Summary
여기에 설명 된 프로토콜 (푸른 풀밭 tuberosum) 감자의 괴 경에서 endoreduplication를 측정 하기 위한 방법입니다. 그것은 plasmolysis 및 원생 동물 추출 단계 소음 및 다운스트림 흐름 cytometric 분석에서 파편을 감소를 포함 합니다.
Abstract
Endoreduplication, 후속 cytokinesis, 없이 셀의 핵 게놈의 복제 증가 DNA 콘텐츠로 셀 있고 세포 크기에 전문성, 개발 및 증가 연관 되어 있습니다. 식물, endoreduplication 성장과 특정 조직 및 장기의 확장을 촉진 하기 위하여 보인다. 그 중 감자 (푸른 풀밭 tuberosum), 탄수화물 저장의 기능 수행에 상당한 세포 확장을 겪 습의 결 절이 이다. 따라서, endoreduplication는 어떻게 tubers는 탄소이 풍요를 수용할 수 있는 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 그러나, 세포 파편 tubers의 원유 핵 격리 방법에서 발생, 잎, 효과적으로 사용할 수 있는 방법 걸로 하겠습니다는 괴 경 endoreduplication 지 수 (EI)의 추정을. 이 문서 동안 대표적인 결과 보여주는 다른 genotypes에서 얻은 결 절 조직 들 에게만 protoplasts의 격리를 통해 괴 경 endoreduplication를 평가 하기 위한 기술을 제공 합니다. 프로토콜의 주요 한계는 후에 protoplasts의 세포 샘플의 상대적으로 짧은 수명으로 샘플 준비에 필요한 시간 및 시 약 비용. 프로토콜 기술 변화에 민감한 반면, 그것은 이러한 대형 특수 세포에서 핵 격리의 전통적인 방법에 비해 개선을 나타냅니다. 효소, fixatives의 사용 및 다른 변경 재활용 같은 프로토콜의 개선에 대 한 가능성을 제안 했다.
Introduction
Endoreduplication 셀 일반적인 세포 주기 싶고 고 대신 세포질 부 없이 DNA 복제의 반복된 라운드로 구성 된 개발의 대체 과정을 겪 습 프로세스입니다. 결과 셀 DNA 증가 한다 세포질 규칙, 확장, 및 전문화에 역할을 생각 하는 콘텐츠 및 핵 크기. 일반적으로, endoreduplication (불리는 endocycle)와 DNA 콘텐츠 증가 더 큰 세포 볼륨와 관련 된, DNA 콘텐츠 증가 "karyoplasmic 이론"을 시 켰 던 관찰 하는 데 필요한 제대로 더 큰, 아마도 더 많은 복잡 한, 셀1을 통제 한다. 이 현상은 조직 구조/방어 (trichomes)2,3, 포함의 범위에 관찰 하는 데 더 높은 식물에서 일반적 이다 영양 (옥수수 endosperm)4,5와 싱크/스토리지 ( 토마토과 피; 감자 괴 경)6,,78 기능. 과일, 그것은 그의 endoreduplication는과 피의 급속 한 확장을 용이 하 게 endoreduplication와 과일 개발 기간9사이 부정적인 관계에 의해 입증으로 역할 제안 되었습니다. 예를 들어 세포 dna 콘텐츠 512 C (단일 게놈의 512 배)까지 토마토과 피8에서 관찰 되었습니다. 또한 기사 외. (2014) 시연 변경 세포 주기 유전자의 표현에는 피 내 endoreduplication 수준에 있는 증가를 큰 과일10다음 결과 발생할 수 있습니다. 따라서, endoreduplication를 홍보 하는 유전자의 바이오 매스 식물 번 식 또는 유전자 조작을 통해 수율의 개선에 대 한 잠재적인 대상을 제공 합니다. 그러나, 이러한 개선의 원인 이해 및 endoreduplication의 결과 조건입니다.
