Summary
Protokollen beskrevet heri er en metode til måling af endoreduplikation inden for knolde af kartoffel (Solanum tuberosum). Det omfatter plasmolysis og protoplast udvinding skridt for at mindske støj og vragrester i downstream flow cytometric analyse.
Abstract
Endoreduplikation, replikation af en celle nukleare genom uden efterfølgende cytokinesis, udbytter celler med øget DNA indhold og er forbundet med specialisering, udvikling og stigning i cellulær størrelse. I planter synes endoreduplikation at fremme vækst og udvidelse af visse væv og organer. Blandt dem er knold af kartoffel (Solanum tuberosum), som undergår betydelig cellulære ekspansion i opfylder sin funktion af kulhydrat opbevaring. Endoreduplikation kan således spille en vigtig rolle i hvordan knoldene er i stand til at rumme denne overflod af kulstof. Dog celleaffald som følge af rå nukleare isolation metoder af knolde, metoder, der kan bruges effektivt med blade, udelukker estimering af knold endoreduplikation indeks (EI). Denne artikel præsenterer en teknik til at vurdere knold endoreduplikation gennem isolation af protoplasts, mens demonstrere repræsentative resultater opnået fra forskellige genotyper og opdelte knold væv. De store begrænsninger i protokollen er tid og reagens omkostninger kræves for prøveforberedelse samt relativt korte levetid for prøver efter lysering af protoplasts. Mens protokollen er følsomme over for tekniske variation, repræsenterer den en forbedring over traditionelle metoder af nukleare isolation fra disse store specialiserede celler. Muligheder for forbedringer i protokollen som genbrug enzym, brugen af fikseringsmidler, og andre ændringer er foreslået.
Introduction
Endoreduplikation er den proces, hvorved en celle giver afkald på den typiske cellecyklus og i stedet gennemgår en alternativ kursus udvikling består af gentagne runder af DNA-replikation uden cellulære division. Den resulterende celle vil have øget DNA indhold og nukleare størrelse, som menes at spille en rolle i cellulære regulering, udbygning og specialisering. Generelt, en runde af endoreduplikation (kaldt en endocycle) og den tilsvarende stigning i DNA indhold er forbundet med større cellevolumen, en observation, der bundfældes "karyoplasmic theory", at øget DNA indhold skal korrekt regulere en større, måske mere komplekse, celle1. Dette fænomen er udbredt i højere planter, efter at have været observeret i en række væv, herunder dem med strukturelle/defensiv (trichomes)2,3, nærende (majs endosperm)4,5, og vask/opbevaring ( tomat sølvhinderne; kartoffel knolde)6,7,8 funktioner. I frugt, er det blevet foreslået, at endoreduplikation spiller en rolle i at lette den hurtige ekspansion af sølvhinder, som det fremgår af negative sammenhængen mellem endoreduplikation og frugt udviklingsmæssige periode9. For eksempel celler med DNA indhold op til 512C (512 gange den haploide genom) er blevet observeret i tomat sølvhinderne8. Endvidere Chevalier et al. (2014) viste, at ændringer i udtrykket af gener, celle cyklus kan føre til stigninger i endoreduplikation niveauer inden for sølvhinder som så resulterer i større frugt10. Således giver ændring af gener fremme endoreduplikation et potentielt mål for forbedring af biomasse eller udbytte gennem planteavl eller genetisk manipulation. Sådan forbedring er dog betinget af større forståelse af årsagerne og konsekvenserne af endoreduplikation.
