Summary
O protocolo descrito neste documento é um método de medição Endoreduplicação dentro de tubérculos de batata (Solanum tuberosum). Ele inclui etapas de extração Plasmólise e protoplastos para diminuir o ruído e detritos na análise de cytometric do fluxo a jusante.
Abstract
Endoreduplicação, a replicação do genoma nuclear da célula sem citocinese subsequente, produz células com maior conteúdo de DNA e está associada com a especialização, o desenvolvimento e o aumento no tamanho celular. Em plantas, Endoreduplicação parece facilitar o crescimento e a expansão de certos tecidos e órgãos. Entre eles está o tubérculo da batata (Solanum tuberosum), que sofre considerável expansão celular no cumprimento de sua função de armazenamento de carboidratos. Assim, Endoreduplicação pode desempenhar um papel importante em como tubérculos são capazes de acomodar esta abundância de carbono. No entanto, os restos celulares resultantes de métodos de isolamento nuclear bruto de tubérculos, métodos que podem ser usados eficazmente com folhas, opõe-se a estimativa do índice de Endoreduplicação de tubérculos (EI). Este artigo apresenta uma técnica para avaliar o tubérculo Endoreduplicação através do isolamento de protoplastas, enquanto demonstrar resultados representativos obtidos de diferentes genótipos e compartimentada tecidos tubérculo. As principais limitações do protocolo são os custos de tempo e reagente necessários para a preparação da amostra, bem como a expectativa de vida relativamente curta das amostras após lise de protoplastas. Enquanto o protocolo é sensível às variações técnicas, representa uma melhoria sobre os métodos tradicionais de isolamento nuclear destas grandes células especializadas. Propõem-se as possibilidades de melhorias no protocolo como a reciclagem da enzima, o uso de fixadores e outras alterações.
Introduction
Endoreduplicação é o processo pelo qual uma célula renuncia o típico ciclo celular e em vez disso, passa por um curso alternativo de desenvolvimento consiste em repetidas rodadas de replicação do DNA sem divisão celular. A célula resultante vai ter maior DNA tamanho conteúdo e nuclear, que é pensado para jogar um papel no Regulamento celular, expansão e especialização. Geralmente, uma rodada de Endoreduplicação (denominado um endocycle) e o correspondente aumento no conteúdo de DNA estão associadas com maior volume de células, uma observação que precipitaram a "teoria karyoplasmic" que o aumento do conteúdo de DNA é necessário para corretamente Regule um maior, talvez mais complexo, célula1. Este fenômeno é comum em plantas superiores, tendo sido observadas em uma variedade de tecidos, incluindo aqueles com estrutural/defensiva (tricomas)2,3, nutritivo (endosperma de milho)4,5e (pia/armazenamento pericarpo de tomate; tubérculos de batata)6,7,8 funções. Na fruta, tem sido sugerido que Endoreduplicação desempenha um papel em facilitar a rápida expansão do pericarpo, como evidenciado pela relação negativa entre o período do desenvolvimento endorreduplicação e frutas9. Por exemplo, células com DNA conteúdo até 512C (512 vezes haploide genoma) têm sido observadas no pericarpo tomate8. Além disso Chevalier et al. (2014) demonstraram que alterações na expressão dos genes do ciclo celular podem levar a aumentos nos níveis de Endoreduplicação dentro do pericarpo, que então resulta em maior fruta10. Assim, alteração de genes promovendo Endoreduplicação fornece um alvo potencial para melhoria da biomassa ou rendimento através de melhoramento de plantas ou manipulação genética. No entanto, tal melhoria está subordinada a maior compreensão das causas e consequências da endorreduplicação.
