Summary
Protokollen beskrevet her er en metode for å måle endoreduplication innen knoller av potet (Solanum tuberosum). Det inkluderer plasmolysis og protoplast utvinning skritt for å redusere støy og rusk i nedstrøms flyt cytometric analyse.
Abstract
Endoreduplication, replikering av en celle kjernefysiske genomet uten påfølgende cytokinesis, gir celler med økt DNA innhold og er forbundet med spesialisering, utvikling og økning i mobilnettet størrelse. I planter synes endoreduplication å lette vekst og ekspansjon av visse vev og organer. Blant dem er tuber potet (Solanum tuberosum), som gjennomgår betydelige mobilnettet ekspansjon i oppfyller sin funksjon karbohydrater lagringsplass. Dermed kan endoreduplication spille en viktig rolle i hvordan knoller er i stand til å betjene denne overflod av karbon. Imidlertid mobilnettet rusk fra råolje kjernefysiske isolasjon metoder for knoller, metoder som kan brukes effektivt med blader, utelukker estimering av tuber endoreduplication indeksen (EI). Denne artikkelen presenterer en teknikk for å vurdere tuber endoreduplication gjennom isolering av protoplasts mens demonstrere representant resultatene innhentet fra ulike genotyper og compartmentalized tuber vev. De store begrensningene av protokollen er tid og reagens kostnader kreves for eksempel forberedelse samt relativt korte levetid av prøver etter lysis av protoplasts. Protokollen er følsomme for teknisk variasjon, representerer en forbedring over tradisjonelle metoder for kjernefysisk isolasjon fra disse store spesialiserte celler. Muligheter for forbedringer til protokollen som resirkulering enzym, bruk av fiksativene og andre endringer er foreslått.
Introduction
Endoreduplication er prosessen der en celle avkall typisk cellen syklus og i stedet gjennomgår en alternativ kurs utvikling består av gjentatte runder med utryddelse uten mobilnettet divisjon. Den resulterende cellen vil ha økt DNA innhold og kjernefysiske størrelse som antas å spille en rolle i mobilnettet regulering, utvidelse og spesialisering. Vanligvis må en runde med endoreduplication (kalt en endocycle) og den tilsvarende økningen i DNA innhold er forbundet med større celle volum, en observasjon som igangsatte "karyoplasmic teori" som økt DNA innhold riktig regulere en større, kanskje mer komplekse, cell1. Dette fenomenet er vanlig i høyere planter, har blitt observert i et utvalg av vev, inkludert de med strukturelle/defensiv (trichomes)2,3, nutritive (mais endosperm)4,5, og vask/lagring ( tomat skall; potet tuber)6,7,8 funksjoner. Frukt, har det blitt foreslått at endoreduplication spiller en rolle i tilrettelegge en dramatisk utvidelse av skall som gjenspeiles av negative forholdet mellom endoreduplication og frukt utviklingsmessige perioden9. For eksempel celler med DNA innhold opptil 512C (512 ganger haploid genomet) har blitt observert i tomat skall8. Videre Chevalier et al. (2014) viste at endringer i uttrykket av cellen syklus gener kan føre til økt endoreduplication nivåer i skall som så resulterer i større frukt10. Endring av gener fremme endoreduplication gir dermed et mulig mål for forbedring av biomasse eller avkastning gjennom planteforedling eller genetisk manipulasjon. Men er slik forbedring betinget av større forståelse av årsakene og konsekvensene av endoreduplication.