Endoreduplication은 가장 자주 cytometry propidium 요오드 화물12 (PI) 등 DNA 묶는 fluorophore와 인 큐베이 팅 핵, 원유 조직 준비11, 발표는 그것에 의하여를 통해 측정 됩니다. 필터링 된 샘플 다음에 fluorophore를 특정 방출 파장을 관찰 될 수 있다 교류 cytometer의 레이저에 의해 전달 됩니다. 각 이벤트 (예: 핵)에 형광의 강도 입자의 DNA-콘텐츠로 직접 상관 된다. 따라서, 알려진된 표준에 비교 하 여 주어진 샘플에서 셀의 상대적이 고 절대적인 DNA 콘텐츠를 계산할 수 있습니다. Endoreduplication 지 수 (EI)은 1 C는 단일 셀 (수식 6.7 프로토콜의 단계에서 제시)의 DNA 내용은 세포 DNA 콘텐츠 (C-값)을 관찰 하 여 샘플 내의 셀 당 endocycles의 평균 수를 설정 하 여 결정 됩니다. 예를 들어, 2 중 유기 체에서 체세포의 기본 DNA 콘텐츠는 2 c. 샘플 4 c 몇 셀 경우, endoreduplication의 단일 라운드에 해당 하거나 큰 했 0; 한이 그러나 거의 모든 세포는 4 C 경우는 약 1 것입니다. 그러나, endoreduplication의 여러 라운드는 더 높은 식물 관찰된이 값에서 일반적으로 훨씬 더 수 있습니다. Endoreduplication 인덱스를 계산 하는 동안 수 있습니다 수 비교적 간단 하 고, 그것은 핵의 상대적인 나타났는데 C 값 해야 합니다 안정적으로 확인, 특정 종 및 조직 (를 포함 하 여 감자 괴 경)에서 배제 되는. 그것은 세포질 해부학, 화학 또는 세포 벽 구성13 차이 면도날을 사용 하 여 일반적으로 사용 되는 적절 한 버퍼에 직접 핵을 분리 하는 일반적인 준비에 고집 불통 될 이러한 샘플 발생할 가능성이 토마토과 피와 같은 조직, endoreduplication에 대 한 모델 연구8.
감자, endoreduplication는 결 절 내에서 시험으로 상기 원유 준비 일관성 없는 결과 얻을 단지 몇 가지 연구, 아마도 일부 신뢰할 수 있는 프로토콜의 부족으로 인해 제한 된 남아 있습니다. 이러한 접근 잎을 위해 잘 작동 하는 동안 괴 경 샘플 심각한 저하와 파편, 봉우리 다른 C-값이 거의 불가능 한 핵의 구성의 차별화를 만들기의 형태에서 풍부한 경험. 이것은 아마도 세포 구성 및 결 절 세포 내에서 세포 파편의 풍부에 차이 (예. 전 분 저장 amyloplasts). 이 장애물을 극복 하기 위해 우리는 최근 감자 괴 경 cytometry 구별할 수 봉우리 인수에 대 한 더 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발 했다. 셀 내에서 각 피크의 주파수 다음 다른 genotypes 또는 결 절을 구성 하는 다른 조직에 대 한 정확한 endoreduplication 레벨을 계산에 사용할 수 있습니다. 앞서15 추출 방법14,수정된 원생 동물은을 사용 하 여 프로토콜 설명한 흐름 cytometry11, 감자 친척, 재배, 그리고 조직16 내에서 상당한 변화를 보였다 . 여기 있는 우리가 현재 프로토콜 세부 ploidy, 조직, 그리고 결 절 크기의 컨텍스트에서 평가 하 여.
Protocol
참고: 그것은 일반적으로 실험 샘플으로 동일한 ploidy의 잎 조직의 형태에 적절 한 컨트롤을 포함 하는 것이 중요. 이 때문에 결 절 샘플의 2 C 피크 작고 식별 하기 어려운 수 있습니다.
1입니다. 준비
참고: 여기에 나열 된 솔루션 수 있습니다 미리 준비 되며, 4 ° C에서 저장 하지만 그 이후 단계에 제시 해야 합니다 수 신선한 사용 당일.
- 적절 한 볼륨 Plasmolysis 창업 솔루션 (PIS)의 (15 mL/샘플): 0.55 M 마 니 톨, 2mm CaCl2, 1mm KH2포4, 1 mM MgCl2, 50 m m Tris 버퍼 pH 7.5 (HCl와 조정).
- 적절 한 볼륨 Plasmolysis 세척 솔루션 (PWS)의 (15 mL/샘플)는 PIS 0.71 M 마 니 톨의 추가 제외 하면 동일 하다.
- 확인 수정된 Galbraith의 Flow Cytometry 버퍼11 (FCB)의 250 mL: 13.6 m m 나트륨 구 연산 염 (trisodium), 8 mM MOPS, 18 mM MgCl2, v/v 0.4% 트라이 톤 X-100. 트라이 톤 X-100 배포 적어도 30 분 저 어.
- 필터는 0.22 μ m 비대칭 polyethersulfone (원숭이) 필터 PI 및 PWS 솔루션을 소독. 진공 제어 여과 단위를 사용 합니다.