Endoreduplicação é geralmente medida através de citometria de fluxo no qual núcleos, lançados em preparações de tecido cru11, são incubados com um fluoróforo DNA-ligando, como iodeto de propidium12 (PI). As amostras filtradas são passadas pelo laser de um citômetro de fluxo onde se podem observar comprimentos de onda de emissão específicos para o fluoróforo. A intensidade da fluorescência em cada evento (ou seja, núcleo) está diretamente correlacionada com o conteúdo de DNA da partícula. Assim, comparando-se com um padrão conhecido, o conteúdo relativo e absoluto do DNA de células em uma determinada amostra pode ser calculado. Índices de Endoreduplicação (EI) são determinados pelo que estabelece o número médio de endocycles por célula dentro de uma amostra, observando o conteúdo de DNA celular (valor C) onde 1C é o teor de DNA de uma célula haploide (fórmula apresentada na etapa 6.7 do protocolo). Por exemplo, em um organismo diploide, o conteúdo base do DNA de células somáticas é 2C. Se uma amostra tem poucas células com 4C, correspondente a um único círculo de Endoreduplicação, ou maior teria um EI perto de 0; no entanto se quase todas as células são 4C o EI seria aproximadamente 1. No entanto, como várias rodadas de Endoreduplicação são comuns em valores mais altos de EI observados de plantas podem ser muito maiores. Ao calcular os índices de Endoreduplicação podem ser relativamente simples, requer que abundâncias relativas dos núcleos C-valores confiantemente ser apurada, que não esteja autorizada em determinadas espécies e tecidos (incluindo tubérculos de batata). É provável que diferenças no celular anatomia, química ou parede celular composição13 causam estas amostras ser recalcitrante às preparações típicas usando uma lâmina de barbear para liberar os núcleos diretamente em buffers adequados que são comumente usados com tecidos como o pericarpo de tomate, um modelo para Endoreduplicação estudos8.
Batata, o exame de Endoreduplicação dentro do tubérculo permanece limitado a apenas alguns estudos, talvez devidos em parte à falta de um protocolo confiável como os preparativos brutos acima mencionados produzem resultados inconsistentes. Enquanto tais abordagens funcionam bem para as amostras de tubérculo experimentam grave degradação e uma abundância de ruído sob a forma de detritos, tornando a diferenciação dos picos composto de núcleos com diferentes valores de C quase impossíveis de folhas. Isto é talvez devido a diferenças na composição celular e uma profusão de restos celulares dentro das células do tubérculo (EG. amiloplastos armazenam amido). Para superar este obstáculo, recentemente desenvolvemos um protocolo mais confiável para a aquisição de picos distinguíveis em citometria de fluxo de tubérculos de batata. A frequência de células dentro de cada pico pode ser usada para calcular os níveis de Endoreduplicação precisos para diferentes genótipos ou diferentes tecidos que compõem um tubérculo. O protocolo, que emprega um antecedente de15 de14,de método extração protoplastos modificado descrito anteriormente fluxo cytometry11, mostrou uma variação considerável dentro de parentes de batata, cultivares e tecidos16 . Aqui nós apresentamos o protocolo em detalhe, avaliando EI nos contextos de ploidia, tecido e tamanho do tubérculo.
Protocol
Nota: É importante incluir controlos adequados, geralmente sob a forma de tecido foliar da mesma ploidia como amostras experimentais. Isso ocorre porque o pico de 2C de amostras de tubérculos pode ser pequeno e difícil de identificar.
1. preparações
Nota: As soluções listadas aqui podem ser preparadas antes do tempo e armazenadas a 4 ° C, mas aqueles apresentados em etapas subsequentes devem ser feitas frescos no dia do uso.
- Fazer um volume adequado de solução de incubação Plasmólise (PIS) (15 mL/amostra): 0,55 M manitol, 2 mM CaCl2, 1mm KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50mm Tris tampão pH 7,5 (ajustado com HCl).
- Fazer um volume adequado de solução de lavagem de Plasmólise (PWS) (15 mL/amostra) que é idêntico ao PIS, exceto para a adição de manitol 0,71 M.
- Fazer 250 mL de fluxo Cytometry Buffer11 (FCB de Galbraith modificada): citrato de sódio 13,6 mM (trissódico), ESPANADORES de 8 mM, 18 mM MgCl2, 0,4% v/v X-100 Triton. Mexa pelo menos 30 min distribuir o Triton X-100.
- Filtro de esterilizar soluções PIS e PWS com um filtro de polietersulfona assimétrica (aPES) de 0,22 µm. Use unidades de filtração conduzido vácuo.
