Summary
البروتوكول الموضحة هنا طريقة لقياس اندوريدوبليكيشن داخل درنات البطاطس (البطاطا). أنه يتضمن خطوات استخراج بلاسموليسيس وجبلة مجردة لتقليل الضوضاء والحطام في تحليل سيتوميتريك تدفق المتلقين للمعلومات.
Abstract
الخلايا التي تحتوي على محتوى الحمض النووي زيادة غلة اندوريدوبليكيشن، النسخ المتماثل من الجينوم لخلية النووي دون cytokinesis اللاحقة، ويرتبط بالتخصص وتنمية وزيادة في حجم الخلايا. ويبدو اندوريدوبليكيشن في النباتات، لتسهيل النمو والتوسع في بعض الأنسجة والأعضاء. ومن درنة البطاطس (البطاطا)، الذي يخضع لتوسيع الخلوية كبير في أداء وظيفتها المتمثلة في تخزين الكربوهيدرات. وهكذا، اندوريدوبليكيشن قد تلعب دوراً هاما في كيفية الدرنات تكون قادرة على استيعاب هذه الوفرة من الكربون. ومع ذلك، الحطام الخلوية الناتجة عن أساليب العزلة النووية الخام من الدرنات، الأساليب التي يمكن استخدامها بفعالية مع الأوراق، ويمنع تقدير مؤشر اندوريدوبليكيشن الدرنات (الصناعات الاستخراجية). تعرض هذه المقالة تقنية لتقييم اندوريدوبليكيشن الدرنات عن طريق عزل بروتوبلاستس بينما إثبات النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من مختلف الأنماط الجينية ومجزأة أنسجة الدرنات. وهي القيود الرئيسية للبروتوكول تكاليف الوقت وكاشف المطلوبة لإعداد عينة فضلا عن عمر قصيرة نسبيا من العينات بعد تحلل بروتوبلاستس. في حين البروتوكول حساسة للتغير التقني، فإنه يمثل تحسنا مقارنة الأساليب التقليدية للعزلة النووية من هذه الخلايا المتخصصة الكبيرة. ويقترح إمكانيات إجراء تحسينات في البروتوكول مثل إعادة تدوير الإنزيم واستخدام المصفف وتغييرات أخرى.
Introduction
اندوريدوبليكيشن هي العملية التي خلية فورجويس دورة الخلية النموذجية، ويخضع بالطبع بديلة للتنمية تتكون من جولات متكررة من تكرار الحمض النووي دون الخلوية شعبة بدلاً من ذلك. الخلية الناتجة ستكون قد زادت الحمض النووي حجم المحتوى والنووية التي يعتقد أن تلعب دوراً في التنظيم الخلوية، والتوسع، والتخصص. وبوجه عام، جولة من اندوريدوبليكيشن (يطلق عليها اندوسيكلي)، وما يقابل ذلك من الزيادة في محتوى الحمض النووي المرتبطة بالزيادة في حجم الخلية، ملاحظة أن عجلت "نظرية كاريوبلاسميك" أن زيادة محتوى الحمض النووي مطلوب بشكل صحيح تنظيم أكبر، ربما كانت أكثر تعقيداً، الخلية1. هذه الظاهرة شائعة في النباتات العليا، وقد لوحظت في مجموعة من الأنسجة بما في ذلك مع الهيكلية/الدفاعية (trichomes)2،3، التغذوية (السويداء الذرة)4،5، و (الحوض/التخزين أهمية الطماطم؛ درنة البطاطا)6،،من78 وظائف. في الفاكهة، واقترح أن اندوريدوبليكيشن تلعب دوراً في تيسير التوسع السريع للقشرة كما يتضح من العلاقة السلبية بين اندوريدوبليكيشن والفواكه الإنمائية الفترة9. فعلى سبيل المثال الخلايا مع الحمض النووي محتوى ما يصل إلى 512 ج (512 مرات الجينوم فرداني) قد لوحظت في أهمية الطماطم8. علاوة على ذلك وسام et al. (2014) أظهرت أن التغيرات في التعبير عن الجينات دورة الخلية يمكن أن يؤدي إلى زيادات في مستويات اندوريدوبليكيشن داخل القشرة التي ينتج الفاكهة أكبر10ثم. وهكذا، يقدم تحوير الجينات تعزيز اندوريدوبليكيشن هدفا محتملاً للتحسين من الكتلة الحيوية أو العائد من خلال تربية النباتات أو التلاعب بالجينات. هذا التحسين غير مرهونة بمزيد من الفهم لأسباب وعواقب اندوريدوبليكيشن.