Endoreduplikation er oftest målt via flowcytometri hvorved kerner, udgivet i rå væv præparater11, inkuberes med en DNA-bindende fluorophore, såsom propidium Iodid12 (PI). De filtrerede prøver er derefter forbi laser af et flow forskellige hvor emission bølgelængder specifikke til fluorophore kan overholdes. Intensiteten af fluorescens i hver event (dvs., nucleus) er direkte korreleret med DNA-indhold af partiklen. Således, ved at sammenligne med en kendt standard, kan den relative og absolutte DNA indhold af celler i en given prøve beregnes. Endoreduplikation indeks (EI) bestemmes ved at etablere det gennemsnitlige antal endocycles pr. celle i en prøve ved at observere cellulære DNA indhold (C-værdien) hvor 1C er DNA indhold af en haploide celler (formel præsenteret i trin 6,7 i protokollen). For eksempel, i en diploide organismer er basisindhold DNA i somatiske celler 2C. Hvis en prøve har få celler med 4C, svarer til en enkelt runde af endoreduplikation og større ville det have en EI nær 0; men hvis næsten alle celler er 4C EI ville være ca. 1. Flere runder af endoreduplikation er fælles i højere planter observerede EI værdier kan dog være langt større. Mens beregning af endoreduplikation indekser kan relativt nemt, det kræver, at relative mængder af kerner C-værdierne være pålideligt konstateres, som er udelukket i visse arter og væv (herunder kartoffelknolde). Det er sandsynligt, at forskelle i cellulære anatomi, kemi eller cellevæg sammensætning13 forårsage disse prøver at være genstridige at de typiske præparater, der ved hjælp af et barberblad til at frigive kerner direkte i passende buffere, der er almindeligt anvendt med væv såsom tomat sølvhinder, en model for endoreduplikation undersøgelser8.
I kartoffel forbliver undersøgelse af endoreduplikation i knolden begrænset til bare et par undersøgelser, måske delvis skyldes en mangel på en pålidelige protokol som de førnævnte rå præparater give inkonsistente resultater. Mens sådanne tilgange arbejder godt for blade knold prøver oplever alvorlig nedbrydning og en overflod af støj i form af snavs, at differentiering af toppe består af kerner med forskellige C-værdier næsten umuligt. Det er måske på grund af forskelle i cellulære sammensætning og et væld af celleaffald i knolden celler (f.eks. stivelse-opbevaring amyloplasts). For at overvinde denne forhindring, udviklet vi for nylig en mere pålidelige protokol for at erhverve skelnes toppe i flowcytometri af kartoffelknolde. Hyppigheden af celler i hver top kan derefter bruges til at beregne præcise endoreduplikation niveauer for forskellige genotyper eller forskellige væv, der udgør en knold. Den protokol, der beskæftiger en modificeret protoplast ekstraktion metode14,15 antecedent tidligere beskrevet flow flowcytometri11, viste betydelig variation inden for kartoffel slægtninge, kultivarer og væv16 . Her præsenterer vi protokollen i detaljer ved at evaluere EI i sammenhænge Ploidi, væv og knold størrelse.
Protocol
Bemærk: Det er vigtigt at medtage passende kontrol, normalt i form af blad væv af samme Ploidi som eksperimentelle prøver. Dette er fordi 2C toppen af knold prøver kan være lille og svært at identificere.
1. præparater
Bemærk: De løsninger, der er anført her kan være forberedt i god tid og opbevares ved 4 ° C, men dem, der præsenteres i efterfølgende trin skal gøres frisk på dagen for brug.
- Gøre en passende mængde af Plasmolysis inkubation løsning (PIS) (15 mL/eksempel): 0,55 M mannitol, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris buffer pH 7,5 (justeret med HCl).
- Gøre en passende mængde af Plasmolysis vask løsning (PWS) (15 mL/eksempel), som er identisk med PIS med undtagelse af tilføjelsen af 0.71 M mannitol.
- Gøre 250 mL af modificerede Galbraiths Flow flowcytometri Buffer11 (FCB): 13,6 mM natriumcitrat (trinatrium), 8 mM MOPS, 18 mM MgCl2, 0,4% v/v Triton X-100. Omrøres i mindst 30 min til at distribuere Triton X-100.
- Filter sterilisere PIS og PWS løsninger med et 0,22 µm asymmetriske polyethersulfone (menneskeaber) filter. Bruge vakuum drevet filtrering enheder.
-
Forberede 106 µm mesh filtre for mængden protoplasts. Forberede 1,5 mL microcentrifuge rør, som kan indlejres direkte i indsamling rør, men enhver metode passere suspensioner gennem en 106 µm filter kan bruges.
