Summary
Protokollet beskrivs häri är en metod för att mäta endoreduplikation inom knölar av potatis (Solanumtuberosum). Den innehåller plasmolysis och protoplast utvinning steg för att minska buller och skräp i underordnat flöde flödescytometrisk analys.
Abstract
Endoreduplikation, replikering av en cell nuclear genomet utan efterföljande cytokines, ger celler med ökad DNA-innehåll och är associerade med inriktning, utveckling och öka cellulär storlek. I växter verkar endoreduplikation underlätta tillväxt och expansion av vissa vävnader och organ. Bland dem är knölen av potatis (Solanumtuberosum), som genomgår betydande cellulära expansion uppfylla sin funktion av kolhydrat lagring. Endoreduplikationen kan således spela en viktig roll i hur knölar ska kunna rymma detta överflöd av kol. Dock den cellulära skräp som följd av rå nukleära isoleringsmetoder knölar, metoder som kan användas effektivt med blad, utgör hinder för uppskattning av tuber endoreduplikation index (EI). Denna artikel presenterar en teknik för att bedöma tuber endoreduplikation genom isolering av protoplasts medan visar representativa resultat erhålls från olika genotyper och uppdelade tuber vävnader. De stora begränsningarna i protokollet är tid och reagens kostnader krävs för provberedning samt relativt kort livslängd på prover efter lys av protoplasts. Protokollet är känsliga för teknisk variation, är det en förbättring jämfört med traditionella metoder av nukleära isolering från dessa stora specialiserade celler. Möjligheter till förbättringar i protokollet såsom återvinning enzym, användning av fixativ och andra ändringar föreslås.
Introduction
Endoreduplikationen är den process genom vilken en cell avstår typiskt cellcykeln och istället genomgår en alternativ kurs utveckling bestående av upprepade rundor av DNA-replikation utan cellulära division. Den resulterande cellen kommer att ha ökat DNA innehåll och nukleära storlek som tros spela en roll i cellulära förordning, expansion och specialisering. I allmänhet krävs en runda endoreduplikation (kallas en endocycle) och den motsvarande ökningen DNA-innehåll är associerade med större cellvolym, en observation som fälls ut i ”karyoplasmic teori” som ökade DNA-innehåll för att korrekt reglera en större, kanske mer komplex, cell1. Fenomenet är vanligt hos högre växter, efter att ha observerats i olika vävnader, inklusive de med strukturella/defensiv (trichomes)2,3, nutritive (majs frövita)4,5, och handfat och förvaring ( tomat fruktväggen; potatis knölen)6,7,8 funktioner. I frukt, har det föreslagits att endoreduplikation spelar en roll för att underlätta den snabba expansionen av fruktväggen vilket framgår av det negativa förhållandet mellan endoreduplikation och frukt utvecklande period9. Till exempel celler med DNA innehåll upp till 512C (512 gånger det haploida genomet) har observerats i tomat fruktväggen8. Vidare Chevalier et al. (2014) visat att förändringar i uttrycket av cellcykeln gener kan leda till ökningar i endoreduplikation nivåer inom fruktväggen som sedan resulterar i större frukt10. Förändring av gener att främja endoreduplikation ger således ett potentiellt mål för förbättring av biomassa eller avkastning genom växtförädling eller genetisk manipulation. Dock villkoras sådan förbättring av större förståelse av orsakerna och konsekvenserna av endoreduplikation.