يتم قياس اندوريدوبليكيشن في أغلب الأحيان عن طريق التدفق الخلوي حيث يتم المحتضنة النوى، أفرج عنه في الأعمال التحضيرية النسيج الخام11، مع فلوروفوري الحمض النووي ملزمة، مثل يوديد propidium12 (PI). ثم يتم تمرير العينات التي تم تصفيتها بالليزر من سيتوميتير تدفق حيث يمكن ملاحظة الانبعاثات أطوال موجية محددة فلوروفوري. كثافة الأسفار في كل حدث (أي نواة) ارتباطاً مباشرا مع الحمض النووي--محتوى الجسيمات. وهكذا، عن طريق مقارنة بمعيار معروف، قد يكون حساب محتوى الحمض النووي المطلقة والنسبية للخلايا في نموذج معين. اندوريدوبليكيشن الأرقام القياسية (الصناعات الاستخراجية) تتحدد بتحديد متوسط عدد اندوسيكليس كل خلية داخل عينة بمراقبة محتوى الحمض الخلوي (ج-القيمة) حيث ج 1 هو محتوى الحمض النووي لخلية فرداني (الصيغة المعروضة في الخطوة 6.7 من البروتوكول). على سبيل المثال، هو قاعدة محتوى الحمض النووي للخلايا الجسدية في كائن مثنوية، جيم 2 إذا كان قد عينة الخلايا القليلة مع ج 4، المقابلة لجولة واحدة من اندوريدوبليكيشن، أو أكبر سيكون الصناعات الاستخراجية القرب من 0؛ لكن إذا ما يقرب من جميع الخلايا ج 4 الصناعات الاستخراجية سيكون حوالي 1. ومع ذلك، كما جولات متعددة من اندوريدوبليكيشن شائعة في النباتات لوحظت أعلى الصناعات الاستخراجية القيم قد تكون أكبر بكثير. أثناء حساب الأرقام القياسية اندوريدوبليكيشن قد يكون بسيط نسبيا، فإنه يقتضي أن وفرة نسبية من نويات ج-قيم موثوق تأكدت، التي تنتفي في بعض الأنواع والأنسجة (بما في ذلك درنات البطاطا). ومن المرجح أن تؤدي الاختلافات في تكوين التشريح، والكيمياء أو خلية جدار خلوي13 هذه العينات أن المعاندة في الأعمال التحضيرية النموذجية باستخدام شفرة حلاقة للإفراج عن الأنوية مباشرة إلى مخازن المناسبة المستخدمة بشكل شائع مع الأنسجة، مثل أهمية الطماطم والدراسات نموذجا اندوريدوبليكيشن8.
في البطاطا، لا يزال النظر في اندوريدوبليكيشن داخل الدرنة تقتصر على بضع دراسات، وربما كان يرجع جزئيا إلى عدم وجود بروتوكول يمكن الاعتماد عليها كما الاستعدادات الخام المذكورة تسفر عن نتائج غير متناسقة. في حين أن مثل هذا النهج تعمل بشكل جيد يترك تجربة العينات درنة التدهور الشديد ووفرة من الضوضاء في نموذج الحطام، مما يجعل التفريق بين قمم تتألف من نواة مع اختلاف القيم ج يكاد يكون من المستحيل. ولعل هذا سبب الاختلافات في التركيب الخلوي ووفرة من الحطام الخلوية داخل الخلايا درنة (على سبيل المثال-تخزين النشاء amyloplasts). للتغلب على هذه العقبة، وضعنا مؤخرا بروتوكولا أكثر موثوقية للحصول على قمم يمكن تمييزها في التدفق الخلوي لدرنات البطاطا. ثم يمكن استخدام تردد الخلايا داخل كل ذروة لحساب مستويات اندوريدوبليكيشن دقيقة لمختلف الأنماط الجينية أو الأنسجة المختلفة التي تتألف منها درنة. البروتوكول الذي يستخدم أسلوب استخراج معدلة جبلة مجردة سابقة15 14،الموصوفة سابقا التدفق الخلوي11، أظهرت تباينا كبيرا داخل الأقارب البطاطا، والأصناف، والأنسجة16 . هنا نقدم البروتوكول بالتفصيل عن طريق تقييم الصناعات الاستخراجية في سياقات ploidy، الأنسجة، وحجم الدرنات.
Protocol
ملاحظة: من المهم لتشمل الضوابط المناسبة، عادة في شكل أنسجة نبات ploidy نفسه كنماذج تجريبية. وهذا لأنه قد يكون ذروة ج 2 من عينات درنة صغيرة ويصعب تحديد.
1-الأعمال التحضيرية
ملاحظة: الحلول المدرجة هنا قد أعد قبل الوقت المحدد وتخزينها في 4 درجات مئوية لكن تلك التي قدمت في الخطوات اللاحقة يجب أن الطازجة في يوم الاستخدام.
- جعل وحدة تخزين مناسبة لحل حضانة Plasmolysis (PIS) (15 مل في عينة): المانيتول 0.55 م، كاكل 2 مم2، 1 مم خ2ص4، 1 مم مجكل2، 50 مم تريس المخزن المؤقت pH 7.5 (المعدل مع HCl).
- جعل وحدة تخزين مناسبة للحل أغسل Plasmolysis (PWS) (15 مل في عينة) وهو مطابق لحزب القانون والعدالة باستثناء إضافة المانيتول 0.71 متر.
- جعل 250 مل من تعديل غالبريث التدفق الخلوي العازلة11 (FCB): 13.6 ملم سترات الصوديوم (الصوديوم)، والمماسح 8 مم، 18 مم مجكل2، 0.4% v/v X-100 تريتون. إثارة لمالا يقل عن 30 دقيقة لتوزيع X-100 تريتون.
- فلتر تعقيم الحلول PIS و PWS مع عامل تصفية بولييثيرسولفوني غير المتناظر (القرود) 0.22 ميكرومتر. استخدام وحدات الترشيح مدفوعة فراغ.