Bemærk: Disse behøver ikke at være steril.- Hvis du bruger 1,5 mL microcentrifuge rør, skær 1 cm fra spidsen hver microcentrifuge tube. Ved hjælp af en varmeplade eller andre varme kilde varme en 1 cm2 stykke 106 µm stål mesh på et stykke aluminiumsfolie. Tryk på de afskårne enden af røret ind i masken, indtil de er smeltet.
- Vask kartoflerne skal udtages, at fjerne alle jord og snavs.
Bemærk: Knold størrelse og alder bør være passende mål for forsøget, men synes ikke at påvirke kvaliteten af resultaterne. Vi har med succes anvendt denne protokol til knolde, der har været på kølelager (4 ° C, 95% RH) op til 8 måneder. Mens knolde med defekter (fx knold ende rot, hule hjerte, brun nekrotisk områder) kan være lydhør, bør de undgås, hvis det er muligt.
2. dag 1: Plasmolyze knold væv
Bemærk: Kontrolprøver blad kan medtages her for at producere protoplasts eller på trin 5.2 Hvis rå præparater er foretrukket. Dette skal udføres med steril værktøjer i et aseptisk miljø som en laminar flow hætte.
- Overfladen sterilisere kartoffelknolde via nedsænkning i 75% ethanol i mindst 5 min.
- Fjern knolde fra ethanol og lufttørre. Dette tager normalt ~ 5 min, længere hvis knolden er større end 100 g.
- Forberede og etiket sterile 50 mL konisk rør til hver prøve og alikvot 15 mL filter steriliseret PIS i hver.
-
Prøve ca 1 cm3 af det ønskede væv fra steriliseret knolde ved hjælp af enten steriliseret skalpel eller kork soegeren.
Bemærk: Afhængigt af de væv er samplet man kan bruge enten en steriliseret cork soegeren eller kniv/skalpel. For eksempel, hvis sagopalmer ønskes cork soegeren kan bruges til at tage en kerne fra den apikale til distale ende af knolden og den centrale del af kernen kan smages. Men på grund af den asymmetriske interne morfologi af kartoffelknolde, det kan være mere præcist at prøve parenkym eller cortex af halvering knolden og udtagelse det ønskede væv. Se figur 1 for en skildring af interne knold morfologi.- Groft hak væv ved hjælp af en steriliseret skalpel i ca. 3 mm3 stykker og overførsel væv til koniske rør indeholdende PIS. Der inkuberes natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Dette er at maksimere areal så PIS, og senere enzym løsning, fuldt ud kan præge væv resulterer i mere komplet fordøjelsen.
- Groft hak væv ved hjælp af en steriliseret skalpel i ca. 3 mm3 stykker og overførsel væv til koniske rør indeholdende PIS. Der inkuberes natten over ved 4 ° C.
Figur 1: intern morfologi af en kartoffel knolde. Adskillelsen mellem sagopalmer (P) og perimedullary parenkym (PM) er illustreret med sorte streger. Den vaskulær ring, der adskiller parenkym fra cortex (C) er angivet med en sort pil. Udloeber ende (S) og knold øjne (E) er mærket som godt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
3. dag 2: Generere kartoffel Protoplasts
Bemærk: Dette skal udføres med steril værktøjer i et aseptisk miljø som en laminar flow hætte.
- Forberede og filter (0,45 µm aber filter) et passende beløb af enzymet løsning (ES) (10 mL/eksempel): 0.71 M mannitol, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 4% Onozuka R-10 cellulase, 0,8% macerozyme R-10, 1% hemicululase, 10 mM MES buffer, pH 5,8. Sikre at passende filtre anvendes i dette trin; filtre med pore størrelse mindre end 0,45 µm er udsat for tilstopning paa et lavt proteinindhold bindende membran, såsom aber, minimerer tab af enzymet under filtrering.
- Opsug fra PIS fra prøver i koniske rør ved hjælp af en steril serologisk pipette.
- Der tilsættes 10 mL ES til hver prøve indsamles og invertere 2 – 3 gange.
- Inkuber prøver overnatning på 29 ° C med 180 rpm vandrette ryster. Inkuber prøver i mindst 16 timer.
