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Biology

अलग कंद Protoplasts के प्रवाह Cytometry द्वारा Endoreduplication को मापने

Published: March 9, 2018 doi: 10.3791/57134
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Horticulture, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Center for Molecular Medicine and Infectious Diseases, Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech

Summary

यहां वर्णित प्रोटोकॉल आलू (मकोय tuberosum) के कंद के भीतर endoreduplication को मापने के लिए एक विधि है । यह बहाव प्रवाह cytometric विश्लेषण में शोर और मलबे को कम करने के लिए plasmolysis और protoplast निष्कर्षण कदम भी शामिल है ।

Abstract

Endoreduplication, बाद में cytokinesis बिना एक सेल के परमाणु जीनोम की प्रतिकृति, वृद्धि की डीएनए सामग्री के साथ पैदावार कोशिकाओं और विशेषज्ञता, विकास और सेलुलर आकार में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है । पौधों में, endoreduplication कुछ ऊतकों और अंगों के विकास और विस्तार की सुविधा के लिए लगता है । इनमें आलू की कंद (मकोय tuberosum) है, जो कार्बोहाइड्रेट भंडारण के अपने कार्य को पूरा करने में काफी सेलुलर विस्तार है । इस प्रकार, endoreduplication कैसे कंद कार्बन की इस बहुतायत को समायोजित करने में सक्षम हैं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । हालांकि, सेलुलर मलबे से कच्चे तेल का परमाणु अलगाव के परिणामस्वरूप, तरीकों कि पत्तियों के साथ प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है, precludes कंद endoreduplication सूचकांक (ेि) का आकलन । यह लेख protoplasts के अलगाव के माध्यम से कंद endoreduplication के आकलन के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है, जबकि अलग पादी और compartmentalized कंद के ऊतकों से प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम का प्रदर्शन । प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमाएं समय और एजेंट नमूना तैयारी के लिए आवश्यक लागत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूनों की अपेक्षाकृत कम उंर protoplasts के lysis के बाद कर रहे हैं । जबकि प्रोटोकॉल तकनीकी भिंनता के प्रति संवेदनशील है, यह इन बड़े विशिष्ट कोशिकाओं से परमाणु अलगाव के पारंपरिक तरीकों पर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता है । ऐसे रीसाइक्लिंग एंजाइम के रूप में प्रोटोकॉल के लिए सुधार के लिए संभावनाओं, fixatives के उपयोग, और अंय परिवर्तन का प्रस्ताव कर रहे हैं ।

Introduction

Endoreduplication प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक सेल विशिष्ट कोशिका चक्र forgoes है और इसके बजाय सेलुलर विभाजन के बिना डीएनए प्रतिकृति के दोहराया दौर से मिलकर विकास का एक वैकल्पिक पाठ्यक्रम से गुजरती है । परिणामस्वरूप कोशिका डीएनए सामग्री और परमाणु आकार में वृद्धि हुई है जो सेलुलर विनियमन, विस्तार, और विशेषज्ञता में एक भूमिका निभाने के लिए सोचा है होगा । आम तौर पर, endoreduplication के एक दौर (एक endocycle) और डीएनए सामग्री में इसी वृद्धि के साथ जुड़े रहे है बड़ा सेल मात्रा, एक प्रेक्षण है कि उपजी "karyoplasmic सिद्धांत" है कि वृद्धि की डीएनए सामग्री के लिए ठीक से आवश्यक है एक बड़ा, शायद अधिक जटिल, सेल1विनियमन । यह घटना उच्च पौधों में आम है, संरचनात्मक/रक्षात्मक (trichomes) के साथ उन सहित ऊतकों की एक श्रेणी में मनाया गया है2,3, पोषक (मक्का endosperm)4,5, और सिंक/ टोमॅटो बोड़ी; आलू कंद)6,7,8 कार्य । फलों में, यह सुझाव दिया गया है कि endoreduplication endoreduplication और फल विकासात्मक अवधि के बीच नकारात्मक संबंध के रूप में सबूत के रूप में बोड़ी के तेजी से विस्तार को सुविधाजनक बनाने में एक भूमिका निभाता है9. उदाहरण के लिए डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं 512C करने के लिए (512 गुना अगुणित जीनोम) टमाटर बोड़ी में मनाया गया है8। इसके अलावा Chevalier एट अल (2014) का प्रदर्शन किया है कि सेल चक्र जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन बोड़ी जो बड़ा फल10में परिणाम के भीतर endoreduplication के स्तर में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, endoreduplication को बढ़ावा देने के जीन के परिवर्तन बायोमास या संयंत्र प्रजनन या आनुवंशिक हेरफेर के माध्यम से उपज के सुधार के लिए एक संभावित लक्ष्य प्रदान करता है । हालांकि, इस तरह के सुधार के कारणों और endoreduplication के परिणामों की अधिक से अधिक समझ पर आकस्मिक है ।