-
Prepare-se 106 µm de malha filtros para protoplastas lisados. Prepare-se 1,5 mL microcentrifuge tubos, que podem ser aninhados diretamente nos tubos de coleta, porém pode ser utilizado qualquer método de suspensões de passagem um filtro 106 µm.
Nota: Estas não precisa ser estéril.- Se usar tubos de microcentrifuga de 1,5 mL, corte a ponta de 1 cm cada tubo microcentrifuga. Usando uma placa quente ou outro calor de fonte de calor um 1cm2 pedaço 106 µm aço malha em um pedaço de papel alumínio. Pressione o corte final do tubo dentro da malha até eles se fundiram.
- Lave batatas a amostrar, removendo todos os solo e detritos.
Nota: Idade e tamanho do tubérculo devem ser apropriados para os objetivos do experimento, mas não parece afetar a qualidade dos resultados. Estamos bem sucedida deste protocolo para tubérculos têm sido em armazenamento frio (4 ° C, 95% RH) até 8 meses. Enquanto tubérculos com defeitos (por exemplo, tubérculo fim rot, coração vazado, áreas de necrose marrons) podem ser responsivos, eles devem ser evitados, se possível.
2. dia 1: Plasmolyze tecido tubérculo
Nota: Amostras de folha de controle podem ser incluídas aqui para produzir protoplastas ou no passo 5.2 se bruto preparações são preferidas. Isso deve ser realizada com ferramentas estéril em um ambiente asséptico como um capuz de fluxo laminar.
- Superfície de esterilizar os tubérculos de batata através de imersão em etanol a 75% pelo menos 5 min.
- Remover os tubérculos de etanol e ar seco. Isso geralmente leva ~ 5 min, mais tempo se o tubérculo é maior do que 100 g.
- Preparar e rótulo esterilizado cónico tubos de 50 mL para cada amostra e alíquota 15 mL de filtro esterilizado PIS em cada um.
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Amostra de aproximadamente 1 cm3 do tecido desejado de tubérculos esterilizados usando Bisturi esterilizado ou broca de cortiça.
Nota: Dependendo do tecido a ser amostrado um pode usar uma broca de cortiça esterilizado ou faca/bisturi. Por exemplo, se a medula é desejada a broca de cortiça pode ser usada para levar um núcleo da apical a extremidade distal do tubérculo e a fração central do núcleo pode ser saboreada. No entanto, devido a morfologia interna assimétrica de tubérculos de batata, pode ser mais preciso ao parênquima amostra ou córtex por reduzir para metade o tubérculo e excisão do tecido desejado. Veja a Figura 1 para uma representação da morfologia interna do tubérculo.- Pique o tecido usando um bisturi esterilizado em aproximadamente 3 mm3 peças e tecido de transferência para o tubo cônico contendo PIS. Incubar durante uma noite a 4 ° C.
Nota: Este é para maximizar a área de superfície para que o PIS, e mais tarde, a solução de enzima, totalmente pode permear o tecido resultando em uma digestão mais completa.
- Pique o tecido usando um bisturi esterilizado em aproximadamente 3 mm3 peças e tecido de transferência para o tubo cônico contendo PIS. Incubar durante uma noite a 4 ° C.
Figura 1: morfologia interna de um tubérculo de batata. A separação entre medula (P) e parênquima perimedullary (PM) é ilustrada com linhas pretas. O anel vascular, que separa o córtex (C) parênquima é indicado com uma seta preta. A fim de estolhos (S) e tubérculo os olhos (E) são rotulados também. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. dia 2: Gerar protoplastas de batata
Nota: Isso deve ser realizada com ferramentas estéril em um ambiente asséptico como um capuz de fluxo laminar.