4. dag 3: Høst Protoplasts og vask Protoplasts
Bemærk: Aseptiske betingelser er ikke længe nødvendige på dette punkt.
- Fjern prøver fra shaker og tillade dem at nøjes med ~ 10 min.
-
Opsug så meget af ES løsningen som muligt.
- Fjern så meget af ES løsningen som muligt med en serologisk pipette, pasning til at undgå at fjerne den nedbrudte væv.
- Med en mikropipette fjerne enhver resterende ES løsning, igen at undgå fordøjet væv. Dette gøres lettest ved at holde røret i en vinkel, så at ES løsningen flyder mod låget mens fordøjet væv forbliver i bunden.
- Tilsættes 15 mL PWS til hver prøve og vend forsigtigt 2-3 gange. Tillad protoplasts nøjes med 10 min.
- Fjerne PWS med en serologisk pipette. Bruge en mikropipette til at fjerne enhver resterende væske.
Bemærk: Dette trin er helt afgørende at sikre integriteten af prøven kerner ved flowcytometri. I fejlfinding, blev dette skridt fundet for at være den mest sandsynlige kilde til fejl i en prøve.
5. dag 3: Forberede prøverne til flowcytometri
Bemærk: Prøverne skal opbevares på is herfra medmindre andet er angivet.
- Forberede propidium Iodid (0,4 mg propidium Iodid/mL FCB) og RNase løsninger (0,8 mg RNase A / mL FCB) ved at opløse hver i FCB.
Forsigtig: Propidium Iodid er meget giftigt. Undgå kontakt med hud eller øjne. Bære passende PPE. -
Der tilsættes 1,5 mL af is kold FCB til hver prøve. Kort ryste eller vortex hver prøve at bryde aggregerede væv. Det er vigtigt at bryde op klumper af knold væv, så FCB kan fuldt gennemsyre cellerne og frigive kerner. Forskellige prøver kan kræve mere eller mindre agitation afhængigt af væv og genotype.
Bemærk: FCB lyses protoplasts, frigive kerner. Dermed prøver nødvendigheden af at holde på isen for at forhindre nedbrydning.- Hvis strømmen flowcytometri kontrolprøver ikke indgik i protoplast generation trin kan de være medtaget her. Hvis et kontrolelement er tilføjes, fint snittes en lille blad (~ 3 cm2) i 1,5 mL af is kold FCB ved hjælp af et barberblad. Kontrolprøver bør være den samme Ploidi som de eksperimentelle prøver, helst den samme genotype. In vitro plantlets tendens til at give renere toppe end drivhusgasser eller felt-dyrkede planter.
-
Passere en 106 µm mesh-filter 1 mL af FCB/væv suspension. Brug et 1,5 mL microcentrifuge rør med spidsen afskåret og metalnet smeltet til bunden som beskrevet i trin 1.5.1. Denne microcentrifuge tube kan indlejres direkte ind i et 2 mL microcentrifuge rør og prøven direkte gennem. Hvis du bruger en anden metode til filtrering, kan filtratet opsamles i en iskold Petri plade og derefter overføres til en 2 mL tube.
Bemærk: nogle gange den resterende aggregater og celleaffald kan tilstoppe mesh-filter. I dette tilfælde blot trykke de to indlejrede microcentrifuge rør et par gange at løsne snavs. - Tilføje 250 µL af RNase løsning til hver prøve. Invertere og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: Dette trin er beregnet til at fjerne RNA fra prøverne, fører til mindre støj ved flowcytometri. Som kerner er kortlivede, beslutte forskere at nedsætte inkubationstiden eller udføre det på is, hvis de oplever alvorlige forringelse af deres prøver. - Tilføj 125 µL af propidium Iodid løsning til hver prøve. Invertere og der inkuberes i isbad i 30 min.
Bemærk: Prøver bør anvendes til flowcytometri så hurtigt som muligt, da nedbrydning er synlige inden for 2 timer, selv på is.
6. dag 3: Flowcytometri af Potato Tuber kerner
Bemærk: Strømmen forskellige drift og software vil variere afhængigt af instrumentet og producent. Detaljerede instruktioner om flow forskellige specifikke funktion vil blive leveret i instrumentets brugervejledning.