Endoreduplikation mäts oftast via flödescytometri whereby kärnor, släppt i rå vävnad preparat11, inkuberas med ett DNA-bindande fluorophore, såsom propidium jodid12 (PI). De filtrerade proverna skickas sedan laser av en flödescytometer där utsläpp våglängder specifika för fluorophore kan observeras. Intensiteten av fluorescens i varje händelse (dvs, nucleus) är direkt korrelerad med DNA-innehåll av partikeln. Således, genom att jämföra en känd standard, relativa och absoluta DNA innehållet i celler i ett givet prov kan beräknas. Endoreduplikation index (EI) bestäms genom fastställande av det genomsnittliga antalet endocycles per cell inom ett prov genom att observera cellulär DNA-innehåll (C-värde) där 1C är DNA innehållet i en haploida cell (formeln i steg 6,7 i protokollet). Exempelvis i en diploid organism är bas DNA innehållet i somatiska celler 2C. Om ett prov har några celler med 4C, motsvarar en enda runda av endoreduplikation eller större skulle ha en EI nära 0; men om nästan alla celler är 4C EI skulle vara ungefär 1. Som flera rundor av endoreduplikationen är vanliga hos högre växter observerade EI värden kan dock mycket större. Vid beräkning av endoreduplikation index kan relativt enkelt, det kräver att relativa förekomsten av atomkärnor C-värden vara tillförlitligt, fastställas som är utesluten i vissa arter och vävnader (inklusive potatisknölar). Det är troligt att skillnader i cellulära anatomi, kemi eller cellväggen sammansättning13 orsaka dessa prover vara motsträviga till typiska förberedelserna med ett rakblad för att släppa kärnorna direkt till lämpliga buffertar som vanligen används en modell för endoreduplikation studier med vävnader såsom tomat fruktväggen,8.
I potatis fortfarande undersökning av endoreduplikation inom knölen begränsade till bara ett par studier, kanske beror delvis på bristande ett pålitligt protokoll som de ovannämnda rå preparat ge motsägande resultat. Medan sådana tillvägagångssätt fungerar bra för bladen upplever tuber proverna allvarliga försämringar och ett överflöd av buller i form av skräp, att göra differentiering av toppar som består av kärnor med olika C-värden nästan omöjligt. Detta är kanske på grund av skillnader i cellulära sammansättningen och ett överflöd av cellulära skräp inom tuber celler (t.ex. stärkelse-lagra amyloplasts). För att övervinna detta hinder, utvecklat vi nyligen ett mer pålitligt protokoll för att förvärva distinguishable toppar i flödescytometri av potatisknölar. Frekvensen av celler inom varje topp kan sedan användas för att beräkna korrekta endoreduplikation nivåer för olika genotyper eller olika vävnader som utgör en rotknöl. Protokollet, som sysselsätter en modifierad protoplast utvinning metod14,15 föregångaren tidigare beskrivits flöde flödescytometri11, visade stor variation inom potatis släktingar, sorter och vävnader16 . Här presenterar vi protokollet i detalj genom att utvärdera EI i sammanhangen i ploiditeten, vävnad och knöl storlek.
Protocol
Obs: Det är viktigt att inkludera lämpliga kontroller, oftast i form av bladvävnad av den samma ploiditeten som experimentella prover. Detta beror på att 2C toppen av tuber prover kan vara små och svåra att identifiera.
1. förberedelser
Obs: De lösningar som anges här kan beredda i förväg och förvaras vid 4 ° C men de presenteras i efterföljande steg måste göras färsk på dagen för användning.
- Göra en lämplig volym av Plasmolysis inkubation lösning (PIS) (15 mL/prov): 0,55 M mannitol, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris buffert pH 7.5 (justerat med HCl).
- Göra en lämplig volym av Plasmolysis tvätta lösning (PWS) (15 mL/prov) som är identiskt med PIS bortsett tillskott av 0,71 M mannitol.
- Gör 250 mL av modifierade Galbraith Flow flödescytometri buffert11 (FCB): 13,6 mM natriumcitrat (trinatrium), 8 mM moppar, 18 mM MgCl2, 0,4% v/v Triton x-100. Rör om minst 30 minuter att distribuera den Triton x-100.
- Filter sterilisera PIS och PWS lösningar med ett filter med 0,22 µm i asymmetrisk polyetersulfon (apor). Använda dammsugarfilter drivna enheter.
-
Förbereda 106 µm Nätfiltren för lyserat protoplasts. Förbereda 1,5 mL mikrocentrifugrör som direkt kan kapslas in samling rören, men någon metod av suspensioner passerar ett 106 µm filter får användas.