-
إعداد ميكرومتر 106 مش مرشحات لتفكيك بروتوبلاستس. إعداد 1.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي التي يمكن أن تتداخل مباشرة إلى أنابيب جمع، ولكن يمكن استخدام أي طريقة لتمرير المعلقات من خلال عامل تصفية 106 ميكرومتر.
ملاحظة: هذه لا تحتاج إلى أن تكون عقيمة.- في حالة استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، قطع 1 سم من الطرف كل أنبوبة ميكروسينتريفوجي. باستخدام لوحة الساخن أو الحرارة مصدر الحرارة الأخرى مش 1 سم2 قطعة 106 ميكرومتر الصلب على قطعة من رقائق الألومنيوم. اضغط قطع نهاية الأنبوب إلى الشبكة حتى أنهم قد تنصهر فيها.
- تغسل البطاطس أخذ عينات، إزالة جميع التربة والحطام.
ملاحظة: حجم الدرنات والعمر ينبغي أن تكون مناسبة لأهداف التجربة ولكن لا يبدو أن تؤثر على نوعية النتائج. أننا قد طبقت بنجاح هذا البروتوكول الدرنات التي ظلت في التخزين البارد (4 درجة مئوية، 95% رطوبة نسبية) يصل إلى 8 أشهر. في حين قد تكون الدرنات مع العيوب (مثل درنة نهاية العفن، قلب أجوف، مناطق نخرية براون) استجابة، ينبغي تجنبها، إذا كان ذلك ممكناً.
2-يوم 1: بلاسموليزي الأنسجة درنة
ملاحظة: عنصر تحكم ورقة عينات يمكن تضمينها هنا لإنتاج بروتوبلاستس أو في الخطوة 5، 2 إذا كانت الاستعدادات الخام المفضلة. يجب إجراء هذا باستخدام أدوات معقمة في بيئة معقمة مثل غطاء الاندفاق الصفحي.
- سطح تعقيم درنات البطاطا عبر الانغماس في الإيثانول 75% لمدة 5 دقائق على الأقل.
- إزالة الدرنات من الإيثانول والهواء الجاف. هذا عادة ما يستغرق ~ 5 دقيقة، أطول إذا كانت الدرنة أكبر من 100 غرام.
- إعداد وتسمية العقيمة 50 مل أنابيب مخروطية الشكل لكل عينة والكوة 15 مل من تصفية تعقيم PIS إلى كل.
-
عينة تقريبا 1 سم3 من الأنسجة المرجوة من تعقيم الدرنات استخدام مشرط معقم أو حفار الفلين.
ملاحظة: اعتماداً على الأنسجة يتم أخذ عينات واحد استخدام سكين/مشرط أو حفار الفلين معقمة. على سبيل المثال، إذا كان المطلوب هو لب حفار الفلين يمكن استخدامها لاتخاذ مجموعة أساسية من قمي للغاية البعيدة من الدرنة وقد أخذ عينات الكسر المركزية الأساسية. ومع ذلك، نظراً مورفولوجية الداخلية غير المتناظر لدرنات البطاطا، قد يكون أكثر دقة للعينة حمة أو اللحاء إلى النصف الدرنات ونسق الأنسجة المرجوة. انظر الشكل 1 لتصوير مورفولوجيا درنة الداخلية.- ختم خشنا الأنسجة باستخدام مشرط معقم إلى حوالي 3 مم3 قطع ونقل الأنسجة للأنبوبة المخروطية التي تحتوي على PIS. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هذا لتحقيق أقصى قدر من المساحة السطحية حتى PIS، وبعد حل الإنزيم، قد تتخلل تماما الأنسجة الناتجة في الهضم أكثر اكتمالا.
- ختم خشنا الأنسجة باستخدام مشرط معقم إلى حوالي 3 مم3 قطع ونقل الأنسجة للأنبوبة المخروطية التي تحتوي على PIS. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
رقم 1: مورفولوجيا الداخلية لدرنات البطاطس. ويوضح الفصل بين لب (P) ولحمة بيريميدولاري (م) مع خطوط سوداء. يتم الرمز إلى الحلبة والأوعية الدموية، الذي يفصل بين لحمه من القشرة (ج) مع سهم أسود. نهاية رئد (S) وعيون درنة (ه) المسماة كذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
3-يوم 2: تولد بروتوبلاستس البطاطا
ملاحظة: هذا يجب إجراء مع أدوات معقمة في بيئة معقمة مثل غطاء الاندفاق الصفحي.
- إعداد والتصفية (تصفية القرود 0.45 ميكرومتر) مبلغ مناسب لحل الإنزيم (ES) (10 مل في عينة): المانيتول م 0.71، كاكل 3 مم2، 1 مم خ2ص4، 1 مم مجكل2، 4% R أونوزوكا-10 cellulase، 0.8% ماسيروزيمي R-10، هيميكولولاسي 1%، 10 مم مس العازلة، 5.8 درجة الحموضة. ضمان أن يتم استخدام عوامل التصفية المناسبة في هذه الخطوة؛ عوامل التصفية مع المسام حجم أصغر من 0.45 ميكرومتر المعرضة لانسداد حين غشاء ملزمة بروتين منخفض، مثل القرود، يقلل من فقدان إنزيم أثناء الترشيح.