Endoreduplication måles ofte via flowcytometri der kjerner, utgitt i råolje vev forberedelser11, er ruges med en DNA-bindende fluorophore, som propidium iodide12 (PI). Filtrerte eksemplene sendes deretter av laseren av en flyt cytometer der utslipp bølgelengder gjelder for fluorophore kan observeres. Intensiteten av fluorescens i hver turnering (dvs. kjernen) er direkte korrelert med DNA-innholdet av partikkel. Således, ved å sammenligne en kjent standard, relative og absolutte DNA innholdet i cellene i et gitt utvalg kan beregnes. Endoreduplication indekser (EI) bestemmes ved å etablere gjennomsnittlig antall endocycles per celle i et eksempel ved å observere mobilnettet DNA innhold (C-verdi) der 1C er DNA innholdet i en haploid celle (formelen i trinn 6,7 protokollen). For eksempel i en diploide organisme er base DNA innholdet i somatiske celler 2C. Hvis et eksempel har noen celler med 4C, tilsvarende til én enkelt runde med endoreduplication eller større det ville ha en EI nær 0; men hvis nesten alle cellene er 4C i EI ville være ca 1. Men som flere runder med endoreduplication er vanlig i høyere planter observert EI verdier kan være mye større. Mens beregning endoreduplication indekser kan relativt enkelt, det krever at relative abundances av kjerner C-verdier være pålitelig ascertained som er utelukket i enkelte arter og vev (inkludert potet knoller). Det er sannsynlig at forskjeller i mobilnettet anatomi og kjemi cellevegg komposisjon13 føre disse prøvene skal gjenstridige de typiske preparater med et barberblad for å løslate kjerner direkte til riktig buffere som brukes ofte med vev som tomat skall studerer en modell for endoreduplication8.
I potet fortsatt undersøkelse av endoreduplication innen tuber begrenset til bare et par studier, kanskje skyldes delvis mangel på en protokoll som er pålitelig som nevnte råolje forberedelsene gi inkonsekvente resultater. Mens slike tilnærminger fungerer bra for blader tuber prøvene oppleve alvorlige nedbrytning og en overflod av støy i form av rusk, gjør differensiering av toppene består av kjerner med ulike C-verdier nesten umulig. Dette er kanskje på grunn av forskjeller i mobilnettet komposisjon og en overflod av mobilnettet rusk i tuber celler (f.eks. stivelse-lagring amyloplasts). For å overvinne dette hinderet, utviklet vi nylig en mer pålitelig protokoll for å skaffe skjelnes toppene i flowcytometri av potet knoller. Hyppigheten av celler i hver topp kan deretter brukes til å beregne nøyaktige endoreduplication nivåer for ulike genotyper eller annet vev som utgjør en tuber. Protokollen, som sysselsetter en modifisert protoplast utvinning metoden14,15 antecedent beskrevet tidligere flyt cytometri11, viste store variasjoner i potet slektninger, kultivarer og vev16 . Her presenterer vi protokollen i detalj ved å evaluere EI i sammenhenger av ploidy, vev og tuber størrelse.
Protocol
Merk: Det er viktig å inkludere aktuelle kontroller, vanligvis i form av blad vev av den samme ploidy som eksperimentelle prøver. Dette skyldes at 2C toppen av tuber eksempler kan være små og vanskelig å identifisere.
1. forberedelser
Merk: Løsningene her kan være forberedt på forhånd og lagret på 4 ° C, men de presenteres i de etterfølgende trinnene må gjøres frisk ved bruk.
- Gjøre et riktig volum av Plasmolysis inkubasjon løsning (PIS) (15 mL/sampling): 0.55 M mannitol, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris buffer pH 7.5 (justert med HCl).
- Gjøre et riktig volum av Plasmolysis vask løsning (PWS) (15 mL/sampling) som er identisk med PIS bortsett fra tillegg av 0.71 M mannitol.
- Ta 250 mL endret Galbraith Flow cytometri Buffer11 (FCB): 13.6 mM natriumsitrat (trisodium), 8 mM MOPPER, 18 mM MgCl2, 0,4% v/v Triton X-100. Rør i minst 30 minutter til distribuere Triton X-100.
- Filteret sterilisere PIS og PWS løsninger med filtere 0.22 µm asymmetrisk polyethersulfone (aPES). Bruke vakuum drevet filtrering enheter.
-
Forberede 106 µm mesh filtre for lysed protoplasts. Forberede 1,5 mL microcentrifuge rør som kan være direkte nestet inn i samling rør, men uansett hvordan du passerer et 106 µm filter suspensjoner kan brukes.