- Opret to dot parceller ved hjælp af logaritmisk skala af forward scatter vs side scatter og propidium Iodid (PI) vs side scatter. Også oprette et histogram med PI på x-aksen. Logaritmisk skala er forpligtet til at sikre alle begivenheder er i skala som kerner kan variere voldsomt i fluorescens.
-
Indlæse en kendt kontrol prøveglas og justere spændingen, således at alle arrangementer på skalaen. Vi bruge in vitro-blad væv fra en stikprøve genotype. Hvis prøver af forskellige ploidies til at køre, medregnes en kontrolprøve for hver.
- Gøre opmærksom på kanalen for 2C-toppen i kontrolprøve. 2C toppene af de eksperimentelle prøver bør falde på samme sted.
- Indlæse en eksperimentel (knold) prøve og igen sikre, at alle begivenheder på skalaen. Hvis justeringer er nødvendige, Gentag trin 6.2 at identificere kanal 2 c toppe.
- Manuelt gate protoplast kerner ved hjælp af side scatter vs PI plot.
- Indstille PI histogrammet kun vise regionen gated protoplast kerner.
- Indsamle det ønskede antal hændelser af hver prøve. Forskere bruger ofte 10.000 gated begivenheder til flowcytometri; men vi bruger 2.000 begivenheder for knold protoplast prøver for at rumme flere prøver og prøver med lave koncentrationer.
- Beregne hver prøve EI fra PI histogrammer ved hjælp af følgende formel:
EI =
hvor 4C er procentdelen af kerner, som er 4C (der repræsenterer en enkelt runde af endoreduplikation), er 8C den procentdel, som er 8C, og så videre. Se figur 4 eksempler på histogrammer og C-værdier af toppe.
Representative Results
Produktion af protoplasts
Generation af protoplasts er nødvendig for at opnå repeterbare flow flowcytometri resultater fra kartoffelknolde, generelle morfologi vises i figur 1. Forskere kan ønske at sikre høj kvalitet protoplasts er produceret før tilsætning af FCP, især i det tilfælde, at fejlfinding er påkrævet. Fleste af protoplasts bør være kugleformede med minimal fremspring (figur 2) og kan variere meget i størrelse, som måske afspejler forskelle i EI.
Figur 2: repræsentative blad og tuber protoplasts erhvervet ved trin 4.4 protokollens. Isolerede protoplasts bør være kugleformede og symmetrisk med plasma membranen intakt. Bemærk størrelse forskellen mellem blad (A-C) og knold (D, E) protoplasts samt forskelle i størrelse inden for et væv, hvilket kan angive forskellige niveauer af endoreduplikation. Blad protoplasts indeholder grønkorn, mens amyloplasts er synlige inden for knold protoplasts. Skalere barer = 1.000 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Evaluering af flow flowcytometri resultater
Succes eller fiasko af et eksperiment kan måles fra bredden af toppe og deres adskillelse i flow flowcytometri histogrammer. Da måle endoreduplikation kræver en beregning af relativ overflod af kerner i hver top, er blotte tilstedeværelse eller fravær af toppe utilstrækkelig, hvis der er for meget støj man tegner meningsfuld grænserne mellem dem. Figur 3 viser variationen i resultaterne forskere kan støde på i både flow flowcytometri scatter plots og histogrammer. Mulige årsager til mislykket prøver er præsenteret i diskussionen.