- Preparar e filtro (filtro de macacos de 0,45 µm) uma quantidade adequada de solução de enzima (ES) (10 mL/amostra): 0, 71m manitol 3 mM CaCl2, 1mm KH2PO4, 1 mM MgCl2, celulase Onozuka R-10 de 4%, 0,8% macerozyme R-10, hemicululase 1%, 10 tampão MES mM, pH 5,8. Certifique-se de que os filtros apropriados são usados nesta etapa; filtros com poros de tamanho menor do que 0,45 µm são propensos ao entupimento, Considerando que uma membrana de ligação de baixa proteína, tais como macacos, minimiza a perda da enzima durante a filtração.
- Aspire fora PIS de amostras em tubos cónicos usando uma pipeta estéril e serológica.
- Adicionar 10 mL de ES para cada amostra e inverta 2 – 3 vezes.
- Incube as amostras durante a noite a 29 ° C, com agitação horizontal de 180 rpm. Incube as amostras pelo menos 16 h.
4. dia 3: Protoplastas de colheita e lavagem protoplastas
Nota: Condições assépticas são não há tempo necessárias neste momento.
- Retire amostras do agitador e permitir que se contentar com ~ 10 min.
-
Aspire fora tanto da solução ES quanto possível.
- Retire o máximo da solução ES como viável com uma pipeta sorológica, tendo o cuidado de evitar a remoção do tecido digerido.
- Utilizando uma micropipeta remove qualquer solução ES restante, evitando novamente o tecido digerido. Isso é feito facilmente, segurando o tubo em ângulo para que a solução do ES flui em direção a tampa enquanto o tecido digerido permanece no fundo.
- Adicionar 15 mL de PWS para cada amostra e inverter suavemente 2 – 3 vezes. Permitir que os protoplastas de se contentar em 10 min.
- Remova o PWS com uma pipeta sorológica. Use uma micropipeta para remover qualquer líquido restante.
Nota: Este passo é absolutamente crítico para garantir a integridade dos núcleos amostra durante a citometria de fluxo. Na resolução de problemas, esta etapa foi encontrada para ser a fonte mais provável de falha em uma amostra.
5. dia 3: Preparar amostras para citometria de fluxo
Nota: As amostras devem ser mantidas no gelo daqui a menos que indicado o contrário.
- Prepare-se iodeto de propidium (0,4 mg propidium iodeto/mL FCB) e soluções de RNase (0,8 mg RNase A / mL FCB) pela dissolução de cada um na FCB.
Cuidado: Iodeto de Propidium é altamente tóxico. Evite o contacto com a pele ou olhos. Use os EPI adequado. -
Adicione 1,5 mL de gelo frio FCB para cada amostra. Brevemente shake ou vórtice cada amostra romper agregados tecido. É importante separar as touceiras de tecido tubérculo para que o FCB totalmente possam permear as células e liberar os núcleos. Amostras diferentes podem exigir mais ou menos agitação dependendo do tecido e genótipo.
Nota: O FCB lise os protoplastas, liberando os núcleos. Daí a necessidade de manter amostras no gelo para evitar a degradação.- Se amostras de citometria de fluxo de controle não foram incluídas na etapa de geração de protoplastos eles poderá ser aqui incluídos. Se um controle é adicionado, pique uma folha pequena (~ 3 cm2) em 1,5 mL de gelo frio FCB usando uma lâmina de barbear. Amostras de controlo devem ser a mesma ploidia como as amostras experimentais, de preferência o mesmo genótipo. In vitro de plântulas tendem a dar picos mais limpos do que a estufa ou as plantas cultivadas de campo.
-
Passe 1 mL de suspensão de FCB/tecido através de um filtro de malha de 106 µm. Use um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL com a ponta cortada e malha de metal derretido ao fundo, conforme descrito na etapa 1.5.1. Este tubo microcentrifuga pode ser aninhado diretamente em um tubo de microcentrifugadora de 2 mL e a amostra passou diretamente. Se utilizar outro método de filtração, o filtrado pode ser coletado em uma placa de Petri gelada e então transferido para um tubo de 2 mL.
Nota: às vezes os restantes agregados e restos celulares podem entupir o filtro de rede. Neste caso, basta tocar os dois tubos de microcentrifuga aninhados algumas vezes para desalojar os detritos. - Adicione 250 µ l da solução de RNase para cada amostra. Inverter e incube por 30 min à temperatura ambiente (RT).