Endoreduplication सबसे अधिक बार प्रवाह cytometry जिससे नाभिक, क्रूड ऊतक तैयारी11में जारी द्वारा मापा जाता है, ऐसे propidium आयोडाइड12 (PI) के रूप में एक डीएनए बाध्यकारी fluorophore, के साथ तैयार कर रहे हैं । फ़िल्टर किए गए नमूनों तो एक प्रवाह cytometer के लेजर द्वारा पारित कर रहे हैं, जहां उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य fluorophore के लिए विशिष्ट देखा जा सकता है । प्रत्येक घटना (यानी, नाभिक) में प्रतिदीप्ति की तीव्रता सीधे-कण के डीएनए-सामग्री से संबंधित है । इस प्रकार, एक ज्ञात मानक की तुलना करके, रिश्तेदार और एक दिए गए नमूने में कोशिकाओं की पूर्ण डीएनए सामग्री की गणना की जा सकती है । Endoreduplication सूचकांक (ेि) सेलुलर डीएनए सामग्री (सी-वैल्यू) को देख कर एक नमूने के भीतर प्रति कोशिका endocycles की औसत संख्या स्थापित करने के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं जहां 1C एक अगुणित सेल के डीएनए सामग्री है (सूत्र प्रोटोकॉल के चरण 6.7 में प्रस्तुत). उदाहरण के लिए, एक द्विगुणित जीव में, दैहिक कोशिकाओं के आधार डीएनए सामग्री 2c है । यदि किसी नमूने में कुछ कक्ष है 4c के साथ, endoreduplication के एक एकल दौर के लिए संगत, या अधिक यह 0 के पास एक ेि होगा; लेकिन अगर लगभग सभी कोशिकाओं को 4c है 1 लगभग होगा । हालांकि, के रूप में endoreduplication के कई दौर उच्च पौधों में आम है देखा ेि मूल्यों बहुत अधिक हो सकता है । जबकि endoreduplication सूचकांक की गणना अपेक्षाकृत सरल हो सकता है, यह आवश्यक है कि नाभिक सी के सापेक्ष बहुतायत-मूल्यों मज़बूती से पता लगाया है, जो कुछ प्रजातियों और ऊतकों (आलू कंद सहित) में precluded है । यह संभावना है कि सेलुलर शरीर रचना विज्ञान, रसायन विज्ञान या कोशिका दीवार संरचना में अंतर13 इन नमूनों के कारण ठेठ एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए उचित बफ़र्स कि सामांयतः उपयोग किया जाता है में नाभिक जारी तैयारी के लिए अड़ियल हो ऐसे टमाटर बोड़ी, endoreduplication अध्ययन8के लिए एक मॉडल के रूप में ऊतकों के साथ ।

आलू में, कंद के भीतर endoreduplication की परीक्षा सिर्फ एक जोड़े के अध्ययन तक ही सीमित रहता है, शायद aforementioned कच्चे तेल की तैयारी के रूप में एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल की कमी के कारण भाग में असंगत परिणाम उपज । जबकि ऐसे दृष्टिकोण पत्तियों के लिए अच्छी तरह से काम कंद के नमूने गंभीर क्षरण और मलबे के रूप में शोर की एक बहुतायत का अनुभव है, सी भिंन-मूल्यों के साथ नाभिक के शामिल चोटियों के भेदभाव लगभग असंभव बना । यह शायद सेलुलर संरचना में मतभेद और कंद कोशिकाओं के भीतर सेलुलर मलबे की एक फले के कारण है (उदास्टार्च-भंडारण amyloplasts) । इस बाधा को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में आलू कंद के प्रवाह cytometry में विशिष्ठ चोटियों को प्राप्त करने के लिए एक अधिक विश्वसनीय प्रोटोकॉल विकसित किया है । प्रत्येक चोटी के भीतर कोशिकाओं की आवृत्ति तो अलग पादी या एक कंद शामिल है कि विभिंन ऊतकों के लिए सटीक endoreduplication स्तरों की गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटोकॉल, जो एक संशोधित protoplast निष्कर्षण विधि14रोजगार,15 पूर्वपद पहले वर्णित प्रवाह cytometry11, आलू रिश्तेदारों, किस्मों, और ऊतकों के भीतर काफी भिंनता दिखाया16 . यहाँ हम ploidy, ऊतक, और कंद के आकार के संदर्भों में ेि का मूल्यांकन करके विस्तार से प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Protocol

नोट: यह उचित नियंत्रण शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है, आमतौर पर प्रायोगिक नमूनों के रूप में एक ही ploidy के पत्ते ऊतक के रूप में. यह इसलिए है क्योंकि कंद के नमूनों की 2c चोटी छोटी और पहचान के लिए कठिन हो सकती है ।

1. तैयारी

नोट: यहां सूचीबद्ध समाधान समय से आगे तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित है लेकिन बाद के चरणों में प्रस्तुत उन उपयोग के दिन ताजा किया जाना चाहिए ।

  1. Plasmolysis मशीन समाधान (पीआईएस) की एक उपयुक्त मात्रा बनाओ (15 एमएल/नमूना): 0.55 मीटर mannitol, 2 मिमी CaCl2, 1 मिमी KH2पीओ4, 1 मिमी MgCl2, 50 मिमी Tris बफर पीएच 7.5 (एचसीएल के साथ समायोजित) ।
  2. Plasmolysis वाश सॉल्यूशन (PWS) (15 mL/नमूना) का एक उपयुक्त वॉल्यूम जो ०.७१ M mannitol के अलावा पीआईएस के समान है ।
  3. संशोधित गालब्रेथ के प्रवाह Cytometry बफर के 250 मिलीलीटर बनाओ11 (FCB): 13.6 mm सोडियम साइट्रेट (trisodium), 8 मिमी MOPS, 18 मिमी MgCl2, 0.4% v/वी ट्राइटन एक्स-100 । ट्राइटन एक्स-100 वितरित करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए हिलाओ ।
  4. फ़िल्टर बाँझ पीआईएस और PWS समाधान एक 0.22 µm असममित polyethersulfone (वानर) फिल्टर के साथ. वैक्यूम चालित निस्पंदन इकाइयों का उपयोग करें ।
  5. लीजड ड protoplasts के लिए 106 µm मेष फिल्टर तैयार करें । तैयार 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब जो सीधे संग्रह ट्यूबों में नेस्टेड हो सकता है, लेकिन एक 106 µm फिल्टर के माध्यम से निलंबन पारित करने के किसी भी विधि इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    नोट: ये बाँझ होने की जरूरत नहीं है.
    1. यदि 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग कर, एक microcentrifuge ट्यूब टिप से 1 सेमी काट । एक गर्म थाली या अंय गर्मी स्रोत गर्मी एक 1 सेमी2 टुकड़ा एल्यूमीनियम पंनी का एक टुकड़ा पर 106 µm स्टील मेष का प्रयोग । जाल में ट्यूब की कटौती अंत प्रेस जब तक वे आपस में जुड़े हुए हैं ।
  6. आलू को धोकर, सभी मिट्टी और मलबे को हटाने के लिए नमूना हो ।
    नोट: कंद का आकार और आयु प्रयोग के लक्ष्यों के लिए उपयुक्त होना चाहिए लेकिन परिणाम की गुणवत्ता को प्रभावित करने के लिए नहीं लगता । हमने इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक उन कंद के लिए लागू किया है जो 8 महीने तक कोल्ड स्टोरेज (4 डिग्री सेल्सियस, 95% आरएच) में रहे हैं । दोषों के साथ कंद (जैसे कि कंद के अंत में सड़न, खोखले दिल, भूरे रंग के क्षेत्र) उत्तरदायी हो सकते हैं, यदि संभव हो तो उन्हें टाल दिया जाना चाहिए ।