Figur 3: repræsentative resultater opnået ved flowcytometri af protoplast kerner af intakt og forringet sagopalmer prøver. Intakt kerner (A) Vis ren adskillelse mellem toppene at kvantificere relativ overflod af celler i hvert ved hjælp af passende software toppe i nedbrudte prøver (B) viser skiftede, bred og overlappende baser. I scatterplots af intakt (C) og forringet (D) prøver indikere sorte bokse nukleare hændelsen gating for histogrammer og klynger af begivenheder afspejles i bredden af histogrammet toppe. Begivenheder uden for portene viser vragrester, alvorligt forringet kerner eller andre aggregater. PI-Hansen svarer til intensiteten af fluorescens, som måles i arbitrære enheder. Fejlfindingsmetoder til at forhindre forringelse af prøven er drøftet i teksten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Endoreduplikation forskelle mellem væv
Vi rapporterede tidligere, at knold sagopalmer væv har betydeligt større niveauer af endoreduplikation end cortex væv16. At bekræfte og uddybe dette vi kiggede på endoreduplikation niveauer af tre forskellige væv i cv. Superior: sagopalmer, perimedullary parenkym og cortex, replikeres i tre eksemplarer med 2.000 gated begivenheder pr. prøve. Vores resultater bekræftede vores tidligere observation, sagopalmer væv har betydeligt større EI end kortikale væv med middel til 1,79 og 1.12 endocycles pr. celle, henholdsvis (p = 0.018; Student's t-test). Noget overraskende parenkym væv demonstreret en profil svarer til cortex og var også væsentligt anderledes end sagopalmer væv (betyde = 1,14; p = 0,013; Student's t-test). Disse resultater er sammenfattet i figur 4.
Figur 4: endoreduplikation i tre væv af cv. Superior. Histogrammer blad (A), Knold cortex (B), parenkym (C) og marv (D) væv bliver vist sammen med den EI værdi beregnes ud fra disse histogrammer. Forskelle i relativ overflod af kerner bestående af hver top er umiddelbart indlysende, især mellem blad og knold væv. C-værdier for hver top vises også. PI-Hansen svarer til intensiteten af fluorescens, som måles i arbitrære enheder. Betyde sammenligninger af EI af knold væv vises i E hvor stjerne angiver signifikant forskel (p < 0,05) og fejllinjer Vis standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Indflydelse af knold størrelse og Ploidi
Vi har tidligere rapporteret, at, for en given genotype, knolde af forskellig størrelse, men samme løbetid ikke viser en tilsvarende forskel i EI16. Vi havde til formål at bekræfte dette resultat samt vurdere forholdet mellem Ploidi og endoreduplikation. For dette eksperiment, brugte vi tre replikater af parenkym væv fra tre forskellige genotyper: cv. Superior (4 x), VT_SUP_19 (2 x) som er en dihaploid udvundet af cv. Superior af Pig bestøvning17og VT_SUP_19 4 x, som er en dobbelt dihaploid 18 isogene til VT_SUP_19. Vi indgår et sæt af replikater for store (90-130 g) og små (< 35 g) knolde for cv. Superior mens knolde for de andre to genotyper var 90-130 g. Knoldene blev alle høstet fra drivhus dyrket planter ved fuld modenhed, dvs toppe af planterne havde senesced. Vi observeret en signifikant forskel mellem VT_SUP_19 og dens stamfader Superior (p = 0,04); men der var ingen signifikant forskel mellem VT_SUP_19 og VT_SUP_19 4 x (p = 0,69). Dette indikerer, at mens der er en sandsynlighed genetiske komponent til endoreduplikation, som afsløret ved genomisk reduktion, det ikke er dikteret af Ploidi, i det mindste i denne baggrund. Endelig, vi endnu en gang observeret nogen væsentlige forskelle mellem store og små cv. Superior knolde som vist i figur 5.
Figur 5: endoreduplikation i to størrelser af knolde af cv. Superior diploid (VT_Sup_19) og tetraploide (VT_Sup_19 4 x) derivater. Søjlediagrammet viser middelværdien for små (< 35 g) og store (90-130 g) cv. Superior knolde samt store (90-130 g) knolde af dihaploid VT_SUP_19 og den isogene fordoblet dihaploid VT_SUP_19 4 x. Betydelige forskelle (p < 0,05) angives ved hjælp af rapporten forbinder brev. Fejllinjer skildrer standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den protokol, der præsenteres heri giver forskere med et middel til at vurdere endoreduplikation i kartoffelknolde, hvis modificerede cellulære indhold og øget celle størrelse tilsyneladende udelukker andre flow flowcytometri præparater. Protokollen er afhængig af protoplast generation som et middel til at reducere støj og snavs samtidig opretholde nukleare integritet. Tidligere har forskere beskrevet lignende præparater til særligt genstridige flow flowcytometri prøver samt udnyttet knold protoplasts for at studere en bred vifte af emner såsom patogenese19,20. Men til vores viden, har ingen kombineret brug af sådanne knold protoplasts med flowcytometri at studere endoreduplikation. Derudover fandt vi brugen af protoplasts til at være mere pålidelige end typiske rå præparater samt teknikken udnyttede i to kun andre undersøgelser for at vurdere knold endoreduplikation6,7. Her diskuterer vi mangler protokollen, potentielle faldgruber i sin udførelse og prøve forberedelse, og resultaterne af en typisk eksperiment, der beskæftiger det.