Merk: Dette trenger ikke å bli steril.- Hvis bruker 1,5 mL microcentrifuge rør, kuttet 1 cm tipset hver microcentrifuge rør. En varm plate eller andre varme kilde varme en 1 cm2 stykke 106 µm stål maske på et stykke aluminiumsfolie. Trykk det kutte slutten av røret i mesh til de har smeltet.
- Vaske poteter som skal avsøkes, fjerne alle jord og avfall.
Merk: Tuber størrelse og alder bør være passende for målene for eksperimentet, men synes ikke å påvirke kvaliteten på resultatet. Vi har aktivert denne protokollen for knoller som har vært i kjølelager (4 ° C, 95% RH) opp til 8 måneder. Mens knoller med defekter (f.eks tuber slutten råte, hul hjerte, brune nekrotisk områder) kan være forståelsesfull, bør de unngås, hvis mulig.
2. dag 1: Plasmolyze Tuber vev
Merk: Kontroll blad prøver kan inkluderes her for å produsere protoplasts eller på trinn 5.2 Hvis råolje forberedelser foretrekkes. Dette må utføres med sterilt verktøy i en steril miljø som laminær strømning hette.
- Overflaten sterilisere potet knoller via nedsenking i 75% etanol i minst 5 minutter.
- Fjern knoller fra etanol og lufttørke. Dette tar vanligvis ~ 5 min, lengre hvis tuber er større enn 100 g.
- Forberede og etiketten sterilt 50 mL konisk rør for hver utvalget og aliquot 15 mL filter sterilisert PIS i hver.
-
Smak på ca 1 cm3 av den ønskede sterilisert knoller sterilisert skalpell eller cork borer.
Merk: Avhengig av vev blir samplet kan man bruke en sterilisert cork borer eller kniv/skalpell. For eksempel hvis margen cork borer kan brukes til å ta en kjerne fra apikale til distale tuber og sentrale delen av kjernen kan prøves. Men på grunn av asymmetrisk interne morfologi av potet knoller, det kan være mer nøyaktig å prøve parenchyma eller cortex halvere tuber og excising ønsket vevet. Se figur 1 for en avbildning av interne tuber morfologi.- Coarsely hogge tissue benytter sterilisert skalpell i ca. 3 mm3 biter og overføring vev konisk rør som inneholder PIS. Ruge over natten på 4 ° C.
Merk: Dette er å maksimere arealet slik at PIS, og senere enzym løsningen, kan fullt gjennomsyre vev resulterer i mer komplett fordøyelsen.
- Coarsely hogge tissue benytter sterilisert skalpell i ca. 3 mm3 biter og overføring vev konisk rør som inneholder PIS. Ruge over natten på 4 ° C.
Figur 1: intern morfologi av en potet tuber. Avstanden mellom margen (P) og perimedullary parenchyma (PM) er illustrert med svarte linjer. Vaskulær ringen, som skiller parenchyma fra cortex (C) er merket med en svart pil. Stolon slutten (S) og tuber øyne (E) er merket også. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. dag 2: Generere potet Protoplasts
Merk: Dette må utføres med sterilt verktøy i en steril miljø som laminær strømning hette.
- Forberede og filtrere (0,45 µm aper filter) en passende mengde av enzymet løsning (ES) (10 mL/sampling): 0.71 M mannitol, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 4% Onozuka R-10 cellulase, 0,8% macerozyme R-10, 1% hemicululase, 10 mM MES buffer, pH 5,8. Sikre at riktig filtre brukes i dette trinnet; filtre med pore størrelse mindre enn 0.45 µm er utsatt for tilstopping mens en lav protein bindende membran, som aper, minimerer tap av enzymet under filtrering.
- Sug opp av PIS fra prøver i konisk rør med en bakteriefri serologisk pipette.
- Legge til 10 mL av ES hver og invertere 2 – 3 ganger.
- Inkuber prøver overnatting på 29 ° C med 180 rpm vannrett risting. Inkuber prøver for minst 16 timer.