2.1 दिन: Plasmolyze कंद ऊतक

नोट: नियंत्रण पत्ती के नमूनों को यहां शामिल किया जा सकता है protoplasts उत्पादन या कदम 5.2 पर यदि क्रूड तैयारी पसंद कर रहे हैं । इस तरह एक लामिना प्रवाह हुड के रूप में एक अपूतित वातावरण में बाँझ उपकरण के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

  1. भूतल 75% इथेनॉल में विसर्जन के माध्यम से आलू कंद कम से कम 5 मिनट के लिए निष्फल ।
  2. इथेनॉल और हवा सूखी से कंद निकालें । यह आमतौर पर लेता है ~ 5 मिनट, अब अगर कंद 100 जी से भी बड़ा है
  3. तैयार और लेबल बाँझ प्रत्येक नमूने के लिए 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों और aliquot के 15 मिलीलीटर फ़िल्टर प्रत्येक में पीआईएस निष्फल ।
  4. या तो निष्फल स्केलपेल या कॉर्क बरमा का उपयोग करके निष्फल कंद से वांछित ऊतक के लगभग 1 सेमी3 नमूना ।
    नोट: एक नमूना किया जा रहा ऊतक पर निर्भर करता है या तो एक निष्फल कॉर्क बरमा या चाकू/स्केलपेल का उपयोग कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, यदि मज्जा वांछित है काग बरमा कंद के बाहर के अंत करने के लिए शिखर से एक कोर लेने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कोर के केंद्रीय अंश नमूना लिया जा सकता है । हालांकि, आलू कंद की असममित आंतरिक आकृति विज्ञान के कारण, यह कंद halving और वांछित ऊतक उत्पाद शुल्क के द्वारा नमूना पैरेन्काइमा या प्रांतस्था करने के लिए और अधिक सटीक हो सकता है । आंतरिक कंद आकृति के चित्रण के लिए चित्र 1 देखें ।
    1. मोटे रूप से लगभग 3 मिमी में एक निष्फल स्केलपेल का उपयोग ऊतक काट3 टुकड़े और पीआईएस युक्त शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ऊतक । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
      नोट: यह सतह क्षेत्र को अधिकतम करने के लिए इतना है कि पीआईएस, और बाद में एंजाइम समाधान, पूरी तरह से अधिक पूर्ण पाचन में जिसके परिणामस्वरूप ऊतक रिस सकता है.

Figure 1
चित्रा 1: आलू कंद की आंतरिक आकृति विज्ञान मज्जा (पी) और perimedullary पैरेन्काइमा (प्रधानमंत्री) के बीच जुदाई काली रेखाओं से सचित्र है । नाड़ी की अंगूठी, जो प्रांतस्था (ग) से पैरेन्काइमा को अलग करती है, एक काले तीर से चिह्नित है । stolon अंत (ओं) और कंद आंखें (ङ) के रूप में अच्छी तरह से लेबल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3. दिन 2: आलू Protoplasts उत्पन्न

नोट: इस तरह के एक लामिना प्रवाह हुड के रूप में एक अपूतित वातावरण में बाँझ उपकरण के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

  1. तैयार और फिल्टर (0.45 µm एप्स फ़िल्टर) एंजाइम समाधान की एक उचित मात्रा (ES) (10 मिलीलीटर/०.७१ मीटर mannitol, 3 एमएम CaCl2, 1 एमएम KH2पीओ4, 1 एमएम MgCl2, 4% Onozuka आर-10 cellulase, 0.8% macerozyme आर-10, 1% hemicululase, 10 मिमी एमईएस बफर, पीएच 5.8 । सुनिश्चित करें कि इस चरण में उपयुक्त फ़िल्टर्स का उपयोग किया गया है; इस तरह के एप्स के रूप में एक कम प्रोटीन बाध्यकारी झिल्ली, जबकि निस्पंदन के दौरान एंजाइम की हानि को कम करता है, जबकि 0.45 µm की तुलना में छोटे ताकना आकार के साथ फिल्टर कॉलेस्ट्रॉल करने के लिए प्रवण हैं ।
  2. महाप्राण एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग शंकु ट्यूबों में नमूनों से बंद पीआईएस.
  3. प्रत्येक नमूने को ES के 10 मिलीलीटर जोड़ें और 2-3 बार पलटना ।
  4. 180 rpm क्षैतिज झटकों के साथ 29 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के नमूने । न्यूनतम 16 घंटे के लिए मशीन के नमूने