-
106 µ m 메쉬 필터 lysed protoplasts에 대 한 준비. 그러나 정지 106 µ m 필터를 통해 전달의 모든 메서드를 사용할 수 있습니다 컬렉션 튜브에 직접 중첩 될 수 있습니다 microcentrifuge 튜브 1.5 mL를 준비 합니다.
참고:이 할 필요가 없습니다 살 균 수 없습니다.- 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 사용 하는 경우 각 microcentrifuge 튜브 끝에서 1cm를 잘라. 뜨거운 접시 또는 다른 열 소스 열을 사용 하는 1 c m2 조각 106 µ m 강철 알루미늄 호 일의 조각에 메쉬. 그들은 융합 될 때까지 망상으로 튜브의 컷된 끝을 누르십시오.
- 워시 감자 샘플 수를 모든 토양 및 파편 제거.
참고: 결 절 크기와 나이 실험의 목적에 적절 해야 하지만 결과의 품질에 영향을 하지 않는 것. 우리는 냉장 (4 ℃, 95 %RH)에서 최대 8 개월 tubers을 성공적으로이 프로토콜을 적용 했습니다. 결함 (예: 결 절 끝 썩 음, 빈 마음, 갈색 괴 지역) tubers 반응이 있을 수 있습니다, 그들은 피해 야 한다, 만약에 가능 하다.
2. 주 1: Plasmolyze 결 절 조직
참고: 제어 잎 샘플을 protoplasts를 생산 하거나 원유 준비 선호는 5.2 단계에서 여기 포함할 수 있습니다. 이 살 균 도구 층 류 두건 등 무 균 환경에서 수행 되어야 합니다.
- 표면 소독 적어도 5 분 동안 75% 에탄올에 침수를 통해 감자 괴 경.
- 에탄올에서 tubers을 제거 하 고 건조 한 공기. 이 일반적으로 결 절 100 g 보다 크면 ~ 5 분, 더 이상 걸립니다.
- 준비 하 고 각 샘플 및 필터의 aliquot 15 mL에 대 한 레이블 살 균 50 mL 원뿔 튜브 각 PIS를 소독.
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약 1 cm3 소독된 tubers 소독된 메스 또는 코르크 송곳을 사용 하 여에서 원하는 조직 샘플.
참고: 샘플링 되는 조직에 따라 하나 사용할 수 있습니다 소독된 코르크 송곳 이나 칼/메스. 예를 들어, 경우는 속 코르크 송곳은 괴 경의 선단부에는 꼭대기에서 코어를가지고 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 코어의 중앙 분수를 샘플링할 수 있습니다. 그러나, 감자 괴 경의 비대칭 내부 형태 때문 수 있습니다 샘플 실질을 더 정확 하 게 나는 결 절을 등분 하 고 원하는 조직을 절 개 하 여 피 질. 내부 결 절 형태학의 묘사에 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.- 개의 조직 소독된 메스를 사용 하 여 PI를 포함 하는 원뿔 튜브에 전송 조직과 약 3 m m3 조각으로 잘라. 4 ° c.에서 밤새 품 어
참고: 이것은 표면적을 극대화 하기 위해 되도록 PIS, 그리고 나중에 효소 솔루션 보다 완벽 한 소화에 따른 조직 침투 완전히 수 있습니다.
- 개의 조직 소독된 메스를 사용 하 여 PI를 포함 하는 원뿔 튜브에 전송 조직과 약 3 m m3 조각으로 잘라. 4 ° c.에서 밤새 품 어
그림 1: 감자 괴 경의 내부 형태. 서 (P)와 perimedullary 실질 (오후)의 구분은 검은 선으로 나와 있습니다. 피 질 (C)에서 실질 분리 관 반지 검은색 화살표와 함께 표시 됩니다. Stolon 끝 (S) 및 결 절 눈 (E)으로 표시 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
3. 주 2: 생성 감자 Protoplasts
참고:이 살 균 도구 층 류 두건 등 무 균 환경에서 수행 되어야 합니다.
- 준비 및 필터링 (0.45 μ m 원숭이 필터) 효소 솔루션 (ES)의 적절 한 금액 (10 mL/샘플): 0.71 M 마 니 톨, 3mm CaCl2, 1mm KH2포4, 1 mM MgCl2, 4% Onozuka R-10 cellulase, 0.8% macerozyme R-10, 1 %hemicululase, 10 mM MES 버퍼, pH 5.8입니다. 이 단계에서 적절 한 필터 사용 됩니다 확인 필터 크기 0.45 μ m 하는 경향이 원숭이 같은 낮은 단백질 바인딩 막 여과 동안 효소의 손실을 최소화 하는 반면 막힘 보다 작은 기 공.