- نضح قبالة PIS من العينات في أنابيب مخروطية استخدام ماصة مصلية عقيمة.
- أضف 10 مل ES كل عينة وعكس 2 – 3 مرات.
- احتضان عينات بين عشية وضحاها في 29 درجة مئوية مع الهز الأفقي 180 لفة في الدقيقة. احتضان عينات لمالا يقل عن 16 ح.
4-يوم 3: بروتوبلاستس الحصاد واغسل بروتوبلاستس
ملاحظة: ظروف معقمة ضرورية لا طويلاً عند هذه النقطة.
- إزالة عينات من شاكر والسماح لهم بتسوية ل ~ 10 دقيقة.
-
نضح قبالة قدر من الحل دا قدر الإمكان.
- إزالة جزء كبير من الحل دا ممكن ماصة مصلية، مع الحرص على تجنب إزالة الأنسجة هضمها.
- استخدام إزالة ميكروبيبيتي أي حل وفاق المتبقية، مرة أخرى تجنب الأنسجة هضمها. ويتم ذلك أكثر سهولة بعقد الأنبوبة بزاوية حيث أن الحل دا التدفقات نحو الغطاء بينما تظل الأنسجة هضمها في الجزء السفلي.
- إضافة 15 مل PWS لكل عينة، وعكس بلطف 2-3 مرات. السماح بروتوبلاستس على تسوية لمدة 10 دقائق.
- إزالة PWS مع ماصة مصلية. استخدام ميكروبيبيتي لإزالة أي سائل المتبقية.
ملاحظة: هذه الخطوة غاية الأهمية لضمان سلامة الأنوية عينة أثناء التدفق الخلوي. في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، تم العثور على هذه الخطوة لتكون المصدر الأكثر احتمالاً لفشل في عينة.
5-يوم 3: إعداد العينات للتدفق الخلوي
ملاحظة: العينات ينبغي أن تظل على الجليد من هنا ما لم يذكر خلاف ذلك.
- تحضير يوديد propidium (0.4 ملغ propidium يوديد/mL FCB) وحلول رناسي (0.8 ملغ رناسي A/مل FCB) بحل كل منهما في FCB.
تنبيه: يوديد Propidium عالية السمية. تجنب ملامسة الجلد أو العينين. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. -
إضافة 1.5 مل جليد الباردة FCB لكل عينة. باختصار اهتزاز أو دوامة كل عينة لتفريق تجمع الأنسجة. من المهم أن تفتيت كتل الأنسجة درنة حيث أن FCB الكامل قد تتخلل الخلايا وإطلاق سراح الأنوية. عينات مختلفة قد تتطلب أكثر أو أقل من الانفعالات تبعاً للنمط الوراثي والأنسجة.
ملاحظة: FCB بروتوبلاستس، الإفراج عن الأنوية. ومن ثم ضرورة حفظ العينات على الجليد للحيلولة دون تدهور.- إذا لم تدرج مراقبة التدفق الخلوي عينات في الخطوة جيل جبلة مجردة أنها يمكن أن تدرج هنا. إذا كان عنصر تحكم المراد إضافتها، ختم ناعما ورقة صغيرة (~ 3 سم2) في 1.5 مل جليد الباردة FCB باستخدام شفرة حلاقة. يجب أن تكون عينات مراقبة ploidy نفسه كنماذج تجريبية، يفضل أن يكون نفس النمط الوراثي. في المختبر النبيتات تميل إلى إعطاء قمم أنظف من الاحتباس الحراري أو النباتات التي تزرع في الحقل.
-
تمرير 1 مل تعليق FCB/الأنسجة من خلال عامل تصفية شبكة 106 ميكرومتر. استخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع نصيحة قطع ومش معدنية ذاب إلى الأسفل كما هو موضح في الخطوة 1.5.1. قد تتداخل هذه الأنبوبة ميكروسينتريفوجي مباشرة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل والعينة مرت مباشرة. في حالة استخدام أسلوب آخر للترشيح، قد جمعت في صفيحة بيتري المثلج فيلتراتي وثم نقل إلى أنبوب 2 مل.
ملاحظة: في بعض الأحيان المجاميع المتبقية والحطام الخلوية قد تسد مش عامل التصفية. وفي هذه الحالة، ببساطة اضغط اثنان أنابيب متداخلة ميكروسينتريفوجي عدة مرات لإزاحة الأنقاض. - إضافة 250 ميليلتر من الحل رناسي لكل عينة. عكس واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظة: هذه الخطوة يهدف إلى إزالة الجيش الملكي النيبالي من العينات، مما يؤدي إلى أقل ضوضاء أثناء التدفق الخلوي. كما النواة لم تدم طويلاً، بيد أن تقرر الباحثين إنقاص وقت الحضانة أو تنفيذ على الجليد إذا كانت تعاني من تدهور شديد في العينات الخاصة بهم. - إضافة ميليلتر 125 الحل يوديد propidium لكل عينة. عكس واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يجب استخدام عينات للتدفق الخلوي، في أقرب وقت ممكن كما تدهور واضح ضمن ح 2، حتى على الجليد.