4. Day 3: हार्वेस्ट Protoplasts और वॉश Protoplasts

नोट: अपूतित स्थितियों इस बिंदु पर लंबे समय से आवश्यक नहीं हैं ।

  1. शेखर से नमूने निकालें और उंहें ~ 10 मिनट के लिए बसने के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. संभव के रूप में ES समाधान के रूप में ज्यादा से महाप्राण ।
    1. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ संभव के रूप में ES समाधान के रूप में ज्यादा निकालें, देखभाल के लिए पचा ऊतक को हटाने से बचने के लिए ले ।
    2. एक micropipette का उपयोग कर किसी भी शेष ES समाधान हटाने, फिर पचा ऊतक से परहेज । यह सबसे आसानी से एक कोण पर ट्यूब पकड़ द्वारा किया जाता है ताकि ES समाधान ढक्कन की ओर बहती है, जबकि पचा ऊतक तल पर बनी हुई है ।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए PWS के 15 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे 2-3 बार पलटना । protoplasts 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें ।
  4. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ PWS निकालें । किसी भी शेष तरल को निकालने के लिए एक micropipette का उपयोग करें ।
    नोट: यह चरण प्रवाह cytometry के दौरान नमूना नाभिक की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण है । समस्या निवारण में, यह चरण किसी नमूने में विफलता का सबसे संभावित स्रोत होने के लिए पाया गया था ।

5. Day 3: फ्लो Cytometry के लिए नमूने तैयार करें

नोट: नमूने बर्फ पर यहां से जब तक अंयथा नोट पर रखा जाना चाहिए ।

  1. FCB में प्रत्येक को भंग करके propidium आयोडाइड (0.4 मिलीग्राम propidium आयोडाइड/एमएल RNase) और RNase सॉल्यूशन (0.8 मिलीग्राम FCB ए/एमएल FCB) तैयार करें ।
    सावधानी: Propidium आयोडाइड अत्यधिक विषाक्त है । त्वचा या आंखों के साथ संपर्क से बचें । जेवण उपयुक्त पीपीई.
  2. प्रत्येक नमूने के लिए 1.5 मिलीलीटर बर्फ की ठंड FCB जोड़ें । संक्षेप में हिला या एक नमूना इकट्ठा ऊतक को तोड़ने के लिए भंवर । यह कंद के ऊतकों के झुरमुट को तोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि FCB पूरी तरह से कोशिकाओं को रिस सके और नाभिक जारी कर सके । विभिन्न नमूनों ऊतक और जीनोटाइप के आधार पर अधिक या कम आंदोलन की आवश्यकता हो सकती है.
    नोट: FCB lyses protoplasts, नाभिक जारी । इसलिए बर्फ पर नमूने रखने के लिए गिरावट को रोकने की आवश्यकता है ।
    1. नियंत्रण प्रवाह cytometry नमूने protoplast जनरेशन चरण में शामिल नहीं किए गए थे, तो वे यहाँ शामिल किया जा सकता है । एक नियंत्रण जोड़ा जा करने के लिए है, तो पतले एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग बर्फ ठंड FCB के 1.5 मिलीलीटर में एक छोटे से पत्ती (~ 3 सेमी2) काटना । नियंत्रण नमूने प्रयोगात्मक नमूनों के रूप में एक ही ploidy होना चाहिए, अधिमानतः एक ही जीनोटाइप. इन विट्रो में plantlets ग्रीनहाउस या क्षेत्र के बड़े पौधों की तुलना में क्लीनर चोटियों दे देते हैं ।
  3. एक 106 µm मेष फिल्टर के माध्यम से FCB/ऊतक निलंबन के 1 मिलीलीटर दर्रा । के साथ एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब का प्रयोग करें टिप कट और धातु जाल नीचे करने के लिए पिघला के रूप में चरण 1.5.1 में वर्णित है । इस microcentrifuge ट्यूब एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सीधे नेस्टेड और नमूने के माध्यम से सीधे पारित हो सकता है । निस्पंदन की एक और विधि का उपयोग करते हैं, तो निस्पंदन एक बर्फ ठंड पेट्री प्लेट में एकत्र किया जा सकता है और फिर एक 2 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरित ।
    नोट: कई बार शेष समुच्चय और सेलुलर मलबे मेष फिल्टर रोकना हो सकता है । इस मामले में, बस दो नेस्टेड microcentrifuge ट्यूबों कई बार मलबे को उखाड़ फेंक करने के लिए नल ।
  4. प्रत्येक नमूने के लिए RNase समाधान के 250 µ l जोड़ें । उल्टे और कमरे के तापमान (आरटी) में 30 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: इस कदम के नमूने से आरएनए हटाने के लिए इरादा है, प्रवाह cytometry के दौरान कम शोर करने के लिए अग्रणी. हालांकि, के रूप में नाभिक कम रहते हैं, शोधकर्ताओं को गर्मी समय कम या यह बर्फ पर प्रदर्शन अगर वे अपने नमूनों की गंभीर गिरावट का सामना कर रहे है तय कर सकते हैं ।
  5. प्रत्येक नमूने के लिए propidium आयोडाइड के 125 µ l को जोड़ें । उल्टे और 30 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    नोट: नमूने के रूप में संभव के रूप में जल्द ही प्रवाह cytometry के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए 2 घंटे के भीतर स्पष्ट है, यहां तक कि बर्फ पर ।

6. दिन 3: आलू कंद नाभिक का प्रवाह Cytometry

नोट: फ्लो cytometer ऑपरेशन और सॉफ्टवेयर साधन और निर्माता के आधार पर अलग-अलग होगा । साधन के प्रयोक्ता गाइड में प्रवाह cytometer के विशिष्ट संचालन पर विस्तृत निर्देश प्रदान किए जाएंगे ।