Nota: Esta etapa destina-se a retirar as amostras, levando a menos ruído durante a citometria de fluxo do RNA. No entanto, como os núcleos são de curta duração, os pesquisadores podem decidir diminuir o tempo de incubação ou executá-lo no gelo, se eles estão enfrentando grave deterioração de suas amostras. - Adicione 125 µ l da solução de iodeto de propidium para cada amostra. Inverter e incubar no gelo por 30 min.
Nota: As amostras devem ser usadas por citometria de fluxo mais rápido possível, como degradação é aparente até 2 horas, mesmo no gelo.
6. dia 3: Citometria de fluxo dos núcleos de tubérculos de batata
Nota: O software e operação de citômetro de fluxo irão variar dependendo do instrumento e do fabricante. Instruções detalhadas sobre a operação específica do citômetro de fluxo serão fornecidas no guia do usuário do instrumento.
- Crie dois lotes do ponto usando a escala logarítmica de dispersão direta versus dispersão de lado e propidium iodeto (PI) vs lado scatter. Também crie um histograma com PI no eixo x. Escala logarítmica é necessário para garantir que todos os eventos estão dentro da escala como núcleos podem diferir consideravelmente em fluorescência.
-
Carregar um tubo de amostra de controle conhecidas e ajustar a tensão para que todos os eventos estão em escala. Usamos tecido de folha in-vitro de um genótipo de amostra. Se as amostras de diferentes ploidies são para ser executado, uma amostra de controle para cada um deve ser incluída.
- Anote o canal do pico 2C na amostra controle. Os picos de 2C das amostras experimentais devem cair no mesmo local.
- Carregar uma amostra experimental (tubérculo) e novamente certifique-se de que todos os eventos estão em escala. Se ajustes são necessários, repita o passo 6.2 para identificar o canal de 2C picos.
- Portão manualmente os núcleos de protoplastos usando o lado de dispersão de vs PI.
- Defina o histograma de PI para mostrar apenas a região de núcleos de protoplastos fechado.
- Colete o número desejado de eventos de cada amostra. Pesquisadores usam frequentemente 10.000 eventos fechados por citometria de fluxo; no entanto, usamos 2.000 eventos para amostras de protoplastos tubérculo para acomodar mais amostras e amostras com baixas concentrações.
- Calcule EI do cada amostra dos histogramas de PI usando a seguinte fórmula:
EI =
onde 4C é a porcentagem de núcleos que são 4C (representando uma única rodada de Endoreduplicação), 8C é a percentagem que são 8C e assim por diante. Consulte a Figura 4 para exemplos de histogramas e valores de C dos picos.
Representative Results
Produção de protoplastas
A geração de protoplastas é necessária para alcançar resultados de citometria de fluxo repetível de tubérculos de batata, a morfologia geral do que é exibida na Figura 1. Pesquisadores podem desejar garantir protoplastas de alta qualidade que tenham sido produzidos antes da adição do FCP, especialmente caso a solução de problemas é necessária. A maioria dos protoplastas deve ser esférica com saliências mínimas (Figura 2) e pode diferir consideravelmente em tamanho, que é talvez o reflexo das diferenças no EI.
Figura 2: representante protoplastas de folha e tubérculo adquiridos no passo 4.4 do protocolo. Protoplastas isolados devem ser esférica e simétrica com membrana plasmática intacta. Observe a diferença de tamanho entre folhas (A-C) e protoplastas de tubérculos (D, E), bem como as diferenças de tamanho dentro de um tecido que pode indicar diferentes níveis de Endoreduplicação. Protoplastas de folha contêm cloroplastos, enquanto que amiloplastos são visíveis dentro do protoplastas do tubérculo. Escala de barras = 1.000 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Avaliação dos resultados de citometria de fluxo
O sucesso ou fracasso de um experimento pode ser medido pela largura dos picos e sua separação nos histogramas de citometria de fluxo. Como medição Endoreduplicação requer o cálculo a abundância relativa dos núcleos em cada pico, mera presença ou ausência de picos é insuficiente se houver muito barulho para traçar limites significativos entre eles. A Figura 3 exibe a variação nos resultados, os pesquisadores podem ocorrer em ambos os gráficos de dispersão de citometria de fluxo e histogramas. Possíveis causas para falhadas amostras são apresentadas no âmbito da discussão.