6-يوم 3: التدفق الخلوي نويات درنة البطاطا
ملاحظة: تدفق العملية سيتوميتير، والبرمجيات سوف تختلف تبعاً للصك، والشركة المصنعة. سيتم توفير إرشادات مفصلة عن عملية محددة من سيتوميتير التدفق في "دليل المستخدم" هذا الصك.
- إنشاء قطعتي دوت باستخدام مقياس لوغاريتمي للأمام مبعثر مقابل مبعثر الجانب والجانب مقابل (PI) يوديد propidium المبعثر. أيضا إنشاء مدرج تكراري مع PI على المحور س. مطلوب مقياس لوغاريتمي لضمان كافة الأحداث داخل النطاق كما نوى قد تختلف اختلافاً شاسعاً في الأسفار.
-
تحميل أنبوب عينة تحكم معروفة وضبط الجهد حيث تكون كافة الأحداث بمقياس. ونحن نستخدم نسيج ليف في المختبر وراثي عينة. في حالة تشغيل عينات بلويديس مختلفة، ينبغي إدراج نموذج تحكم لكل.
- جعل علما لقناة لذروة ج 2 في نموذج عنصر تحكم. ينبغي أن تقع على قمم ج 2 من العينات التجريبية في نفس الموقع.
- تحميل نموذج تجريبي (درنة) ومرة أخرى التأكد من أن كافة الأحداث بمقياس. إذا كانت هناك تعديلات مطلوبة، كرر الخطوة 6.2 لتحديد قناة ج 2، قمم.
- بوابة الأنوية جبلة مجردة باستخدام الأرض مقابل PI مبعثر الجانب يدوياً.
- تعيين الرسم البياني PI لإظهار منطقة نوى بوابات جبلة مجردة فقط.
- جمع العدد المطلوب من الأحداث من كل عينة. كثيرا ما استخدم الباحثون أحداث بوابة 10,000 للتدفق الخلوي؛ ولكن نستخدم 2,000 أحداث درنة جبلة مجردة عينات لاستيعاب المزيد من العينات والعينات بتركيزات منخفضة.
- حساب الصناعات الاستخراجية كل عينة من رسوم بيانية بي باستخدام الصيغة التالية:
الصناعات الاستخراجية =
ج 8 حيثما ج 4 النسبة المئوية للنوى وهي ج 4 (تمثل جولة واحدة من اندوريدوبليكيشن)، هو النسبة المئوية التي ج 8، وهلم جرا. انظر الشكل 4 للحصول على أمثلة من رسوم بيانية وقيم ج الذري.
Representative Results
إنتاج بروتوبلاستس
جيل بروتوبلاستس ضروري لتحقيق نتائج قياس تدفق قابل للتكرار من درنات البطاطا، مورفولوجية العامة التي يتم عرضها في الشكل 1. ولعل الباحثين لضمان بروتوبلاستس عالية الجودة وقد صدرت قبل إضافة FCP، لا سيما في حالة أن استكشاف الأخطاء وإصلاحها. غالبية بروتوبلاستس يجب أن تكون كروية مع نتوءات الحد الأدنى (الشكل 2)، وقد تختلف اختلافاً كبيرا في الحجم، وربما تعكس الاختلافات في الصناعات الاستخراجية.
رقم 2: الممثل بروتوبلاستس أوراق ودرنات المكتسبة في الخطوة 4-4 البروتوكول. ينبغي أن تكون معزولة بروتوبلاستس كروية ومتناظرة مع غشاء البلازما سليمة. ملاحظة حجم الاختلاف بين أوراق (أ-ج) والدرنات (د، ه) بروتوبلاستس، فضلا عن الاختلافات في الحجم داخل أنسجة التي قد تشير إلى مستويات مختلفة من اندوريدوبليكيشن. بروتوبلاستس أوراق تحتوي على المعايشة حين amyloplasts مرئية داخل بروتوبلاستس الدرنات. تغيير حجم أشرطة = 1,000 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تقييم نتائج التدفق الخلوي
قد يمكن قياس نجاح أو فشل تجربة من عرض قمم وانفصالهما في رسوم بيانية الخلوي التدفق. كما يتطلب قياس اندوريدوبليكيشن حساب الوفرة النسبية للنوى في كل ذروة، مجرد وجود أو عدم وجود قمم غير كاف إذا كان هناك الكثير من الضجيج رسم حدود ذات مغزى فيما بينهما. يعرض الشكل 3 التباين في النتائج التي قد تواجه الباحثين في التدفق الخلوي التبعثر مؤامرات ورسوم بيانية. الأسباب المحتملة لفشل عينات ترد ضمن المناقشة.