- 원뿔 관 살 균 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 샘플에서 PIS에서 발음.
- 10 mL에 각각 샘플링 하 고 반전의 추가 2-3 번.
- 180 rpm 수평 동요와 29 ° C에서 하룻밤 샘플을 품 어. 적어도 16 h에 대 한 샘플을 품 어.
4. 주 3: 베스트 Protoplasts, 워시 Protoplasts
참고: 무 균 상태는 더 긴 필요한이 시점에서.
- 통에서 샘플을 제거 하 고 ~ 10 분에 정착 하도록 허용.
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많은 가능한 ES 솔루션에서 발음.
- 혈 청 학적인 피 펫, 소화 조직을 제거 하지 않도록 주의 복용 가능으로 ES 솔루션의 제거.
- Micropipette 제거를 사용 하 여 모든 나머지 ES 솔루션 다시 피하는 소화 조직. 이것은 가장 쉽게 소화 조직 하단에 남아 있는 동안 뚜껑으로 ES 솔루션 흐름 있도록 각도에서 튜브를 개최 하 여 이루어집니다.
- 각 샘플에 PWS의 15 mL를 추가 하 고 부드럽게 반전 2-3 번. Protoplasts 10 분을 위한 정착를 허용 합니다.
- 혈 청 학적인 피 펫 사용 PWS를 제거 합니다. 어떤 남아 있는 액체를 제거 하는 micropipette를 사용 합니다.
참고:이 단계는 cytometry 동안 샘플 핵의 무결성을 보장 하기 위해 절대적으로 중요 한. 문제 해결이 단계 샘플에서 실패의 확률이 소스가 된다는 것을 발견 되었다.
5. 주 3: Cytometry에 대 한 샘플 준비
참고: 샘플 보관 한다 여기에서 얼음 달리 언급 하지 않는 한.
- Propidium 요오드 화물 (0.4 mg propidium 요오드 화물/mL FCB) 및 RNase 솔루션 준비 (RNase A 0.8 mg / mL FCB) FCB에 각각 용 해 하 여.
주의: Propidium 요오드 화물은 매우 독성이 있습니다. 피부 또는 눈 접촉을 피하십시오. 적절 한 보호구를 착용 하십시오. -
얼음의 1.5 mL를 추가 각 샘플에 차가운 FCB. 짧게 동요 또는 소용돌이 헤어 각 샘플 집계 조직. 그것은 결 절 조직의 덩어리 헤어는 FCB 수 있습니다 완벽 하 게 세포를 침투 하 고 핵을 해제 해야. 다른 샘플은 조직 및 유전자 형에 따라 동요 더 많거나 적게 필요할 수 있습니다.
참고: 있는 FCB lyses protoplasts, 핵 방출. 따라서 유지의 필요성 저하를 방지 하기 위해 얼음에 샘플링 합니다.- 제어 흐름 cytometry 샘플 원생 동물 생성 단계에 포함 되지 않은 경우 그들은 수 있습니다 포함 될 여기. 컨트롤을 추가할 경우 잘게 얼음의 1.5 ml에서 작은 잎 (2~ 3 cm)를 잘라 면도날을 사용 하 여 차가운 FCB. 컨트롤 샘플 실험 샘플, 가급적 이면 동일한 유전자 형으로 동일한 ploidy 이어야 한다. 생체 외에서 plantlets 온실 또는 필드에서 재배 식물 보다 청소기 봉우리에 게 경향이 있다.
-
FCB/조직 서 스 펜 션의 1 mL 106 µ m 메쉬 필터를 통해 전달 합니다. 팁 잘라 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 사용 하 고 단계 1.5.1에서에서 설명한 금속 메쉬 바닥에 녹아. 이 microcentrifuge 튜브 2 mL microcentrifuge 튜브에 직접 중첩 될 수 있습니다 하 고 예제를 통해 직접 전달. 여과의 다른 메서드를 사용 하는 filtrate는 얼음 처럼 차가운 페 트리 접시에 수집 하 고 2 mL 튜브에 전송 수 있습니다.
참고: 때로는 나머지 집계 및 세포질 파편 수 방해할 메쉬 필터. 이 경우에, 단순히 탭 두 개의 중첩 된 microcentrifuge 튜브 몇 번 파편 꺼내 려. - 각 샘플에 RNase 솔루션의 250 µ L를 추가 합니다. 반전 하 고 실 온 (RT)에서 30 분 동안 품 어.
