cytometry זרימה עקשניים במיוחד וכן מנוצל פקעת protoplasts ללמוד מגוון רחב של נושאים כגון פתוגנזה19,20. עם זאת, לידע שלנו, אף יש בשילוב שימוש כזה protoplasts פקעת cytometry זרימה כדי ללמוד endoreduplication. יתר על כן, מצאנו את השימוש protoplasts תהיה אמינה יותר מאשר ההכנות גולמי טיפוסיים, כמו גם את הטכניקה מנוצל השניים רק מחקרים אחרים כדי להעריך את פקעת endoreduplication6,7. כאן נדון את החסרונות של פרוטוקול, מוקשים פוטנציאליים ביצוע ודגימת הכנה, ואת התוצאות של ניסוי טיפוסי אשר מעסיקה אותו.
למרות השירות הדיר של פרוטוקול cytometry זרימה פקעת, יש כמה נקודות התורפה אשר ידונו. כדי להתחיל, הפרוטוקול הוא זמן אינטנסיבי, הדורשים incubations לילה שני. יתר על כן, הפרוטוקול דורש קצת יקר ריאגנטים, במיוחד את cellulase ואת macerozyme. בנוסף, ההכנות הם מאוד דחופה, משפילים בתוך מספר שעות, אשר עשוי להגביל תפוקת בתוך יום אחד, במיוחד אם אירועים רבים הם הרצויה. לבסוף, הפרוטוקול, בעוד אמין, רגיש לשגיאות תוך הכנת הדוגמא כל אשר נראה כדי לגרום נזק הגרעינים ואת תוצאות באיכות נמוכה יותר. לדוגמה, זיהום מיקרוביאלי עלולה להתרחש במהלך פלסמוליזה ו פרוטופלאסט דור השלבים (1 – 3.4) בשל הטכניקה aseptic פסולים. זיהום הדגימה, בזמן לא תמיד מסלק את ההצלחה של מדגם, נראה להפחתה משמעותית לאיכות היסטוגרמות שהושג, סביר שוב בשל נזק הגרעינים.
כאמור לעיל, החסרונות העיקריים של הפרוטוקול הם עלויות, זמן, רגישות שגיאות. חוקרים מומלץ לנקוט בצעדים כדי להמתיק בכל אלה. לגבי העלות, חוקרים מתוך כוונה להחיל את הפרוטוקול על דוגמאות רבות לשקול שינוי של ריכוז אנזים ו/או משך השלב לעיכול כמו ברקמות שונות, אחרים עשויים להשתנות ב תגובתיות. זה כולל את האפשרות של סינון, מיחזור של היצרן אשר בעבר הוכח אבל לא הועסק כאן21. לגבי זמן, בהתבוננות שלנו, זה אפשרי לוותר על הדגירה הראשון (שלב פלסמוליזה) ולחלץ עדיין protoplasts; עם זאת, שלמות ושפע שלהם יסבלו, אשר משפיעה לרעה על תוצאות. כדי להפחית את ההידרדרות של דגימות חוקרים עשויים לשקול כי כמה גישות cytometry זרימה לערב את השימוש כתות ומייצבים (למשל, פורמלדהיד) כדי לשמר את שלמות הדגימה22. זה עשוי להיות אמצעי יעיל הן למנוע הידרדרות ולאפשר מדגם אחסון מאשר פרוטופלאסט שיפסקו וזרימה cytometry המתרחשים באותו יום, כפי שהוצג. אמצעי נוסף של מניעת של התשה של גרעין האטום עשוי להיות לכלול מעכב נוקלאז ES ו/או FBC; בעוד מרקפטואתנול התבצע ללא שינויים מורגש במהלך הפיתוח, מעכבי אחרים שלא נבדקו בזאת.
בהתבוננות שלנו, השלב הקריטי ביותר יחיד הוא שלב 4.4, ההסרה של כל פתרון שטיפת פלסמוליזה לפני התוספת של המאגר cytometry זרימה (FCB). אם אפילו אמצעי אחסון קטן (< 10 µL) נשאר, הדגימות נוטים יותר להיות מושפל אשר יכול להוביל דגימה לקויה או אפילו שנכשלו. . זה ככל הנראה בגלל זיהומים בתוך הפתרון אנזים (למשל nucleases, פרוטאזות)23,24 אשר במהירות לבזות את הגרעינים בתקופת הדגירה תקופות זמן בין מדגם פועל, גם בריכוזים נמוכים. שיקול חשוב נוסף הוא משך השלבים הדגירה PI ל RNase. כאמור בפרוטוקול, הדגימות לא יישאר יציב יותר מכמה שעות לאחר תוספת של FCB כך חוקרים עשויים להחליט להפחית את המשך את השלבים הבאים כדי להתאים יותר דוגמאות או cytometry זרימה ארוך הנובע גרעינים נמוך ריכוזים. זה דורש גם החוקר לשקול את עסקת החליפין בין מספר האירועים עבור דגימה מספר דוגמאות ניתן להפעיל או לשקול את השימוש כתות ומייצבים כאמור.