Trods den nytte og repeterbarhed af knold flow flowcytometri protokol har det et par svagheder, som bør drøftes. Til at begynde, er protokollen tid intensiv, der kræver to overnight inkubationer. Derudover kræver protokollen nogle dyre reagenser, især cellulase og macerozyme. Derudover er forberedelserne meget tidsfølsomme, nedværdigende inden for et par timer, som kan begrænse produktion inden for en enkelt dag, især hvis mange arrangementer er ønsket. Endelig, protokollen, mens pålidelige, er følsom over for fejl inden for prøveforberedelse som alle synes at medføre skade på kerner og lavere kvalitetsresultater. For eksempel, kan mikrobiel kontaminering opstå under plasmolysis og protoplast generation trinene (1-3,4) på grund af forkert aseptisk teknik. Prøven forurening, mens ikke altid udelukker succes af en prøve, synes at dramatisk reducere kvaliteten af opnåede histogrammer, skyldes igen sandsynligvis skade til atomkerner.
Som tidligere nævnt er de store ulemper ved protokollen omkostninger, tid og følsomhed over for fejl. Forskere kan ønske at tage skridt til at afbøde hver af disse. Hvad angår omkostninger, forskere har til hensigt at anvende protokollen at mange prøver kan overveje at ændre enzym koncentrationer og/eller varighed af fordøjelsen skridt som forskellige væv og genotyper kan variere i lydhørhed. Dette omfatter muligheden for filtrering og genanvendelse den ES, som tidligere har været vist men ikke ansat her21. Med hensyn til tid, i vores observation, er det muligt at give afkald på den første inkubation (plasmolysis trin) og stadig uddrag protoplasts; dog, deres integritet og overflod vil lide, der negativt påvirker resultaterne. For at mindske forringelse af prøver skønner forskere, at nogle flow flowcytometri metoder indebærer brug af fikseringsmidler (fx formaldehyd) at bevare prøve integritet22. Dette kan være et nyttigt middel til både forebygge forringelse og giver mulighed for prøve opbevaring snarere end protoplast International og flow flowcytometri forekommer på samme dag som præsenteres. Et andet middel til at forebygge nedslidning af kerner kan være at inkludere en nukleasen hæmmer ES og/eller FBC; mens 2-mercaptoethanol foretages ingen mærkbare ændringer under udvikling, er andre hæmmere ikke blevet testet heri.
I vores observation er det mest afgørende skridt skridt 4.4, fjernelse af alle plasmolysis vaskeopløsning før tilsætning af flow flowcytometri buffer (FCB). Hvis selv en lille mængde (< 10 µL) rester, prøver er meget mere tilbøjelige til at blive forringet, hvilket kan føre til en dårlig eller endda mislykket prøve. Dette er sandsynligvis på grund af urenheder i enzym løsning (f.eks. nukleaser, proteaser)23,24 , der hurtigt nedbrydes atomkerner under inkubation perioder og tid mellem prøve kører, selv ved lave koncentrationer. En anden vigtig overvejelse er varigheden af PI og RNase inkubation trin. Som det fremgår af protokollen, forbliver prøverne ikke stabil i mere end et par timer efter tilsætning af FCB så forskere kan beslutte at nedsætte varigheden af disse trin til at rumme flere prøver eller langvarige flowcytometri kører som følge af lav kerner koncentrationer. Dette kræver også forsker til at overveje afvejningen mellem antallet af begivenheder pr. sample og samlede antal prøver at køre eller overveje brugen af fikseringsmidler som tidligere nævnt.