참고:이 단계는 cytometry 동안 더 적은 소음으로 이어지는 샘플에서 RNA를 제거 하기 위한 것. 그러나, 핵은 단명, 연구원 부 화 시간을 줄이거나 얼음에 수행 하는 그들은 그들의 샘플의 심각한 저하를 발생 하는 경우를 결정할 수 있습니다. - 각 샘플을 propidium 요오드 화물 해결책의 125 µ L를 추가 합니다. 반전 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.
참고: 샘플 cytometry 빨리 저하는 분명 얼음에도 2 시간 이내 가능에 대 한 사용 해야 합니다.
6. 주 3: Cytometry 감자 괴 경 핵의
참고: 흐름 cytometer 작업 및 소프트웨어 악기 및 제조업체에 따라 달라 집니다. 악기의 사용자 가이드에서 교류 cytometer의 특정 작업에 대 한 자세한 지침을 제공 합니다.
- 두 점 플롯 사이드 분산형 및 propidium 요오드 화물 (PI) vs 사이드 분산형 대 앞으로 분산형의 눈금을 사용 하 여 만듭니다. 또한 x 축에 PI와 히스토그램을 만듭니다. 눈금 되도록 모든 이벤트 규모 내에서 핵 형광에 훨씬 다 수 필요 합니다.
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알려진된 컨트롤 샘플 튜브를 로드 하 고 모든 이벤트에는 전압 조정. 생체 외에서 잎 조직 샘플 유전자 형에서 사용합니다. 다른 ploidies의 샘플 실행 될 경우, 각 컨트롤 샘플 포함 되어야 합니다.
- 적어 2 C 피크의 채널 컨트롤 샘플에서. 실험 샘플의 2 C 봉우리 같은 위치에 빠지게 한다.
- 실험 (결 절) 샘플을 로드 하 고 다시 모든 이벤트 규모는 확인 합니다. 만약 조정 필요, 반복 단계 2 C의 채널을 식별 하기 위해 6.2 봉우리.
- 수동으로 게이트 측 점도 vs 파이 사용 하 여 원생 동물 핵.
- 문이 원생 동물 핵 지역 표시 PI 히스토그램을 설정 합니다.
- 각 샘플에서 이벤트에 대 한 원하는 수를 수집 합니다. 자주 연구원 cytometry; 10000 문이 이벤트 사용 그러나 우리는 더 많은 샘플 및 샘플 낮은 농도 맞게 괴 원생 동물 샘플에 대 한 2000 이벤트를 사용 합니다.
- 다음 수식을 사용 하 여 PI 히스토그램에서 각 샘플의 EI를 계산.
EI =
4 C 4 C (endoreduplication의 단일 라운드 대표)는 핵의 백분율은, 8 C 8 C 고 등 비율입니다. 그림 4 에 대 한 히스토그램의 예과 봉우리의 C 값을 참조 하십시오.
Representative Results
Protoplasts의 생산
Protoplasts의 세대에서 감자 괴 경의 일반적인 형태는 그림 1에 표시 됩니다 반복 흐름 cytometry 결과 얻을 필요가 있다. 연구원은 특히에 문제 해결이 필요한 고품질 protoplasts는 FCP의 추가 전에 생산 되어 확인 하실 수 있습니다. protoplasts의 대부분 최소한의 돌출 (그림 2)와 구형 이어야 하며 반사이에서 차이 아마도 크기에서 크게 다를 수 있습니다.
그림 2: 대표 잎 및 괴 경 protoplasts에서 취득 단계 프로토콜의 4.4. 격리 된 protoplasts 구형 그대로 플라즈마 막으로 대칭 이어야 한다. Endoreduplication의 다른 수준을 나타낼 수 있습니다 있는 조직 내의 크기 차이 뿐만 아니라 잎 (A-C) 및 괴 경 (D, E) protoplasts의 크기 차이 note Amyloplasts 결 절 protoplasts 내에 표시 되는 반면 리프 protoplasts 엽록체를 포함 합니다. 스케일 바 = 1000 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
교류 cytometry 결과의 평가
성공 또는 실패 한 실험의 봉우리와 교류 cytometry 히스토그램에서 그들의 별거의 폭에서 gauged 수 있습니다. 측정 endoreduplication 필요로 각 피크에 핵의 관계 되는 풍부를 계산, 봉우리의 단순한 유무 그들 사이의 의미 있는 경계를 그리려면 너무 많은 소음이 있다면 충분 하지 않습니다. 그림 3 연구자 교류 cytometry 점도 히스토그램에서 발생할 수 있습니다 결과에 변화를 표시 합니다. 실패 한 샘플에 대 한 잠재적인 원인은 토론 내에서 표시 됩니다.