4. dag 3: Harvest Protoplasts og vask Protoplasts
Merk: Aseptiske forholdene er ikke lenge nødvendig på dette punktet.
- Fjerne prøver fra shaker og tillate dem å avgjøre om ~ 10 min.
-
Sug opp av så mye av ES løsningen som mulig.
- Fjern så mye av ES løsningen som mulig med en serologisk pipette, ta vare for å unngå fjerne fordøyd vevet.
- Bruke en brønnene fjerne unngår eventuelle gjenværende ES løsning, atter fordøyd vevet. Dette gjøres enkelt ved å holde røret i vinkel slik at ES løsningen flyter mot lokket mens fordøyd vevet er nederst.
- Legge til 15 mL av PWS hvert utvalg og invertere forsiktig 2 – 3 ganger. Tillat protoplasts betale for 10 min.
- Fjerne PWS med en serologisk pipette. Bruk brønnene for å fjerne resterende væske.
Merk: Dette trinnet er helt avgjørende for å sikre integriteten til eksempel kjerner under flowcytometri. Feilsøking, ble dette trinnet funnet for å være mest sannsynlig kilde til svikt i et utvalg.
5. dag 3: Forberede prøver flowcytometri
Merk: Prøvene bør holdes på is her ikke annet er oppgitt.
- Forberede propidium iodide (0,4 mg propidium iodide/mL FCB) og RNase løsninger (0,8 mg RNase A / mL FCB) ved å løse opp hver i FCB.
FORSIKTIG: Propidium iodide er svært giftig. Unngå kontakt med hud eller øyne. Bruk passende PPE. -
Legge til 1,5 mL av is kaldt FCB til hvert utvalg. Kort riste eller vortex hver prøve å bryte opp samlet vev. Det er viktig å bryte opp klumper av tuber vev slik at at FCB kan fullt gjennomsyre cellene og slipp kjerner. Ulike prøver kan kreve mer eller mindre agitasjon avhengig av vev og genotype.
Merk: At FCB lyses protoplasts, slippe kjerner. Dermed eksempler nødvendigheten av å holde på is for å hindre nedbrytning.- Hvis kontrollen flyt cytometri prøver ikke ble inkludert i protoplast generasjon trinn kan de være med her. Hvis en kontroll er legges, Finhakk et lite blad (~ 3 cm2) i 1,5 mL av is kaldt FCB med et barberblad. Kontroll prøver bør være den samme ploidy som de eksperimentelle prøvene, fortrinnsvis den likt anleggspreg. In vitro plantlets tendens til å gi renere topper enn drivhus eller feltet dyrket planter.
-
1 mL av FCB/vev suspensjon passere en 106 µm maske filter. Bruk en 1,5 mL microcentrifuge tube spissen avskåret og metallnett smeltet nederst som beskrevet i trinn 1.5.1. Denne microcentrifuge rør kan være nestet direkte inn i en 2 mL microcentrifuge rør og prøven gått direkte gjennom. Hvis bruker en annen metode for filtrering, kan filtratet samles i en iskald Petri plate og deretter overført til en 2 mL tube.
Merk: noen ganger gjenværende Aggregatene og mobilnettet rusk kan tette maske filter. I dette tilfellet kan du tappe to nestede microcentrifuge rør noen ganger å fjerne rusk. - Legge til 250 µL RNase løsningen til hvert utvalg. Inverter og ruge i 30 min ved romtemperatur (RT).
Merk: Dette trinnet er ment å fjerne RNA fra prøvene, fører til mindre støy under flowcytometri. Men som kjerner er kortvarig, kan forskere beslutte å redusere inkubasjon tiden eller utføre det på is hvis de opplever alvorlige nedbrytning av sine prøver. - Legge til 125 µL av propidium iodide løsningen til hvert utvalg. Inverter og ruge på is 30 min.
Merk: Utvalg skal brukes for flowcytometri så snart som mulig som fornedrelse er tydelig innen 2 timer, selv på isen.