Forskelle mellem væv og genotyper
For at give resultater repræsentant i protokollen udviklet vi to simple eksperimenter for at bekræfte tidligere rapporteret variation af væv og undersøge Ploidi og genotype indflydelse. Resultaterne af væv eksperiment viser, at protokollen giver reproducerbare resultater, som sagopalmer væv blev igen fundet for at have den højeste EI. Noget overraskende parenkym væv, som ikke havde tidligere blevet evalueret, havde en EI værdi svarende til kortikale væv og betydeligt lavere end sagopalmer. Dette var uventede parenkym celler er typisk større end enten sagopalmer eller kortikale celler, i det mindste ved modenhed. En mulig forklaring er, at knolde (90-130 g) var alt for umoden til parenkym celler, som udgør størstedelen af knold volumen på modenhed, at have fuldt udvidet og nået deres maksimale C-værdierne25. Dette kan også forklare, hvorfor dihaploid (VT_SUP_19) og den fordoblet dihaploid (VT_SUP_19 4 x) vist betydeligt større EI end cv. Superior knolde; mens knolde af omtrent samme størrelse blev udtaget fra hvert genotype, er den maksimale størrelse af knolde fra enten VT_SUP_19 eller den isogene tetraploide meget mindre end stamfader. Det kan således være, at de vises større EI blot fordi de var større i forhold til deres maksimale opnåelige størrelse. Alternativt, forskellen kan være en følge af den genetiske supplement VT_SUP_19 modtaget fra sin tetraploide stamfader. En anden mulighed er, at den genomisk reduktion, der opstod på udvinding af dihaploid fra tetraploide kan have afsløret skadelige alleler resulterer i plante-plan stress, som også har vist sig at bidrage til forhøjede EI26. Dette viser dog nøje overvejelse forskere skal ansætte når du vælger knolde og væv bruges til sammenligning af EI værdier, især mellem genotyper.
Fremtidige ansøgninger
Den protokol, der er beskrevet i denne artikel giver forskere et vigtigt redskab til forståelse endoreduplikation i kartoffel. Det kan for studier i de genetiske og miljømæssige komponenter af endoreduplikation, tidsforløb for udvikling på tværs af knold væv og vurdering af naturlige variationer. I sidste ende kan endoreduplikation gøre en lovende mål for kartoffel forbedring, en virksomhed, der vil kræve et pålideligt middel til vurdering.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af National Science Foundation Award nummer 1237969, "Optrevling heterozygositet, allel sammensætning og Copy Number Variation af kartoffel" og USDA særlige tilskud 2014-34141-22266 (University of Maine) til RV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
- Wilson, E. The karyoplasmic ratio. 727, 3rd edn, The Macmillan Company. (1925).
- Szymanski, D. B., Marks, M. D. GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).
- Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).
- Grafi, G., Larkins, B. A. Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases. Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).
- Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication. Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2. Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth. Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).
- Cheniclet, C., et al. Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth. Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).
- Pirrello, J., et al. How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches. Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).
- Chevalier, C., et al. Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory. J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).
- Galbraith, D. W., et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).
- Doležel, J., Greilhuber, J., Suda, J. Flow Cytometry with Plants: An Overview. Flow Cytometry with Plant Cells. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 41-65 (2007).
- Doležel, J., Bartoš, J. A. N. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).
- Doke, N., Tomiyama, K. Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues. Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).
- Davis, D. A., Currier, W. W. The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts. Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).
- Laimbeer, F. P. E., et al. Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops. Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).
- Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination. Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).
- Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants. Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).
- Doke, N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity. Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).
- Doke, N., Tomiyama, K. Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans. Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).
- Saxena, P. K., King, J. Reuse of enzymes for isolation of protoplasts. Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).
- Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. Cytometry and flow cytometry of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants. Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).
- Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. Tissue and cell culture. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , Springer. 39-50 (2013).
- Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement. Advances in Cell Culture. Maramorosch, K. 1, Elsevier. 241-279 (1981).
- Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions. Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).
- Scholes, D. R., Paige, K. N. Plasticity in ploidy: a generalized response to stress. Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).