الشكل 3: الممثل النتائج التي تم الحصول عليها من التدفق الخلوي نويات جبلة مجردة من سليمة والمتدهورة عينات لب. إظهار نويات سليمة (أ) فصل نظيف بين قمم التحديد الكمي للوفرة النسبية للخلايا في كل استخدام البرنامج المناسب حين تظهر قمم في عينات المتدهورة (ب) قواعد تحول وواسعة ومتداخلة. في scatterplots المتدهورة (د) عينات وسليمة (ج)، تشير المربعات السوداء إلى الحدث النووي النابضة لرسوم بيانية وتجميع الأحداث وينعكس في عرض على قمم الرسم البياني. تبين الأحداث خارج الأبواب الحطام، ونوى المتدهورة شديدة، أو المجاميع الأخرى. ح بي يتوافق مع كثافة الأسفار التي تقاس بوحدات التعسفي. وتناقش طرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمنع تدهور عينة داخل النص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
اندوريدوبليكيشن الخلافات بين الأنسجة
سبق أبلغنا أن أنسجة لب درنة لديها مستويات أكبر بكثير من اندوريدوبليكيشن من أنسجة اللحاء16. لتأكيد وتوسيع هذا ونحن ننظر في مستويات اندوريدوبليكيشن من ثلاثة أنسجة مختلفة في عام متفوقة: لب، بيريميدولاري حمة واللحاء، تتكرر في ثلاث نسخ مع أحداث بوابة 2,000 كل عينة. وأكدت النتائج التي توصلنا إليها ملاحظتنا السابقة أن أنسجة لب لديه أكبر بكثير من الصناعات الاستخراجية من الأنسجة القشرية مع وسائل اندوسيكليس 1.79 و 1.12 كل خلية، على التوالي (p = 0.018؛ الطالب الاختبار t). بعض الشيء المثير للدهشة، أظهرت صورة مماثلة لقشرة لحمه النسيج وكان أيضا تختلف اختلافاً كبيرا عن أنسجة لب (يعني = 1.14؛ p = 0.013؛ الطالب الاختبار t). يتم تلخيص هذه النتائج في الشكل 4.
الشكل 4: اندوريدوبليكيشن في الأنسجة الثلاثة من عام متفوقة. رسوم بيانية لليف (A) وقشرة الدرنات (ب)، حمة (ج) وأنسجة لب (د) تظهر جنبا إلى جنب مع الصناعات الاستخراجية قيمة محسوبة من تلك الرسوم البيانية. الاختلافات في الوفرة النسبية لنواة تضم كل ذروة بادية للعيان، لا سيما بين أنسجة النبات والدرنات. ج-عرض قيم لكل ذروة هي أيضا. ح بي يتوافق مع كثافة الأسفار التي تقاس بوحدات التعسفي. يعني إجراء مقارنات للصناعات الاستخراجية أنسجة الدرنات يتم عرضها في ه حيث تشير العلامة النجمية إلى فرق كبير (ف < 0.05) وإظهار أشرطة الخطأ المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تأثير حجم الدرنات و ploidy
نحن ذكرت سابقا أن درنات مختلفة الحجم ولكن نضج مماثل النمط وراثي معين، لم يتم عرض فرق مقابلة في الصناعات الاستخراجية16. نحن تهدف إلى تأكيد هذه النتيجة، فضلا عن تقييم العلاقة بين بلويدي واندوريدوبليكيشن. استخدمنا لهذه التجربة، replicates ثلاثة من نسيج حمة الأنماط الجينية المختلفة الثلاثة: عام متفوقة (4 x)، VT_SUP_19 (2x) وهو ديهابلويد المستخرجة من عام متفوقة ب التلقيح بركل17، VT_SUP_19 x 4 وديهابلويد الضعف 18 اسوي إلى VT_SUP_19. قمنا بتضمين مجموعة من replicates الصغيرة والكبيرة (90-130 غ) (< ز 35) الدرنات لعام العليا بينما الدرنات للأنماط الجينية الأخرى اثنين ز 90 – 130. كانت جميع الدرنات المحصودة من الدفيئة تزرع النباتات في مرحلة النضج الكامل، أي قمم النباتات قد سينيسسيد. لاحظنا فرق كبير بين VT_SUP_19 والسلف متفوقة (p = 0.04)؛ ومع ذلك، كان هناك لا يوجد فرق كبير بين VT_SUP_19 و VT_SUP_19 4 x (p = 0.69). يشير هذا إلى أن بينما هناك مكون وراثية المحتمل إلى اندوريدوبليكيشن، كغير المقنعة بتخفيض الجينوم، هو لا تمليها ploidy، على الأقل في هذه الخلفية. وأخيراً، مرة أخرى لاحظنا لا اختلافات كبيرة بين عام الكبيرة والصغيرة الدرنات متفوقة كما هو موضح في الشكل 5.