Obs: Detta behöver inte vara sterila.- Om du använder 1,5 mL mikrocentrifugrör, skära 1 cm från spetsen varje mikrocentrifug rör. Använder en värmeplatta eller andra värme källa värma en 1 cm2 bit 106 µm stål mesh på en bit aluminiumfolie. Tryck på den avskurna änden av röret in i maskans tills de har smält.
- Tvätta potatisen som skall provtas, ta bort all jord och skräp.
Obs: Knöl storlek och ålder bör vara lämpliga för målen i experimentet men verkar inte påverka resultaten. Vi har framgångsrikt tillämpat detta protokoll till knölarna som varit i kall förvaring (4 ° C, 95% RH) upp till 8 månader. Knölar med defekter (t.ex. tuber slut rot, ihåliga hjärta, brun nekrotiska områden) kan vara lyhörd, bör de undvikas, om möjligt.
2. dag 1: Plasmolyze knölvävnad
Obs: Leaf kontrollprover kan inkluderas här för att producera protoplasts eller på steg 5.2 om rå preparat är att föredra. Detta måste utföras med sterila verktyg i en aseptisk miljö såsom en LAF.
- Yta sterilisera potatisknölar via nedsänkning i 75% etanol för minst 5 min.
- Ta bort knölar från etanol och lufttorka. Detta tar vanligtvis ~ 5 min, längre om knölen är större än 100 g.
- Förbereda och etikett sterila 50 mL koniska rör för varje prov och alikvotens 15 mL filter steriliseras PIS i varje.
-
Prova cirka 1 cm3 av önskad vävnad från steriliserad knölar med antingen steriliseras skalpell eller kork borer.
Obs: Beroende på vävnaden som provtas man kan använda antingen en steriliserad kork borer eller kniv/skalpell. Exempelvis om märgen önskas i cork borer kan användas för att ta en kärna från den apikala till distala änden av knölen och den centrala delen av kärnan kan avsmakas. På grund av den asymmetriska inre morfologin av potatisknölar, kan det dock vara mer exakt till exempel parenkymet eller cortex av halvera knölen och excising den önskvärda vävnaden. Se figur 1 för en skildring av inre tuber morfologi.- Grovhacka vävnad med en steriliserad skalpell i ca 3 mm3 bitar och överföring vävnad till koniska rör innehållande PIS. Inkubera över natten vid 4 ° C.
Obs: Detta är att maximera ytan så att PIS, och senare enzym lösningen, helt kan genomsyra vävnaden vilket resulterar i mer komplett matsmältning.
- Grovhacka vävnad med en steriliserad skalpell i ca 3 mm3 bitar och överföring vävnad till koniska rör innehållande PIS. Inkubera över natten vid 4 ° C.
Figur 1: inre morfologi av en potatis rotknöl. Separationen mellan märg (P) och perimedullary parenkymet (PM) illustreras med svarta linjer. Kärlringen, som avskiljer parenkymet från cortex (C) betecknas med en svart pil. Stolon slutet (S) och tuber ögon (E) är märkta samt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. dag 2: Generera potatis Protoplasts
Obs: Detta måste utföras med sterila verktyg i en aseptisk miljö såsom en LAF.
- Förbereda och filtrera (0.45 µm apor filter) en lämplig mängd av enzymet lösning (ES) (10 mL/prov): 0,71 M mannitol, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 4% Onozuka R-10 cellulase, 0,8% macerozyme R-10, 1% hemicululase, 10 mM MES buffert, pH 5.8. Se till att lämpliga filter används i detta steg; filter med porstorlek mindre än 0,45 µm är benägna att igensättning medan en låg protein bindande membran, såsom apor, minimerar förlust av enzym under filtreringen.
- Aspirera off PIS från prover i koniska rör med steril serologiska pipett.
- Tillsätt 10 mL ES för varje provtagning och Invertera 2 – 3 gånger.
- Inkubera prover övernattning på 29 ° C med 180 rpm horisontella skakar. Inkubera prover för minst 16 h.
4. dag 3: Skörd Protoplasts och tvätta Protoplasts
Obs: Aseptiska förhållanden behövs inte länge på denna punkt.