그림 3: 대표적인 결과 그대로의 원생 동물 핵의 cytometry에서 얻은 고 속 샘플 저하. 그대로 핵 (A) 각 소프트웨어를 사용 하는 적절 한 반면 봉우리 저하 샘플 (B)에 이동 하 고, 넓고 겹치는 기지에서 셀의 관계 되는 풍부를 계량 봉우리 사이 청결 한 별거를 표시 합니다. 그대로 (C)와 저하 (D) 샘플의 scatterplots, 블랙 박스 핵 이벤트 게이팅 히스토그램 및 이벤트의 클러스터링에 대 한 히스토그램 봉우리의 폭에 반영 됩니다 나타냅니다. 성문 밖에 서 이벤트는 파편, 심각 하 게 저하 핵, 또는 기타 집계를 나타냅니다. PI-H는 임의의 단위로 측정 되는 형광의 강도에 해당 합니다. 텍스트 내에서 샘플 저하를 방지 하기 위해 문제 해결 방법은 설명 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Endoreduplication 차이 조직
이전 우리는 괴 경 속 조직 수준이 상당히 큰 endoreduplication의 피 질 조직16보다 보고. 확인 하 고 우리가 endoreduplication 수준 cv 등.에 3 개의 다른 조직에서 보였다이 확장: 속, perimedullary 실질과 피 질, 샘플 당 2, 000 문이 이벤트와 3 중에서 복제. 우리의 결과 우리의 이전 관측 속 조직은 1.79 1.12 endocycles의 방법으로 대뇌 피 질의 조직 보다 훨씬 큰이 셀 당 각각 확인 (p = 0.018; 학생의 t-테스트)입니다. 약간 의외로, 실질 조직 피와 유사한 프로필을 설명 되었고 또한 속 조직에서 크게 다른 (뜻 = 1.14; p = 0.013; 학생의 t-테스트)입니다. 이러한 결과 그림 4에 요약 되어 있습니다.
그림 4: cv. 등의 세 조직에 Endoreduplication. 히스토그램의 리프 (A), 괴 경 피 질 (B), 실질 (C), 고 수 (D) 조직을 그 히스토그램에서 계산 되는 EI 값과 함께 표시 됩니다. 각 피크를 구성 하는 핵의 관계 되는 풍부에 차이 잎 및 괴 경 조직 사이 특히 예가 있습니다. C-각 피크에 대 한 값도 표시 됩니다. PI-H는 임의의 단위로 측정 되는 형광의 강도에 해당 합니다. 이 결 절 조직의의 비교 e 별표 상당한 차이 나타냅니다 표시 됩니다 의미 (p < 0.05) 오차 막대 표시 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
결 절 크기와 ploidy의 영향
우리는 이전, 주어진된 유전자 형에 대 한 다른 크기 그러나 유사한 성숙의 tubers 표시 하지 않았다이16에 해당 차이 보고 했다. 우리는이 결과 확인 하 고 ploidy와 endoreduplication 사이의 관계를 평가 목적입니다. 이 실험을 위해 사용 하는 세 가지 다른 genotypes에서 실질 조직의 3 개의 복제: cv 등. (4 배), VT_SUP_19 (2 x) cv. 우수한 prickle 수 분17, 및 VT_SUP_19에서에서 두 배로 dihaploid는 4 x 추출는 dihaploid입니다 18 VT_SUP_19 isogenic입니다. 우리 대형 (90-130 g)와 작은 대 한 복제 집합을 포함 (< 35 g) cv. 우수한 다른 두 genotypes 위한 tubers 90-130 g 동안에 tubers. 괴 경을 했다 모든 전체 완성도, 즉 식물 재배 온실에서가 걷이 식물의 꼭대기 했다 senesced. 우리 VT_SUP_19 및 그것의 시 조 등의 중요 한 차이 관찰 (p = 0.04); 그러나, VT_SUP_19와 VT_SUP_19 사이의 큰 차이 없었다 4 x (p = 0.69). 이 가능성이 유전자 구성 요소 게놈 감소에 의해 마스크로 endoreduplication 하는 동안 그것은 하지에 의해 규정 ploidy, 적어도이 배경에서 나타냅니다. 마지막으로, 우리 다시 한번 관찰 크고 작은 cv. 사이 상당한 차이가 우수한 tubers 그림 5에서 같이.