الرقم 5: اندوريدوبليكيشن في اثنين من أحجام الدرنات متفوقة عام والنباتات (VT_Sup_19) وتيترابلويد (VT_Sup_19 4 x) المشتقات المالية- ويبين الرسم البياني بار يعني الصغيرة (< ز 35) والكبيرة (90-130 غ) عام الدرنات متفوقة، فضلا عن الدرنات الكبيرة (90-130 غ) ديهابلويد VT_SUP_19 وديهابلويد تضاعف اسوي VT_SUP_19 4 x. اختلافات كبيرة (ف < 0.05) المشار إليها بواسطة تقرير رسالة الاتصال. أشرطة الخطأ تصور الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وينص البروتوكول على المقدمة في هذه الوثيقة الباحثين مع وسيلة لتقييم اندوريدوبليكيشن داخل درنات البطاطا، الذين الخلوية تعديل المحتوى، وزيادة حجم الخلية على ما يبدو يحول دون غيرها الاستعدادات التدفق الخلوي. يعتمد البروتوكول على توليد جبلة مجردة كوسيلة للحد من الضوضاء والحطام مع الحفاظ على السلامة النووية. سابقا، الباحثين قد وصف الأعمال التحضيرية مشابهة للمعاندة لا سيما التدفق الخلوي عينات، فضلا عن استخدام بروتوبلاستس الدرنات لدراسة مجموعة متنوعة من المواضيع مثل المرضية19،20. ومع ذلك، على حد علمنا، بلا تضافرت استخدام مثل هذه بروتوبلاستس الدرنات مع التدفق الخلوي غرض دراسة اندوريدوبليكيشن. وعلاوة على ذلك، وجدنا استخدام بروتوبلاستس أن تكون أكثر موثوقية من الاستعدادات الخام النموذجية فضلا عن التقنية تستخدم في الاثنين فقط دراسات أخرى لتقييم درنة اندوريدوبليكيشن6،7. هنا نناقش أوجه القصور في البروتوكول، والمزالق المحتملة في إعداد التنفيذ، وعينه، ونتائج تجربة نموذجية التي توظف أنه.
على الرغم من فائدة والتكرار درنة التدفق الخلوي البروتوكول، لديه بعض نقاط الضعف التي ينبغي أن تناقش. للبدء، هو البروتوكول الوقت المكثفة، التي تتطلب اثنين إينكوباتيونس بين عشية وضحاها. وعلاوة على ذلك، يتطلب البروتوكول بعض الكواشف باهظة الثمن، لا سيما سيلولاسي وماسيروزيمي. بالإضافة إلى ذلك، الأعمال التحضيرية العالية الحساسة للوقت، ومهينة في غضون ساعات قليلة، مما قد يحد من الإنتاجية خلال يوم واحد، لا سيما إذا رغبت في العديد من المناسبات. وأخيراً، البروتوكول، بينما يعول عليها، الحساسة للأخطاء ضمن إعداد العينة التي يبدو أن ينجم عنه ضرر إلى نويات وانخفاض نوعية النتائج. على سبيل المثال، قد يحدث التلوث الميكروبي أثناء بلاسموليسيس وجبلة مجردة جيل الخطوات (1 – 3، 4) بسبب الأسلوب العقيم غير لائق. تلوث العينة، بينما لم يكن دائماً تحول دون نجاح عينة، يبدو أن كبير انخفاض الجودة للحصول على رسوم بيانية، مرة أخرى المحتمل نظراً الأضرار التي لحقت النوى.
كما ذكر سابقا، هي المآخذ الرئيسية للبروتوكول تكاليف ووقت وحساسية للأخطاء. ولعل الباحثين على اتخاذ خطوات للتخفيف من كل من هذه. أما بالنسبة للتكلفة، تعتزم تطبيق البروتوكول على عينات العديد من الباحثين قد تنظر في تعديل تركيزات الإنزيم و/أو مدة الخطوة الهضم كأنسجة مختلفة وقد تختلف الأنماط الجينية في الاستجابة. وهذا يشمل إمكانية تصفية وإعادة تدوير ES التي قد سبق ثبت لكنه لم يعمل هنا21. أما بالنسبة للوقت، وفي ملاحظتنا، من الممكن أن تستغني الحضانة الأولى (الخطوة بلاسموليسيس) وما زال استخراج بروتوبلاستس؛ ومع ذلك، سلامتهم ووفرة ستعاني، مما يؤثر سلبا على النتائج. للحد من التدهور لعينات قد ينظر الباحثون أن بعض النهج التدفق الخلوي تنطوي على استخدام المصفف (مثلاً، والفورمالديهايد) للحفاظ على سلامة العينة22. وهذا قد يكون وسيلة مفيدة لكل منع التدهور والسماح لنموذج التخزين بدلاً من جبلة مجردة الابتزاز والتدفق الخلوي تحدث في نفس اليوم وقدم. قد تكون وسيلة أخرى لمنع استنزاف نويات ليشمل مثبط نوكلاس ES و/أو المعمرون؛ بينما 2-mercaptoethanol تتم لا تغييرات ملحوظة خلال التنمية، لم يتم اختبارها مثبطات أخرى هنا.
في ملاحظتنا، الخطوة الأكثر أهمية واحدة خطوة 4.4، الإزالة جميع الحل أغسل plasmolysis قبل إضافة المخزن المؤقت التدفق الخلوي (FCB). إذا حتى كمية صغيرة (< 10 ميليلتر) بقايا العينات أكثر بكثير من المحتمل أن يكون المتدهورة التي يمكن أن تؤدي إلى عينة ضعف أو فشل حتى. ومن المرجح نتيجة للشوائب داخل الحل إنزيم (مثل نوكليسيس، البروتياز)23،24 التي تتحلل بسرعة الأنوية أثناء فترات حضانة والوقت بين تشغيل العينة، وحتى بتركيزات منخفضة. ثمة اعتبار هام آخر هو مدة حضانة الخطوات PI ورناسي. كما ورد في البروتوكول، العينات التي لا تزال مستقرة لأكثر من بضع ساعات بعد تشغيل إضافة FCB حتى الباحثين قد تقرر خفض مدة هذه الخطوات لاستيعاب المزيد من عينات أو مطولة التدفق الخلوي الناجم عن نويات منخفضة تركيزات. وهذا يتطلب أيضا الباحث للنظر في المفاضلة بين عدد من الأحداث في كل عينة والعدد الإجمالي للعينات تشغيلها أو النظر في استخدام المصفف كما ذكر سابقا.