Figura 3: resultados representativos obtidos de citometria de fluxo de núcleos de protoplastos de intacto e degradado amostras de medula. Núcleos intactos (A) mostram limpa separação entre picos para quantificar a abundância relativa de células em cada usando o software apropriado Considerando que picos em amostras degradadas (B) mostram bases deslocadas, ampla e sobrepostas. O scatterplots de intacto (C) e degradadas (D) amostras, caixas-pretas indicam evento nuclear gating para histogramas e o agrupamento de eventos é reflectido na largura dos picos do histograma. Eventos fora dos portões indicam os restos, núcleos severamente degradados ou outros agregados. PI-H corresponde à intensidade da fluorescência, que é medida em unidades arbitrárias. Métodos de solução de problemas para prevenir a degradação da amostra são discutidos dentro do texto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Endoreduplicação diferenças entre os tecidos
Anteriormente nós relatou que o tecido de medula tubérculo tem níveis significativamente maiores de Endoreduplicação que córtex tecido16. Para confirmar e expandir sobre isso nós olhamos Endoreduplicação níveis de três diferentes tecidos em CV Superior: miolo, parênquima perimedullary e córtex, replicado em triplicado com 2.000 eventos fechados, por exemplo. Nossos resultados confirmaram nossa observação anterior de que o tecido da medula tem EI significativamente maior do que o tecido cortical com meios de 1,79 e 1.12 endocycles por célula, respectivamente (p = 0,018; Teste t de Student-). Surpreendentemente, o tecido do parênquima demonstrou um perfil semelhante ao córtex e também foi significativamente diferente do tecido da medula (quer dizer = 1.14; p = 0,013; Teste t de Student-). Esses resultados estão resumidos na Figura 4.
Figura 4: Endoreduplicação em três tecidos de CV Superior. Histogramas de folha (A), córtex tubérculo (B), parênquima (C) e tecidos de medula (D) são mostradas juntamente com o valor EI, calculado a partir desses histogramas. Diferenças na abundância relativa dos núcleos compreendendo cada pico são aparentes, especialmente entre os tecidos folha e tubérculo. C-valores para cada pico também são exibidos. PI-H corresponde à intensidade da fluorescência, que é medida em unidades arbitrárias. Quer dizer comparações do EI dos tecidos de tubérculos são exibidas e onde o asterisco indica diferença significativa (p < 0,05) e barras de erro mostram o desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Influência do tamanho do tubérculo e ploidia
Anteriormente, informou que, para um determinado genótipo, tubérculos de tamanho diferente, mas semelhante maturidade não exibir uma diferença correspondente em El16. Objetivo confirmar este resultado, bem como avaliar a relação entre a ploidia e Endoreduplicação. Para este experimento, usamos três repetições de tecido do parênquima do três genótipos diferentes: CV Superior (4x), VT_SUP_19 (2x) que é um dihaploid extraído CV Superior por prickle polinização17e VT_SUP_19 x 4, que é um duplicado dihaploid 18 isogénicas de VT_SUP_19. Incluímos um conjunto de réplicas para grande (90 – 130 g) e pequeno (< 35 g) tubérculos para CV Superior enquanto tubérculos para os outros dois genótipos foram 90 – 130 g. Os tubérculos foram todas colhidas da estufa plantas crescidas na maturidade plena, ou seja, os topos das plantas tinham senesced. Observamos uma diferença significativa entre o VT_SUP_19 e seu progenitor Superior (p = 0,04); no entanto, não houve significativa diferença entre VT_SUP_19 e VT_SUP_19 x 4 (p = 0,69). Isto indica que enquanto há um provável componente genético para Endoreduplicação, como desmascarada pela redução genômica, não é ditada pela ploidia, pelo menos neste plano. Por último, mais uma vez observamos sem diferenças significativas entre CV de grandes e pequenos tubérculos Superior conforme demonstrado na Figura 5.