  1. फॉरवर्ड स्कैटर बनाम साइड स्कैटर और propidium आयोडाइड (PI) बनाम साइड स्कैटर के लघुगणकीय स्केल का उपयोग करके दो डॉट प्लॉट बनाएँ. इसके अलावा एक्स-अक्ष पर PI के साथ हिस्टोग्राम बनाएं । लघुगणक स्केल सभी घटनाओं पैमाने के भीतर नाभिक प्रतिदीप्ति में काफी अलग हो सकता है के रूप में सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है ।
  2. एक ज्ञात नियंत्रण नमूना ट्यूब लोड और वोल्टेज इतना समायोजित करें कि सभी घटनाओं पैमाने पर कर रहे हैं. हम इन विट्रो पत्ती ऊतक एक नमूना जीनोटाइप से का उपयोग करें । यदि अलग ploidies के नमूने को चलाने के लिए कर रहे हैं, प्रत्येक के लिए एक नियंत्रण नमूना शामिल किया जाना चाहिए ।
    1. कंट्रोल्ड सैंपल में 2c स्चोटी के चैनल का नोट बना लें । प्रायोगिक नमूनों की 2c नुकीला चोटियों को एक ही स्थान पर गिरना चाहिए ।
  3. एक प्रयोगात्मक (कंद) नमूना लोड और फिर सुनिश्चित करें कि सभी घटनाओं पैमाने पर कर रहे हैं । समायोजन की आवश्यकता है, तो दोहराएँ चरण 6.2 2c चोटियों के चैनल की पहचान करने के लिए.
  4. मैन्युअल गेट साइड स्कैटर बनाम PI प्लॉट का उपयोग कर protoplast नाभिक.
  5. PI हिस्टोग्राम केवल gated protoplast नाभिक क्षेत्र को दिखाने के लिए सेट करें ।
  6. प्रत्येक नमूने से घटनाओं की वांछित संख्या लीजिए । अक्सर शोधकर्ताओं प्रवाह cytometry के लिए 10,000 gated घटनाओं का उपयोग करें; लेकिन हम कंद protoplast नमूनों के लिए 2,000 घटनाओं का उपयोग कम सांद्रता के साथ अधिक नमूनों और नमूनों को समायोजित करने के लिए ।
  7. निम्न सूत्र का उपयोग करते हुए PI हिस्टोग्रामs से प्रत्येक नमूना के ेि की गणना:
    ेि =Equation 1
    जहां 4c नाभिक का प्रतिशत है जो 4c (endoreduplication के एक एकल दौर का प्रतिनिधित्व) है, 8C प्रतिशत है जो 8C हैं, और इतने पर है । हिस्टोग्राम के उदाहरण और चोटियों के सी-मानों के लिए चित्रा 4 देखें ।

Representative Results

protoplasts का उत्पादन

protoplasts की पीढ़ी आलू कंद से दोहराया प्रवाह cytometry परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, सामान्य आकृति विज्ञान चित्रा 1में प्रदर्शित किया जाता है । शोधकर्ताओं ने उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए चाहते हो सकता protoplasts FCP के अलावा करने से पहले का उत्पादन किया गया है, विशेष रूप से घटना है कि समस्या निवारण की आवश्यकता है । protoplasts के बहुमत ंयूनतम दखल के साथ गोलाकार होना चाहिए (चित्रा 2) और बहुत आकार में अलग हो सकता है, जो शायद में अंतर के प्रतिबिंबित करता है ेि ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि पत्ती और कंद प्रोटोकॉल के 4.4 कदम पर अधिग्रहीत protoplasts. पृथक protoplasts गोलाकार और प्लाज्मा झिल्ली बरकरार के साथ सममित होना चाहिए । पत्ता (A-C) और कंद (D, E) के बीच के आकार के अंतर को नोट करें और साथ ही protoplasts के आकार में अंतर जो endoreduplication के विभिंन स्तरों का संकेत हो सकता है । पत्ती protoplasts में chloroplasts होते हैं जबकि amyloplasts कंद protoplasts के भीतर दिखाई देते हैं । स्केल बार्स = 1,000 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

प्रवाह cytometry परिणामों का मूल्यांकन

एक प्रयोग की सफलता या असफलता चोटियों की चौड़ाई और प्रवाह cytometry में उनकी जुदाई से गेज किया जा सकता है हिस्टोग्राम । मापने के रूप में endoreduplication प्रत्येक चोटी में नाभिक के सापेक्ष बहुतायत की गणना की आवश्यकता है, मात्र उपस्थिति या चोटियों के अभाव अपर्याप्त है तो उन दोनों के बीच सार्थक सीमाओं को आकर्षित करने के लिए बहुत शोर है । चित्रा 3 परिणाम में भिंनता प्रदर्शित करता है शोधकर्ताओं दोनों प्रवाह cytometry तितर बितर भूखंडों और हिस्टोग्राम में मुठभेड़ हो सकता है । विफल नमूनों के लिए संभावित कारणों चर्चा के भीतर प्रस्तुत कर रहे हैं ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि परिणाम अक्षुण्ण और नीचा मज्जा के नमूनों की protoplast नाभिक के प्रवाह cytometry से प्राप्त की । बरकरार नाभिक (ए) चोटियों के बीच साफ जुदाई दिखाने के लिए प्रत्येक में कोशिकाओं के सापेक्ष बहुतायत के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विकृत नमूनों (ख) में चोटियों जबकि दिखाने के स्थानांतरित, व्यापक और अतिव्यापी कुर्सियां । बरकरार (C) और नीचा (D) नमूनों के scatterplots में, काले बक्से, हिस्टोग्राम के लिए नाभिकीय घटना गेटिंग का संकेत देते है और घटनाओं का clustering हिस्टोग्राम चोटियों की चौड़ाई में प्रतिबिंबित होता है । गेट्स के बाहर की घटनाएं मलबे, गंभीर रूप से नीचा नाभिक, या अंय समुच्चय का संकेत देती हैं । पीआई-एच प्रतिदीप्ति जो मनमाना इकाइयों में मापा जाता है की तीव्रता से मेल खाती है । नमूना क्षरण को रोकने के लिए समस्या निवारण विधि पाठ के भीतर चर्चा कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ऊतकों के बीच अंतर Endoreduplication