6. dag 3: Flowcytometri av potet Tuber kjerner
Merk: Flyt cytometer drift og programvare vil variere avhengig av maskinen og produsent. Detaljert informasjon om den bestemte operasjonen av flyt cytometer gis i brukerveiledningen for instrumentet.
- Opprett to dot tomter med logaritmisk skala av fremover scatter vs siden scatter og propidium iodide (PI) vs siden scatter. Også opprette et histogram med PI på x-aksen. Logaritmisk skala er nødvendig for å sikre alle hendelser er innenfor skalaen som kjerner avvike vesentlig i fluorescens.
-
Legg et kjent kontroll prøven rør og Juster spenningen slik at alle hendelser på skala. Vi bruker i vitro blad vev fra et utvalg genotype. Hvis prøver av forskjellige ploidies kjøres, bør en kontroll prøven for hver inkluderes.
- Noter av kanalen 2C toppen på kontroll prøven. 2C topper de eksperimentelle prøvene bør falle på samme sted.
- Laste inn en eksperimentell (tuber) prøve og igjen sikrer at alle hendelser er på skalaen. Hvis justeringer er nødvendig, Gjenta trinn 6.2 å identifisere kanalen 2 c topper.
- Manuelt gate protoplast kjerner bruker siden spredningsdiagram vs PI.
- Angi PI histogrammet bare skal vise gated protoplast kjerner regionen.
- Samle inn ønsket antall hendelser fra hvert utvalg. Forskere bruker ofte 10.000 gated hendelser for flowcytometri; men vi bruker 2000 hendelser for tuber protoplast prøver for å imøtekomme flere prøver og prøver med lave konsentrasjoner.
- Beregne hvert utvalg EI fra PI histogrammer ved hjelp av følgende formel:
EI =
der 4C er prosentandelen av kjerner som er 4C (som representerer én enkelt runde med endoreduplication), er 8C prosentandelen som er 8C, og så videre. Se Figur 4 eksempler på histogrammer og C-verdier på toppene.
Representative Results
Produksjon av protoplasts
Generering av protoplasts er nødvendig for å oppnå repeterbare flyt cytometri resultater fra potet knoller, generelle morfologi som vises i figur 1. Forskere kan ønske å sikre høy kvalitet protoplasts har blitt produsert før tilsetning av FCP, spesielt i tilfelle at feilsøking er nødvendig. Fleste av protoplasts skal sfæriske med minimal utstikkende deler (figur 2) og kan variere betraktelig i størrelse, som er kanskje gjenspeiler forskjeller i EI.
Figur 2: representant blad og tuber protoplasts kjøpt til trinn 4.4 av protocol. Isolerte protoplasts skal sfærisk og symmetriske med plasma membranen intakt. Merk størrelsen forskjellen mellom blad (Vekselstrøm) og tuber (D, E) protoplasts, i tillegg til forskjellene i størrelse innenfor en vev som kan tyde på ulike nivåer av endoreduplication. Blad protoplasts inneholde chloroplasts mens amyloplasts vises i tuber protoplasts. Skalere barer = 1000 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Evaluering av flyt cytometri resultater
Suksess eller fiasko for et eksperiment kan avleses fra bredden på topper og deres atskillelse i flow cytometri histogrammer. Som måler endoreduplication krever beregne relative overflod av kjerner i hver topp, er tilstedeværelse eller fravær av toppene utilstrekkelig hvis det er for mye støy å trekke meningsfull grenser mellom dem. Figur 3 viser variasjon i resultatene forskere kan oppstå både i flyt cytometri scatter tomter og histogrammer. Mulige årsaker for mislykket prøver presenteres i diskusjonen.