Figura 5: Endoreduplicação em dois tamanhos de tubérculos da CV Superior diploides (VT_Sup_19) e tetraploide (VT_Sup_19 x 4) derivados. O gráfico de barras mostra a média para os pequenos (< 35 g) e tubérculos superiores do grande (90 – 130 g) CV, bem como os tubérculos grandes (90 – 130 g) do dihaploid VT_SUP_19 e o dihaploid duplicou isogénicas VT_SUP_19 x 4. Diferenças significativas (p < 0,05) são indicados pelo relatório de carta de conexão. Barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo apresentado neste documento fornece a pesquisadores com um meio de avaliar Endoreduplicação dentro de tubérculos de batata, cujo celular modificado conteúdo e maior tamanho de pilha aparentemente impedem outras preparações de citometria de fluxo. O protocolo depende de geração de protoplastos como um meio para reduzir o ruído e os restos, mantendo a integridade nuclear. Anteriormente, pesquisadores têm descrito preparações semelhantes para amostras de citometria de fluxo particularmente recalcitrantes, bem como utilizado protoplastas de tubérculos para estudar uma variedade de tópicos como patogênese19,20. No entanto, a nosso conhecimento, nenhum ter combinado o uso de tais protoplastas de tubérculos com citometria de fluxo, com a finalidade de estudar Endoreduplicação. Além disso, encontramos o uso de protoplastas ser mais confiável do que preparações brutas típicas, bem como a técnica utilizada nas duas só outros estudos para avaliar o tubérculo Endoreduplicação6,7. Aqui vamos discutir as deficiências do protocolo, possíveis armadilhas em sua preparação execução e amostra e os resultados de um experimento típico que emprega-lo.
Apesar da utilidade e repetibilidade do protocolo de citometria de fluxo de tubérculo, ele tem alguns pontos fracos que devem ser discutidos. Para começar, o protocolo é intensivo, exigindo dois incubação durante a noite do tempo. Além disso, o protocolo exige alguns reagentes caros, particularmente a celulase e macerozyme. Além disso, as preparações são altamente sensíveis ao tempo, degradante, dentro de algumas horas, o que podem limitar a taxa de transferência dentro de um único dia, especialmente se muitos eventos são desejados. Por último, o protocolo, enquanto confiável, é sensível a erros dentro de preparação da amostra, todos os quais parecem resultar em danos para os núcleos e resultados de qualidade inferiores. Por exemplo, a contaminação microbiana pode ocorrer durante as Plasmólise e protoplastos geração passos (1 – 3.4) devido a uma técnica asséptica inadequada. Contaminação da amostra, embora nem sempre, impedindo o sucesso de uma amostra, parece diminuir drasticamente a qualidade de histogramas obtidas, mais uma vez como devido a danos para os núcleos.
Como foi referido anteriormente, as principais desvantagens do protocolo são os custos, tempo e sensibilidade a erros. Pesquisadores podem desejar tomar medidas para mitigar a cada um deles. Quanto ao custo, pesquisadores com a intenção de aplicar o protocolo para muitas amostras podem considerar modificar as concentrações de enzima e/ou duração da etapa de digestão como tecidos diferentes e genótipos podem variar em capacidade de resposta. Isso inclui a possibilidade de filtragem e reciclagem do ES que foi demonstrado anteriormente mas não empregado aqui21. Quanto tempo, em nossa observação, é possível dispensar a primeira incubação (etapa Plasmólise) e ainda extrair protoplastas; no entanto, sua integridade e abundância vão sofrer, que impacta negativamente os resultados. Para reduzir a deterioração de amostras pesquisadores podem considerar que algumas abordagens de citometria de fluxo envolvem o uso de fixadores (por exemplo, formaldeído) para preservar a integridade de amostra22. Isto pode ser um meio útil para prevenir deterioração e permitir a amostra armazenamento ao invés de protoplastos exaction e fluxo cytometry ocorrendo no mesmo dia, tal como apresentado. Outro meio de evitar o atrito dos núcleos pode ser para incluir um inibidor de nuclease para o ES e/ou FBC; enquanto o 2-Mercaptoetanol não efectuada nenhuma alteração perceptível durante o desenvolvimento, outros inibidores não foram testados neste documento.