पहले हम कंद मज्जा ऊतक प्रांतस्था ऊतक16से endoreduplication के काफी अधिक स्तर है की सूचना दी । पुष्टि करने के लिए और इस पर विस्तार हम cv में तीन अलग ऊतकों के endoreduplication स्तर पर देखा । सुपीरियर: मज्जा, perimedullary पैरेन्काइमा, और प्रांतस्था, प्रति नमूना 2,000 तपसिल घटनाओं के साथ gated में दोहराया । हमारे परिणामों ने हमारे पहले के प्रेक्षण की पुष्टि की है कि मज्जा ऊतक cortical ऊतक की तुलना में काफी अधिक है १.७९ और प्रति कोशिका 1.12 endocycles के साधन के साथ, क्रमशः (p = ०.०१८; छात्र का टी-टेस्ट) । कुछ हद तक आश्चर्य की बात है, पैरेन्काइमा ऊतक प्रांतस्था के समान एक प्रोफ़ाइल का प्रदर्शन किया और भी मज्जा ऊतक से काफी अलग था (मतलब = 1.14; p = ०.०१३; छात्र का टी-टेस्ट) । ये परिणाम आरेख 4में सारांशित किए जाते हैं ।

Figure 4
चित्रा 4: cv के तीन ऊतकों में Endoreduplication. सुपीरियर. पत्तियों के हिस्टोग्राम (A), कंद प्रांतस्था (B), पैरेन्काइमा (C), और मज्जा (D) के ऊतकों को उन हिस्टोग्रामओं की गणना की गई ेि मान के साथ दिखाया जाता है । प्रत्येक चोटी शामिल नाभिक के सापेक्ष बहुतायत में अंतर विशेष रूप से पत्ती और कंद के ऊतकों के बीच, आसानी से स्पष्ट कर रहे हैं । प्रत्येक चोटी के लिए सी-मान भी प्रदर्शित होते हैं. पीआई-एच प्रतिदीप्ति जो मनमाना इकाइयों में मापा जाता है की तीव्रता से मेल खाती है । मतलब कंद के ऊतकों की तुलना ई में प्रदर्शित की जाती है जहां तारांकन चिह्न महत्वपूर्ण अंतर दर्शाता है (p < 0.05) और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

कंद के आकार और ploidy का प्रभाव

हमने पहले बताया था कि, किसी दिए गए जीनोटाइप के लिए, विभिन्न आकार के कंद लेकिन इसी प्रकार की परिपक्वता में एक इसी अंतर को16में प्रदर्शित नहीं किया गया । हम इस परिणाम की पुष्टि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ploidy और endoreduplication के बीच संबंधों का मूल्यांकन उद्देश्य । इस प्रयोग के लिए, हम तीन अलग पादी से पैरेन्काइमा ऊतक के तीन दोहराने का इस्तेमाल किया: cv. सुपीरियर (4x), VT_SUP_19 (2x) जो cv से निकाले dihaploid है । prickle परागण17, और VT_SUP_19 4x जो एक दोगुनी dihaploid है द्वारा सुपीरियर १८ isogenic ते VT_SUP_19. हमने cv के लिए बड़े (90 – 130 ग्राम) और छोटे (< 35 g) कंद के लिए प्रतिकृतियों का एक सेट शामिल किया है । सुपीरियर जबकि अन्य दो पादी के लिए कंद ९०-१३० ग्राम थे. कंद सभी पूरी परिपक्वता पर ग्रीनहाउस उगाए गए पौधों से काटा गया था, यानी पौधों के सबसे ऊपर senesced था । हम VT_SUP_19 और उसके जनक बेहतर (पी = 0.04) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर मनाया; हालांकि, VT_SUP_19 और VT_SUP_19 4x (p = ०.६९) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था । यह इंगित करता है कि जब वहां endoreduplication के लिए एक संभावना आनुवंशिक घटक है, के रूप में जीनोमिक कमी से बेपर्दा, यह ploidy द्वारा तय नहीं है, इस पृष्ठभूमि में कम । अंत में, हम एक बार फिर से बड़े और छोटे cv के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर देखा । चित्रा 5में प्रदर्शन के रूप में बेहतर कंद ।

Figure 5
चित्रा 5: cv के दो आकारों में Endoreduplication. सुपीरियर और इसके द्विगुणित (VT_Sup_19) और tetraploid (VT_Sup_19 4x) डेरिवेटिव । पट्टी चार्ट छोटे (< 35 g) और बड़े (90 – 130 g) cv के लिए माध्य दिखाता है । dihaploid VT_SUP_19 और isogenic दोगुनी dihaploid VT_SUP_19 4x के रूप में बेहतर कंद के साथ ही बड़े (90-130 ग्राम) कंद । महत्वपूर्ण अंतर (p < 0.05) को कनेक्टिंग लेटर रिपोर्ट द्वारा दर्शाया गया है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