ההבדלים בין רקמות אחרים
כדי לספק תוצאות נציג של הפרוטוקול תיכננו שני ניסויים פשוטים לאשר וריאציה שדווחה בעבר על ידי רקמה ולבחון את השפעת פלואידיות גנוטיפ. התוצאות של הניסוי רקמות מדגימים הפרוטוקול מניב תוצאות לשחזור, כמו רקמות הפקק שוב נמצא יש את EI הגבוהה ביותר. קצת מפתיע parenchyma רקמות, אשר היה בעבר היו מוערכים, היה ערך EI דומה רקמת קורטיקלית, נמוך משמעותית מאשר הפקק. זה היה בלתי צפויות parenchyma תאים הם בדרך כלל גדולים יותר או הפקק או תאים קורטיקליים, לפחות בעת הפירעון. הסבר אפשרי אחד הוא פקעות (90-130 גרם) היו בוגרות עבור התאים parenchyma, המהווים את רוב נפח פקעת בעת הפירעון, מלא מורחבת, הגיעו שלהם C-ערכי מקסימום25. זה גם מסביר למה את dihaploid (VT_SUP_19), את dihaploid כפולים (VT_SUP_19 4 x) הפגינו EI גדול יותר באופן משמעותי מאשר פקעות סופריור cv.; בעוד פקעות בגודל זהה כ היו לטעום מן גנוטיפ כל, הגודל המרבי של פקעות VT_SUP_19 או את tetraploid isogenic הוא הרבה יותר קטן מזה של המייצר. לפיכך, ייתכן כי הם מוצגים EI גדול פשוט בגלל שהם היו גדולים יותר יחסית לגודל המרבי שלהם בר-השגה. לחלופין, ההבדל יכול להיות תוצאה של הצבע המשלים גנטי ש-vt_sup_19 קיבל קדמון tetraploid שלה. אפשרות נוספת היא אולי ההפחתה גנומית שהתרחש ב הפקת dihaploid של tetraploid חסרי אללים ברישול וכתוצאה מכך מתח הצמח כולו, אשר גם הוכח לתרום EI מוגברות26. בכל זאת, זה מדגים שהחוקרים מדוקדקת חייב להעסיק בעת בחירת פקעות ורקמות שישמש עבור השוואה של ערכי EI, ובעיקר בין אחרים.
יישומים עתידיים
פרוטוקול המתוארות במאמר זה מספק חוקרים עם כלי חשוב עבור הבנה endoreduplication תפוחי אדמה. זה עשוי לאפשר ללימודי של מרכיבי גנטיים וסביבתיים endoreduplication, הזמן-הקורס ההתפתחות לאורך הרקמות פקעת, והערכה של וריאציה טבעי. בסופו של דבר, endoreduplication עלולה להפוך מטרה מבטיח לשיפור תפוחי אדמה, התחייבות אשר ידרשו אמצעי הערכה אמינה.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי הלאומית למדע קרן פרס מספר 1237969, "להתיר את Heterozygosity קומפוזיציה Allelic, וריאציה מס העתק של תפוחי אדמה", משרד החקלאות מיוחד גרנט 2014-34141-22266 (מאוניברסיטת Maine) על הקרוואן
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
- Wilson, E. The karyoplasmic ratio. 727, 3rd edn, The Macmillan Company. (1925).
- Szymanski, D. B., Marks, M. D. GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).
- Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).
- Grafi, G., Larkins, B. A. Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases. Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).
- Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication. Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2. Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth. Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).
- Cheniclet, C., et al. Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth. Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).
- Pirrello, J., et al. How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches. Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).
- Chevalier, C., et al. Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory. J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).
- Galbraith, D. W., et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).
- Doležel, J., Greilhuber, J., Suda, J. Flow Cytometry with Plants: An Overview. Flow Cytometry with Plant Cells. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 41-65 (2007).
- Doležel, J., Bartoš, J. A. N. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).
- Doke, N., Tomiyama, K. Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues. Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).
- Davis, D. A., Currier, W. W. The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts. Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).
- Laimbeer, F. P. E., et al. Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops. Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).
- Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination. Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).
- Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants. Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).
- Doke, N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity. Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).
- Doke, N., Tomiyama, K. Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans. Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).
- Saxena, P. K., King, J. Reuse of enzymes for isolation of protoplasts. Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).
- Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. Cytometry and flow cytometry of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants. Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).
- Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. Tissue and cell culture. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , Springer. 39-50 (2013).
- Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement. Advances in Cell Culture. Maramorosch, K. 1, Elsevier. 241-279 (1981).
- Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions. Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).
- Scholes, D. R., Paige, K. N. Plasticity in ploidy: a generalized response to stress. Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).