الاختلافات بين الأنسجة والأنماط الجينية
تقديم نتائج ممثل البروتوكول صممنا تجربتين بسيطة تأكيد التباين المبلغ عنها سابقا بالانسجة، ودراسة تأثير بلويدي والتركيب الوراثي. نتائج التجربة الأنسجة تثبت أن البروتوكول يثمر نتائج استنساخه، كما تبين أن الصناعات الاستخراجية أعلى مرة أخرى لانسجة لب. وكان المثير للدهشة إلى حد ما حمة الأنسجة، والتي لم يجر تقييم سابقا، قيمة الصناعات الاستخراجية مشابهة للأنسجة القشرية وأقل بكثير من لب. وكان هذا غير متوقعة كخلايا حمة أكبر عادة من لب أو الخلايا القشرية، على الأقل في مرحلة النضج. أحد التفسيرات المحتملة هو أن الدرنات (90-130 غ) كانت غير ناضجة جداً لخلايا حمة، التي تضم الغالبية حجم الدرنات عند النضج الكامل الموسع وبلغ بهم ج-القيم القصوى25. وهذا قد يفسر أيضا لماذا ديهابلويد (VT_SUP_19)، وتضاعف ديهابلويد (VT_SUP_19 4 x) أظهرت الصناعات الاستخراجية أكبر بكثير من عام الدرنات متفوقة؛ في حين أخذت عينات الدرنات تقريبا متساوية في الحجم من كل الوراثي، الحد الأقصى لحجم الدرنات من VT_SUP_19 أو تيترابلويد اسوي أصغر بكثير من أن السلف. وهكذا، قد يكون من أن عرض أكبر الصناعات الاستخراجية ببساطة لأنها كانت أكبر مقارنة بحجمها يمكن بلوغه الحد الأقصى. وبدلاً من ذلك، قد يكون الفرق نتيجة لتكملة الوراثية VT_SUP_19 الواردة من السلف تيترابلويد. وثمة إمكانية أخرى هي أن تخفيض الجينوم الذي وقع في استخراج ديهابلويد من تيترابلويد قد يكون العراقية الآليلات الضارة الناتجة في الإجهاد النبات على نطاق المنظومة، التي أظهرت أيضا تسهم الصناعات الاستخراجية مرتفعة26. ومع ذلك، يوضح هذا يجب توظيف الباحثين النظر بعناية عند اختيار الدرنات والأنسجة لاستخدامها للمقارنة بين قيم المنظمة الدولية للتعليم، لا سيما بين الأنماط الجينية.
التطبيقات المستقبلية
ينص البروتوكول على الموضحة في هذه المقالة الباحثين مع أداة هامة لفهم اندوريدوبليكيشن في البطاطا. فإنه قد يسمح للدراسات في العناصر الوراثية والبيئية من اندوريدوبليكيشن، في الوقت-مسار التنمية عبر أنسجة الدرنات، وتقييم التباين الطبيعي. وفي نهاية المطاف، قد جعل اندوريدوبليكيشن هدفا واعدة لتحسين البطاطا، تعهد الذي سوف تحتاج إلى وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتقييم.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ومولت هذه البحوث الوطنية العلم مؤسسة جائزة عدد 1237969، "كشف هيتيروزيجوسيتي والتكوين الاليلي، وتباين عدد نسخة من البطاطا" ووزارة الزراعة الأمريكية الخاصة منحة 2014-34141-22266 (جامعة ماين) إلى rv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
- Wilson, E. The karyoplasmic ratio. 727, 3rd edn, The Macmillan Company. (1925).
- Szymanski, D. B., Marks, M. D. GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).
- Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).
- Grafi, G., Larkins, B. A. Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases. Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).
- Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication. Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2. Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth. Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).
- Cheniclet, C., et al. Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth. Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).
- Pirrello, J., et al. How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches. Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).
- Chevalier, C., et al. Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory. J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).
- Galbraith, D. W., et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).
- Doležel, J., Greilhuber, J., Suda, J. Flow Cytometry with Plants: An Overview. Flow Cytometry with Plant Cells. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 41-65 (2007).
- Doležel, J., Bartoš, J. A. N. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).
- Doke, N., Tomiyama, K. Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues. Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).
- Davis, D. A., Currier, W. W. The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts. Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).
- Laimbeer, F. P. E., et al. Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops. Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).
- Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination. Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).
- Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants. Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).
- Doke, N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity. Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).
- Doke, N., Tomiyama, K. Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans. Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).
- Saxena, P. K., King, J. Reuse of enzymes for isolation of protoplasts. Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).
- Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. Cytometry and flow cytometry of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants. Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).
- Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. Tissue and cell culture. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , Springer. 39-50 (2013).
- Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement. Advances in Cell Culture. Maramorosch, K. 1, Elsevier. 241-279 (1981).
- Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions. Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).
- Scholes, D. R., Paige, K. N. Plasticity in ploidy: a generalized response to stress. Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).