प्रोटोकॉल प्रस्तुत इस के साथ साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है एक के लिए आलू कंद, जिसका संशोधित सेलुलर सामग्री और सेल आकार प्रतीत होता है बाधा अंय प्रवाह cytometry की तैयारी के भीतर endoreduplication का आकलन करने का मतलब है । प्रोटोकॉल एक शोर और मलबे को कम करने के लिए जबकि परमाणु अखंडता को बनाए रखने के साधन के रूप में protoplast पीढ़ी पर निर्भर करता है । पहले, शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से अड़ियल प्रवाह cytometry नमूनों के लिए इसी तरह की तैयारी का वर्णन किया है और साथ ही उपयोग कंद protoplasts रोगजनन19,20जैसे विषयों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए । हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, कोई भी endoreduplication अध्ययन के प्रयोजन के लिए प्रवाह cytometry के साथ इस तरह के कंद protoplasts के उपयोग संयुक्त है । इसके अलावा, हम protoplasts का उपयोग करने के लिए ठेठ कच्चे तेल की तैयारी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो ही अंय अध्ययनों में उपयोग तकनीक को कंद endoreduplication6,7का आकलन करने से अधिक विश्वसनीय हो पाया । यहां हम प्रोटोकॉल की कमियों पर चर्चा, इसके निष्पादन और नमूना तैयारी में संभावित नुकसान, और एक ठेठ प्रयोग जो इसे रोजगार के परिणाम ।

उपयोगिता और कंद प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल की पुनरावृत्ति के बावजूद, यह कुछ कमजोरियों जो चर्चा की जानी चाहिए है । शुरू करने के लिए, प्रोटोकॉल समय गहन है, दो रात की गर्मी की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल कुछ महंगा एजेंट, विशेष रूप से cellulase और macerozyme की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, तैयारियां अत्यधिक समय-संवेदी होती हैं, कुछ ही घंटों के भीतर अपमानजनक होती है, जो एक ही दिन के भीतर प्रवाह को सीमित कर सकती है, विशेषकर यदि कई घटनाएँ वांछित हों. अंत में, प्रोटोकॉल, जबकि विश्वसनीय, नमूना तैयारी के भीतर त्रुटियों के प्रति संवेदनशील है जो सभी के नाभिक और कम गुणवत्ता के परिणाम को नुकसान में परिणाम लगते हैं । उदाहरण के लिए, माइक्रोबियल संक्रमण plasmolysis और protoplast पीढ़ी कदम (1 – 3.4) अनुचित अपूतित तकनीक के कारण के दौरान हो सकता है । नमूना संदूषण, जबकि हमेशा नहीं एक नमूना की सफलता precluding, नाटकीय रूप से प्राप्त हिस्टोग्रामs की गुणवत्ता में कमी करने के लिए लगता है, फिर नाभिक को नुकसान की वजह से की संभावना है ।

जैसा कि पहले कहा गया है, प्रोटोकॉल की बड़ी कमियां लागत, समय, और त्रुटियों के प्रति संवेदनशीलता हैं । शोधकर्ताओं को इन में से प्रत्येक के लये कदम उठाने की इच्छा हो सकती है. लागत के लिए के रूप में, शोधकर्ताओं ने कई नमूनों के लिए प्रोटोकॉल लागू करने के लिए इच्छुक एंजाइम सांद्रता और/या पाचन कदम की अवधि के रूप में विभिंन ऊतकों और पादी जवाबदेही में भिंन हो सकते है संशोधित करने पर विचार कर सकते हैं । यह फ़िल्टरिंग और जो पहले से प्रदर्शन किया गया है, लेकिन यहां कार्यरत21नहीं रिसाइकिलिंग की संभावना भी शामिल है । समय के लिए के रूप में, हमारे प्रेक्षण में, यह पहली मशीन के साथ बांटना संभव है (plasmolysis कदम) और अभी भी protoplasts निकालने; हालांकि, उनकी अखंडता और बहुतायत है, जो नकारात्मक प्रभावों परिणाम भुगतना होगा । नमूनों की गिरावट को कम करने के लिए शोधकर्ताओं ने विचार कर सकते हैं कि कुछ प्रवाह cytometry दृष्टिकोण fixatives का उपयोग शामिल (जैसे, formaldehyde) नमूना अखंडता को संरक्षित करने के लिए22. यह दोनों गिरावट को रोकने के लिए एक उपयोगी साधन हो सकता है और प्रस्तुत के रूप में एक ही दिन पर होने वाली protoplast सटीक और प्रवाह cytometry के बजाय नमूना भंडारण के लिए अनुमति देते हैं । नाभिक के उदासीनता को रोकने का एक अंय साधन के लिए ES और/या FBC के लिए एक nuclease अवरोधक शामिल हो सकता है; जबकि 2-mercaptoethanol विकास के दौरान कोई ध्यान देने योग्य परिवर्तन प्रभावित, अंय अवरोधों यहां परीक्षण नहीं किया गया है ।

हमारे अवलोकन में, एक सबसे महत्वपूर्ण कदम चरण 4.4, प्रवाह cytometry बफर (FCB) के अलावा से पहले सभी plasmolysis धोने समाधान का निष्कासन है । यदि यहां तक कि एक छोटी मात्रा (< 10 µ l) बनी रहती है, तो नमूनों में ज्यादा नीचा होने की संभावना होती है जो गरीब या विफल नमूना का नेतृत्व कर सकते हैं । यह एंजाइम समाधान के भीतर अशुद्धियों के कारण होने की संभावना है (जैसे nucleases, teases)23,24 जो जल्दी से मशीन अवधि और नमूना रन के बीच समय के दौरान नाभिक नीचा, यहां तक कि कम सांद्रता पर. एक अंय महत्वपूर्ण विचार PI और RNase की अवधि के लिए गर्मी कदम है । के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, नमूनों FCB के अलावा के बाद से अधिक कुछ घंटों के लिए स्थिर नहीं रहना है तो शोधकर्ताओं ने इन कदमों की अवधि को कम करने के लिए और अधिक नमूनों या लंबा प्रवाह cytometry कम नाभिक से जिसके परिणामस्वरूप चलाता को समायोजित करने का फैसला कर सकते हैं सांद्रता. यह भी शोधकर्ता के लिए नमूना और नमूनों की कुल संख्या प्रति घटनाओं की संख्या के बीच tradeoff पर विचार करने के लिए चलाने के लिए या पहले उल्लेख के रूप में fixatives के उपयोग पर विचार की आवश्यकता है ।