그림 5: cv. 우수 (VT_Sup_19) 2 중 및 tetraploid의 tubers의 2 개 크기에서 Endoreduplication (VT_Sup_19 4 x) 파생 상품. 가로 막대형 차트 표시 작은 평균 (< 35 g)과 대형 (90-130 g) cv. 우수한 tubers 뿐만 아니라 dihaploid VT_SUP_19와 isogenic 두 배로 dihaploid VT_SUP_19의 대형 (90-130 g) tubers 4 x. 중요 한 차이 (p < 0.05) 연결 편지 보고서에 표시 됩니다. 오차 막대는 표준 편차를 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기에 소개 하는 프로토콜 연구원 감자 괴 경, 그 수정된 휴대 콘텐츠 및 증가 겉보기 크기를 셀 내에서 endoreduplication를 평가 하는 수단으로 배제 다른 흐름 cytometry 준비를 제공 합니다. 프로토콜을 핵 무결성을 유지 하면서 잡음과 파편을 줄이기 위해 수단으로 원생 동물 세대에 의존 합니다. 이전, 연구는 비슷한 준비 특히 다루기 어려운 흐름 cytometry 샘플에 대 한 설명 뿐 아니라 pathogenesis19,20등의 다양 한 연구 결 절 protoplasts를 활용. 그러나, 우리의 지식, 아무도 cytometry endoreduplication 공부 목적으로 이러한 괴 경 protoplasts 사용 하 여를 결합 했다. 또한, 우리는 일반적인 원유 준비 뿐만 아니라 기술 활용 두 결 절 endoreduplication6,7을 평가 하기 위해 다른 연구 보다 더 신뢰할 수 protoplasts의 사용을 발견. 여기 우리는 프로토콜, 그것의 실행 및 샘플 준비, 그리고 그것을 채택 하는 전형적인 실험의 결과에서 잠재적인 함정의 단점을 논의.
유틸리티 및 결 절 흐름 cytometry 프로토콜의 반복성에 불구 하 고 그것은 의논 해야 합니다 몇 가지 약점에는. 시작 하려면, 프로토콜은 시간 집중, 두 하룻밤 외피를 요구 이다. 또한, 프로토콜 일부 비싼 시 약을, 특히 cellulase 및 macerozyme 필요합니다. 또한, 준비는 매우 민감한, 굴욕적인 몇 시간 많은 이벤트는 원하는 경우에 특히 하루, 내 처리량을 제한할 수 있습니다. 마지막으로, 프로토콜, 신뢰할 수 있는, 하는 동안은 민감한 오류 샘플 준비는 모두 핵 및 낮은 질 결과 손상 될 것을. 예를 들어 미생물 오염 plasmolysis 및 원생 동물 생성 단계 중 (1-3.4) 부적 절 한 무 균 기법으로 인해 발생할 수 있습니다. 항상 샘플의 성공을 제외 하는 동안 샘플 오염 극적으로 얻은 히스토그램, 다시 손상 가능성이 높습니다 때문에 핵의 품질을 감소 것으로 보인다.
앞에서 설명 했 듯이 프로토콜의 주요 단점은 비용, 시간 및 오류에 대 한 감도 있습니다. 연구팀은 이들 각각을 완화 하기 위해 조치를 취할 수도 있습니다. 비용에 관해서는 연구원은 많은 샘플을 프로토콜을 적용 하려는 다른 조직으로 효소 농도 및 소화 단계의 기간 수정 고려할 수 있습니다 그리고 genotypes 응답에서 다를 수 있습니다. 필터링의 가능성을 포함 하는이 고 그러나 입증 되었습니다 이전 ES 재활용 여기21. 시간, 우리의 관측에서 그것은 첫 번째 외피 (plasmolysis 단계)로 분배 하 고 여전히 protoplasts; 추출 가능 그러나, 그들의 무결성과 풍부한 겪을 것 이다,이 결과 부정적인 영향을. 샘플의 악화를 줄이기 위해 연구자 교류 cytometry 방법을 일부 샘플 무결성22를 보존 하기 위해 fixatives (예, 포름알데히드)의 사용을 포함을 고려할 수 있습니다. 이 모두 악화를 방지 하 고 샘플 저장 보다는 원생 동물 위하여 및 흐름 cytometry 제시로 같은 날에 발생에 대 한 허용 하는 유용한 수단을 수 있습니다. 핵의 마 멸을 방지 하는 다른 수단 ES / FBC; nuclease 억제제를 포함 될 수 있습니다. 2-mercaptoethanol 영향을 개발 하는 동안 눈에 띄는 변화가 없다, 하는 동안 다른 억제제 여기 테스트 되지 있다.