Figur 3: representant resultatene innhentet fra flowcytometri av protoplast kjerner av intakt og degradert margen prøver. Intakt kjerner (A) vise rent skille mellom toppene å kvantifisere relative overflod av celler i hver bruker riktig programvare mens topper i dårligere prøver (B) vise skiftet, bredt og overlappende baser. I scatterplots av intakt (C) og degradert (D) prøver angir svarte bokser kjernefysiske hendelsen gating histogrammer og klynger av hendelser gjenspeiles i bredden på histogrammet toppene. Hendelser utenfor porten angir rusk, sterkt forringet kjerner eller andre mengdefunksjoner. PI-H tilsvarer intensiteten av fluorescens som måles i vilkårlig enheter. Feilsøkingsmetodene for å hindre eksempel nedbrytning diskuteres i teksten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Endoreduplication forskjellene mellom vev
Tidligere rapportert vi at tuber margen vev har betydelig større endoreduplication enn cortex vev16. Å bekrefte og utvide dette vi så på endoreduplication nivåer av tre ulike vev i cv. Superior: margen og perimedullary parenchyma cortex, replikert i tre eksemplarer med 2000 gated hendelser per prøve. Våre resultater bekreftet vår tidligere observasjon at margen vev har betydelig større EI enn kortikale vev med hjelp av 1,79 og 1,12 endocycles per celle, henholdsvis (p = 0.018; Student t-test). Noe overraskende, parenchyma vevet vist en profil ligner på cortex og var også signifikant forskjellig fra margen vev (mener = 1.14; p = 0.013; Student t-test). Disse resultatene oppsummeres i Figur 4.
Figur 4: Endoreduplication i tre vev av cv. Superior. Histogrammer blad (A), tuber cortex (B), parenchyma (C) og marg (D) vev vises sammen med EI verdien beregnet fra disse histogrammer. Forskjellene i relative overflod av kjerner bestående av hver topp er åpenbart, særlig mellom blad og tuber vev. C-verdier for hver topp vises også. PI-H tilsvarer intensiteten av fluorescens som måles i vilkårlig enheter. Mener sammenligninger av EI tuber vev vises i E der stjerne angir betydelig forskjell (p < 0,05) og viser standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Påvirkning av tuber størrelse og ploidy
Vi har tidligere rapportert at for en gitt genotype, røttene av forskjellige størrelser, men lignende modenhet ikke vise en tilsvarende forskjell i EI16. Vi som mål å bekrefte dette resultatet, samt vurdere forholdet mellom ploidy og endoreduplication. For dette eksperimentet, vi brukte tre gjentak parenchyma vev fra tre ulike genotyper: cv. Superior (4 x), VT_SUP_19 (2 x) som er en dihaploid Hentet fra cv. Superior pigg pollinering17og VT_SUP_19 4 x som er en doblet dihaploid 18 isogenic å VT_SUP_19. Vi inkluderte gjentak for store (90-130 g) og små (< 35 g) knoller for cv. Superior mens knoller for de andre to genotyper var 90-130 g. Knoller var alle høstet fra drivhus vokst planter ved full modenhet, dvs topper av planter hadde senesced. Observerte vi en betydelig forskjell mellom VT_SUP_19 og sin stamfar Superior (p = 0,04); men det var ingen signifikant forskjell mellom VT_SUP_19 og VT_SUP_19 4 x (p = 0.69). Dette indikerer at mens det er en sannsynlig genetisk komponent til endoreduplication, som avslørt av genomisk reduksjon, det ikke er diktert av ploidy, minst i denne bakgrunn. Til slutt, vi igjen observert ingen betydelige forskjeller mellom store og små cv. overlegen knoller som vist i figur 5.
Figur 5: Endoreduplication i to størrelser av knoller av cv. Superior og diploide (VT_Sup_19) og tetraploid (VT_Sup_19 4 x) derivater. Stolpediagrammet viser middelverdien for små (< 35 g) og stor (90-130 g) cv. overlegen knoller samt store (90-130 g) knoller av dihaploid VT_SUP_19 og den isogenic doblet dihaploid VT_SUP_19 4 x. Betydelige forskjeller (p < 0,05) angis av koble brev rapporten. Feilfelt viser standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen presenteres her gir forskere med å vurdere endoreduplication i potet knoller, som endret mobil innhold og økt celle størrelsen tilsynelatende utelukke andre flyt cytometri preparater. Protokollen er avhengig av protoplast generasjon å redusere støy og rusk samtidig kjernefysiske integritet. Tidligere har forskere beskrevet lignende forberedelser for spesielt gjenstridige flyt cytometri eksempler som benyttet tuber protoplasts å studere en rekke temaer som patogenesen19,20. Men til vår kunnskap, har ingen kombinert bruk av slike tuber protoplasts med flowcytometri for å studere endoreduplication. Videre fant vi bruk av protoplasts å være mer pålitelig enn vanlig råolje forberedelser samt teknikken benyttes i to andre studier for å vurdere tuber endoreduplication6,7. Her diskuterer vi svakhetene i protokollen, potensielle fallgruver i gjennomføring og prøve utarbeidelse, og resultatene av et typisk forsøk som bruker den.