ऊतकों और पादी के बीच अंतर

प्रोटोकॉल के परिणाम प्रतिनिधि प्रदान करने के लिए हम दो सरल प्रयोगों ऊतक द्वारा पहले से सूचित भिंनता की पुष्टि करें और ploidy और जीनोटाइप के प्रभाव की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया । ऊतक प्रयोग के परिणामों को प्रदर्शित करता है कि प्रोटोकॉल reproducible परिणाम पैदावार, मज्जा ऊतक के रूप में एक बार फिर से सबसे अधिक पाया गया था । कुछ हद तक आश्चर्यजनक पैरेन्काइमा ऊतक, जो पहले से मूल्यांकन नहीं किया गया था, एक ेि cortical ऊतक के समान मूल्य था और काफी मज्जा से कम है । यह पैरेन्काइमा कोशिकाओं के रूप में अप्रत्याशित था आमतौर पर या तो मज्जा या cortical कोशिकाओं से भी बड़ा है, कम परिपक्वता पर । एक संभव विवरण है कि कंद (90-130 ग्राम) पैरेन्काइमा कोशिकाओं है, जो परिपक्वता पर कंद की मात्रा के बहुमत शामिल के लिए भी अपरिपक्व थे, पूरी तरह से विस्तार किया है और उनके अधिकतम सी-25मूल्यों तक पहुंच । यह भी समझा जा सकता है क्यों dihaploid (VT_SUP_19) और डबल dihaploid (VT_SUP_19 4x) काफी अधिक cv से अधिक ेि प्रदर्शन किया । बेहतर कंद; जबकि लगभग बराबर आकार के कंद प्रत्येक जीनोटाइप से नमूने लिए गए थे, या तो VT_SUP_19 या isogenic tetraploid से कंद का अधिकतम आकार जनक की तुलना में बहुत छोटा है । इस प्रकार, यह हो सकता है कि वे अधिक से अधिक ेि बस प्रदर्शित क्योंकि वे अपने अधिकतम प्राप्य आकार के सापेक्ष बड़े थे । वैकल्पिक रूप से, अंतर आनुवंशिक पूरक अपने tetraploid जनक से प्राप्त VT_SUP_19 का एक परिणाम हो सकता है । एक और संभावना है कि जीनोमिक कमी है कि tetraploid से dihaploid के निष्कर्षण पर हुआ बेपर्दा बचके alleles संयंत्र चौड़ा तनाव में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है, जो भी ऊंचा ेि में योगदान करने के लिए दिखाया गया है26। फिर भी, यह दर्शाता है सावधान विचार शोधकर्ताओं को काम करना चाहिए जब कंद और ऊतकों का चयन करने के लिए पादी के बीच विशेष रूप से, ेि मूल्यों की तुलना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।

भविष्य अनुप्रयोगों

इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल आलू में endoreduplication को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है । यह endoreduplication के आनुवंशिक और पर्यावरणीय घटकों में अध्ययन के लिए अनुमति दे सकता है, कंद के ऊतकों में विकास का समय-पाठ्यक्रम, और प्राकृतिक भिन्नता का आकलन । अंततः, endoreduplication आलू सुधार, एक उपक्रम है जो आकलन के एक विश्वसनीय साधन की आवश्यकता होगी के लिए एक आशाजनक लक्ष्य बना सकते हैं ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह शोध राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पुरस्कार संख्या १२३७९६९ द्वारा वित्त पोषित किया गया था, "Heterozygosity, Allelic रचना, और आलू की प्रतिलिपि संख्या भिन्नता" और USDA विशेष अनुदान 2014-34141-22266 (मेन के विश्वविद्यालय) आर. वी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Serological pipette Fisher 13-676-10k (sterile)
Pipet Aid XP (autopipettor) Drummond Scientific 4-000-101
Conical tubes (50 mL) Thermo Fisher Scientific 339652 (sterile)
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Globe Scientific 111558
Microcentrifuge tubes (2 mL) Globe Scientific 111552
Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) Thermo Fisher Scientific 564-0020 (sterile)
Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) Thermo Fisher Scientific 168-0045 (sterile)
Cellulase "Onozuka R-10" Yakult contact company
Macerozyme "Onozuka R-10" Yakult contact company
Hemicellulase Sigma H2125
Tris base Fisher Scientific BP152-1
MES buffer Acros Organics 172590250
Triton X-100 MP Biochemicals 194854
Magnesium Chloride (hexahydrate) Fisher Scientific M35-500
Calcium Chloride (dihydrate) Fisher Scientific C79-500
D-Mannitol Acros Organics 423922500
MOPS Acros Organics 17263-0250
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) Sigma-Aldrich P-5379
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4170 For flow cytometry preparations
Ribonuclease A Sigma-Aldrich R5000 For flow cytometry preparations
Cork borers with punch American Scientific 2093-02 For sampling desired tissue
Forceps Thermo Fisher Scientific 16-31 For smapling desired tissue
Scalpel Thermo Fisher Scientific 08-920B For smapling desired tissue
106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size New Jersey Wire Mesh Co. contact company

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References

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अलग कंद Protoplasts के प्रवाह Cytometry द्वारा Endoreduplication को मापने
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Laimbeer, F. P. E., Makris, M.,… More

Laimbeer, F. P. E., Makris, M., Veilleux, R. E. Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts. J. Vis. Exp. (133), e57134, doi:10.3791/57134 (2018).

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