우리의 관찰, 하나의 가장 중요 한 단계에서는 교류 cytometry 버퍼 (FCB)의 추가 하기 전에 모든 plasmolysis 세척 솔루션의 4.4, 제거 단계입니다. 경우에 작은 볼륨 (< 10 µ L) 남아, 샘플은 가난한 사람이 나 심지어 실패 한 샘플으로 이어질 수 있는 저하 될 가능성이 훨씬 더. 이것은 효소 솔루션 내에서 불순물으로 인해 (예: nucleases, 프로 테아 제)23,24 신속 하 게 낮은 농도 에서도 샘플 실행 사이의 시간과 인큐베이션 기간 동안 핵을 저하. 또 다른 중요 한 고려 사항은 PI와 RNase 인큐베이션 단계의 기간입니다. 프로토콜에서 설명 했 듯이 샘플 남아 있지 않도록 안정적인 연구원은 더 많은 샘플 또는 긴 cytometry에 맞게이 단계 기간을 줄이기 위해 결정할 수 있습니다 FCB의 추가 실행 낮은 핵에서 발생 후 몇 시간에 대 한 농도입니다. 이 또한 샘플 당 이벤트 수와 실행할 수 또는 앞서 언급 했 듯이 fixatives의 사용을 고려 하는 샘플의 총 수 간의 거래를 고려 하는 연구원을 필요 합니다.
조직 및 Genotypes 차이점
프로토콜의 결과 대표를 제공 하기 위해 우리 조직에 의해 이전에 보고 된 변화를 확인 하 고 ploidy 및 유전자의 영향을 검사 하는 두 간단한 실험 설계 되었습니다. 조직 실험의 결과 서 조직 다시 한번 높은 EI를가지고 발견 프로토콜 재현성 결과 얻을 보여 줍니다. 했다 이전 평가 되지, 다소 의외로 실질 조직이 값을 비슷한 대뇌 피 질의 조직 및 속 보다 훨씬 낮은 했다. 실질 세포는 성숙에 일반적으로 힘 또는 대뇌 피 질의 세포 보다 큰 적어도 이것은 예상 이었다. 1 개의 가능한 설명은 tubers (90-130 g) 너무 완벽 하 게 확장 하 고 그들의 최대 C 값25를 도달 성숙에 결 절 볼륨의 대부분을 구성 하는 실질 세포에 대 한 성숙 되지 않은 것입니다. 이 또한 이유를 설명할 수 있습니다 dihaploid (VT_SUP_19)와 두 배로 dihaploid (VT_SUP_19 4 x) cv. 우수한 tubers; 보다 상당히 큰이 시연 동안 대략 동등한 크기의 tubers 각 유전자 형에서 샘플링 된, VT_SUP_19 또는 isogenic tetraploid tubers의 최대 크기는 뿌리의 그것 보다 훨씬 더 작은 이다. 따라서, 그것은 그들이 단순히 큰이 표시 된 있을 수 있습니다 그들은 그들의 최대 달성 가능한 크기를 기준으로 큰 있기 때문에. 또는, 차이 VT_SUP_19의 tetraploid 조상에서 받은 유전자 보충의 결과 수 있습니다. 또 다른 가능성은 게놈 감소는 dihaploid의 추출에는 tetraploid에서 발생 한 높은26에 기여할 표시 되었습니다 또한 플랜트 전반의 스트레스에서 발생 하는 해로운 대립을 마스크 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 심사 연구원 genotypes 사이 특히 EI 값의 비교에 사용할 tubers 및 조직 선택할 때를 고용 해야 합니다 보여 줍니다.
미래의 응용 프로그램
이 문서에서 설명 하는 프로토콜 이해 endoreduplication 감자에 대 한 연구를 중요 한 도구를 제공 합니다. 그것은 endoreduplication의 유전 및 환경 구성 결 절 조직 개발의 시간 과정 및 자연 변이의 평가 연구에 대 한 수 있습니다. 궁극적으로, endoreduplication 감자 개선, 사업 평가의 신뢰할 수 있는 수단 필요 합니다에 대 한 유망한 표적을 만들 수 있습니다.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 과학 재단 수상 번호 1237969, "Heterozygosity, 유전자 구성 및 감자의 복사 번호 유사 분열"에 의해 투자 되었다 그리고 USDA 특별 부여 2014-34141-22266 (메인의 대학) 버스를
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
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