Til tross for det verktøyet og repeterbarhet tuber flyt cytometri protokollen har det noen svakheter som bør diskuteres. For å begynne er protokollen tid intensiv, krever to overnatting incubations. Videre krever protokollen noen dyre reagenser, særlig cellulase og macerozyme. Forberedelsene er i tillegg svært tid-sensitive, nedverdigende innen noen timer, noe som kan begrense gjennomstrømning en enkelt dag, spesielt hvis mange arrangementer er ønsket. Endelig er protokollen, mens pålitelig, følsomme for feil eksempel forberedelse som synes å føre til skader i kjerner og lavere kvalitet. For eksempel kan mikrobiell forurensning oppstå under plasmolysis og protoplast generasjon trinnene (1-3,4) på grunn av uriktig steril teknikk. Eksempel forurensning, mens ikke alltid slik at suksessen til en prøve, synes å dramatisk redusere kvaliteten på innhentet histogrammer, igjen trolig skyldes skader på kjerner.
Som tidligere nevnt er de største ulempene med protokollen kostnader, tid og følsomhet for feil. Forskere kan ønske å redusere hver av disse. Som for kostnader, forskere som gjelder protokollen for mange prøver kan vurdere endring av enzymet konsentrasjoner og/eller varighet av fordøyelsen trinnet som annet vev og genotyper kan variere i respons. Dette inkluderer muligheten for filtrering og resirkulering ES som tidligere har blitt demonstrert men ikke ansatt her21. Som for tiden, i vår observasjon, er det mulig å dispensere med den første inkubering (plasmolysis trinn) og fortsatt ekstra protoplasts; men vil deres integritet og overflod lide, som negativt påvirker resultatene. For å redusere forverring av prøver kan forskere vurdere at noen flyt cytometri tilnærminger innebærer bruk av fiksativene (f.eks formaldehyd) å bevare eksempel integritet22. Dette kan være en nyttig måte å både hindre forverring, og tillater for eksempel lagring i stedet for protoplast exaction og flyt cytometri forekommer på samme dag som presenteres. En annen måte å hindre slitasje av kjerner kan være med en nuclease hemmer til ES og/eller FBC; mens 2-mercaptoethanol tegnet noen merkbar endringer under utvikling, har andre hemmere ikke testet her.
I vår observasjon er den mest kritiske enkeltsteg trinn 4.4, fjerning av alle plasmolysis vaskeløsning før en flyt cytometri bufferen (FCB). Hvis selv en liten kvantum (< 10 µL) fortsatt, prøvene er mye mer sannsynlig å bli degradert som kan føre til en dårlig eller selv ikke prøve. Det skyldes sannsyligvis urenheter i enzym løsningen (f.eks nucleases, proteaser)23,24 raskt redusere kjerner under inkubasjon perioder og mellom eksempel kjører, selv ved lave konsentrasjoner. En annen viktig faktor er varigheten av PI og RNase inkubasjon trinnene. Som nevnt i protokollen, værende prøver ikke stabil for mer enn et par timer etter tillegg av FCB slik at forskerne kan bestemme å redusere varigheten av disse trinnene for å imøtekomme flere eksempler eller lange flowcytometri som følge av lav kjerner konsentrasjoner. Dette krever også forskeren vurdere at kompromisset mellom antall hendelser per prøve og totalt antall prøver å kjøre eller vurdere bruk av fiksativene som tidligere nevnt.