Em nossa observação, o passo mais crítico é passo 4.4, a remoção da solução de lavagem Plasmólise todos antes da adição do buffer de citometria de fluxo (FCB). Se até mesmo um pequeno volume (< 10 µ l) permanece, as amostras são muito mais propensas a ser degradada, que pode levar a uma amostra de pobre ou mesmo falha. Isto é provavelmente devido a impurezas dentro da solução de enzima (por exemplo, nucleases, proteases)23,24 , que rapidamente degradar os núcleos durante os períodos de incubação e o tempo entre as execuções de amostra, mesmo em baixas concentrações. Outra consideração importante é a duração das etapas de incubação a PI e RNase. Como observado no protocolo, as amostras não permanecem estáveis por mais de algumas horas após a adição da FCB para que pesquisadores podem decidir reduzir a duração dessas etapas para acomodar mais amostras ou citometria de fluxo longo execução resultantes de núcleos de baixos concentrações. Isso também requer o pesquisador a considerar a relação entre o número de eventos por amostra e o número total de amostras a ser executado ou considere o uso de fixadores como mencionado anteriormente.
Diferenças entre genótipos e tecidos
Para fornecer o representante de resultados do protocolo desenhamos dois experimentos simples para confirmar a variação anteriormente relatada pelo tecido e examinar a influência da ploidia e genótipo. Os resultados do experimento tecido demonstram que o protocolo produz resultados reprodutíveis, como tecido de medula mais uma vez foi encontrado para ter o maior EI. Surpreendentemente tecido do parênquima, que anteriormente não foram avaliado, tinha um valor EI semelhante ao tecido cortical e significativamente mais baixo do que o miolo. Isto foi inesperado como células do parênquima são tipicamente maiores do que a medula ou células corticais, pelo menos na maturidade. Uma possível explicação é que os tubérculos (90 – 130 g) eram muito imaturos para as células de parênquima, que compõem a maioria do volume do tubérculo, a maturidade, totalmente expandido e chegou a sua máxima C-valores25. Isso também pode explicar por que o dihaploid (VT_SUP_19) e o dihaploid duplicado (VT_SUP_19 x 4) demonstrou EI significativamente maior do que os tubérculos Superior CV; enquanto tubérculos aproximadamente de igual tamanho foram amostrados de cada genótipo, o tamanho máximo de tubérculos de VT_SUP_19 ou o isogénicas tetraploide é muito menor do que o progenitor. Assim, pode ser que eles exibidos EI maior simplesmente porque eles foram maiores em relação ao seu tamanho máximo atingível. Como alternativa, a diferença pode ser uma consequência do complemento genético que vt_sup_19 recebeu do seu progenitor tetraploide. Outra possibilidade é que a redução de genômica que ocorreu na extração da dihaploid a partir do tetraploide pode ter desmascarado alelos deletérios, resultando em estresse de toda a planta, que também foi mostrado para contribuir para elevados El26. No entanto, isto demonstra que os pesquisadores de cuidadosa consideração devem empregar ao selecionar tubérculos e tecidos para ser usado para comparação dos valores EI, especialmente entre genótipos.
Aplicações futuras
O protocolo descrito neste artigo fornece pesquisadores com uma importante ferramenta para compreensão Endoreduplicação na batata. Isso pode permitir de estudos para os componentes genéticos e ambientais de Endoreduplicação, o tempo-curso de desenvolvimento através de tecidos do tubérculo e avaliação da variação natural. Em última análise, Endoreduplicação pode fazer um alvo promissor para melhoria de batata, uma empresa que vai exigir um meio confiável de avaliação.
Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pela National Science Foundation Award número 1237969, "Desvendando a heterozigosidade, composição alélica e variação número de cópia de batata" e USDA especial Grant 2014-34141-22266 (Universidade de Maine) trailer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
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