Forskjeller mellom vev og genotyper
For å gi resultater representant for protokollen utviklet vi to enkle eksperimenter for å bekrefte tidligere rapportert variant av vev og undersøke påvirkning av ploidy og genotype. Resultatene av vev eksperimentet viser at protokollen gir reproduserbar resultater, margen vev igjen fant for å ha den høyeste EI. Noe overraskende parenchyma vev, som ikke hadde tidligere blitt evaluert, hadde en EI verdi lik kortikale vev og betydelig lavere enn margen. Dette var uventede som parenchyma cellene er vanligvis større enn margen eller kortikale celler, minst ved forfall. En mulig forklaring er at knoller (90-130 g) var altfor umoden for parenchyma cellene som utgjør flertallet av tuber volum på modenhet, å ha fullt utvidet og nådd sin maksimale C-verdier25. Dette kan også forklare hvorfor dihaploid (VT_SUP_19) og doblet dihaploid (VT_SUP_19 4 x) viste signifikant større EI enn cv. overlegen knoller; mens knoller omtrent jevnstore ble valgt ut fra hver genotype, er maksimumsstørrelsen for knoller fra enten VT_SUP_19 eller isogenic tetraploid mye mindre enn stamfar. Dermed kan det hende at de vises større EI bare fordi de var større i forhold til deres oppnåelige maksimumsstørrelsen. Alternativt kan forskjellen være en konsekvens av det genetiske komplementet VT_SUP_19 mottatt fra sin tetraploid stamfar. En annen mulighet er at genomisk reduksjon som skjedde på utvinning av dihaploid fra tetraploid kan ha avslørt skadelige alleler resulterer i anlegget hele stress, som har også blitt vist å bidra til opphøyet EI26. Likevel, dette viser nøye overveielse forskerne må ansette når knoller og vev brukes til sammenligning av EI verdier, særlig mellom genotyper.
Framtidige applikasjoner
Protokollen beskrevet i denne artikkelen gir forskere med et viktig verktøy for forstå endoreduplication i potet. Det kan tillate for studier i genetiske og miljømessige komponentene i endoreduplication, tid-selvfølgelig utvikling over tuber vev og vurdering av naturlig variasjon. Endoreduplication kan til slutt gjøre en lovende mål for potet forbedring, en oppgave som krever en pålitelig måte for vurdering.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av National Science Foundation Award tall 1237969, "Unraveling Heterozygosity, allel komposisjon, og kopier nummer variant av potet" og USDA spesielle Grant 2014-34141-22266 (University of Maine) til RV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
- Wilson, E. The karyoplasmic ratio. 727, 3rd edn, The Macmillan Company. (1925).
- Szymanski, D. B., Marks, M. D. GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).
- Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).
- Grafi, G., Larkins, B. A. Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases. Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).
- Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication. Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2. Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth. Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).
- Cheniclet, C., et al. Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth. Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).
- Pirrello, J., et al. How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches. Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).
- Chevalier, C., et al. Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory. J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).
- Galbraith, D. W., et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).
- Doležel, J., Greilhuber, J., Suda, J. Flow Cytometry with Plants: An Overview. Flow Cytometry with Plant Cells. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 41-65 (2007).
- Doležel, J., Bartoš, J. A. N. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).
- Doke, N., Tomiyama, K. Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues. Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).
- Davis, D. A., Currier, W. W. The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts. Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).
- Laimbeer, F. P. E., et al. Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops. Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).
- Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination. Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).
- Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants. Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).
- Doke, N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity. Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).
- Doke, N., Tomiyama, K. Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans. Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).
- Saxena, P. K., King, J. Reuse of enzymes for isolation of protoplasts. Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).
- Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. Cytometry and flow cytometry of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants. Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).
- Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. Tissue and cell culture. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , Springer. 39-50 (2013).
- Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement. Advances in Cell Culture. Maramorosch, K. 1, Elsevier. 241-279 (1981).
- Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions. Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).
- Scholes, D. R., Paige, K. N. Plasticity in ploidy: a generalized response to stress. Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).