- Ta prover från shaker och tillåta dem att reglera för ~ 10 min.
-
Aspirera ut så mycket av ES lösning som möjligt.
- Avlägsna så mycket av ES lösningen som möjligt med serologiska pipett, för att undvika att ta bort smält vävnaden.
- Med hjälp av en mikropipett ta bort undvika överbliven ES lösning, igen smält vävnaden. Detta görs lättast genom att hålla röret i en vinkel så att ES lösningen rinner mot locket medan smält vävnad kvar längst.
- Tillsätt 15 mL PWS till varje prov och vänd försiktigt 2 – 3 gånger. Tillåta protoplasts att bosätta sig i 10 min.
- Ta bort PWS med serologiska pipett. Använd en mikropipett för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska.
Obs: Detta steg är absolut avgörande för att säkerställa integriteten av provet atomkärnor under flödescytometri. Felsökning, befanns detta steg vara den mest sannolika källan till misslyckande i ett prov.
5. dag 3: Förbereda prover för flödescytometri
Obs: Proverna bör hållas på is här om inget annat anges.
- Förbereda propidium jodid (0,4 mg propidium jodid/mL FCB) och RNase lösningar (0,8 mg RNase A / mL FCB) genom upplösning i FCB.
Varning: Propidium jodid är mycket giftiga. Undvik kontakt med hud eller ögon. Bära lämplig personlig skyddsutrustning. -
Tillsätt 1,5 mL is kallt FCB till varje prov. Kort shake eller vortex varje prov att bryta upp samman vävnad. Det är viktigt att bryta upp klumpar av knölvävnad så att FCB kan helt genomsyra cellerna och släppa atomkärnor. Olika prover kan kräva mer eller mindre agitation beroende på vävnad och genotyp.
Obs: FCB lyserar protoplasts, släppa atomkärnor. Därav prover nödvändigheten av att hålla på is för att förhindra nedbrytning.- Om flödet flödescytometri kontrollprover inte ingick i protoplast generation steg kan de inkluderas här. Om en kontroll är att läggas, finhacka en liten blad (~ 3 cm2) i 1,5 mL is kallt FCB med ett rakblad. Kontrollproverna bör vara den samma ploiditeten som experimentella proverna, helst samma genotyp. In vitro plantlets tenderar att ge renare toppar än växthus eller fältet odlade växter.
-
Passera en 106 µm nätfiltret 1 mL av suspensionen FCB/vävnad. Använd ett 1,5 mL mikrocentrifug rör med toppen avskuren och metallnät smält till botten som beskrivs i steg 1.5.1. Detta mikrocentrifug rör kan kapslas direkt in i en 2 mL mikrocentrifug rör och provet skickas direkt via. Om du använder en annan metod för filtrering, kan filtratet samlas i en iskall Petri plattan och överförs sedan till en 2 mL tub.
Obs: ibland de återstående aggregat och cellulära skräp kan täppa till nätfiltret. I det här fallet, tryck helt enkelt på de två kapslade mikrocentrifugrör några gånger att få bort skräpet. - Tillsätt 250 µL RNase lösningen i varje prov. Invertera och inkubera i 30 min i rumstemperatur (RT).
Obs: Detta steg är avsett att ta bort RNA från proverna, vilket leder till mindre buller under flödescytometri. Dock som kärnorna är kortlivade, besluta forskare att minska inkubationstiden eller utföra det på is om de upplever allvarliga försämringar av sina prover. - Tillsätt 125 µL propidium jodid lösningen i varje prov. Invertera och inkubera på is i 30 min.
Obs: Prover bör användas för flödescytometri så snart som möjligt som nedbrytning framgår inom 2 h, ens på is.
6. dag 3: Flödescytometri av potatis Tuber atomkärnor
Obs: Flöde cytometer drift och programvara kommer att variera beroende på instrument och tillverkaren. Detaljerade instruktioner för specifika driften av en flödescytometer kommer att tillhandahållas i instrumentets User Guide.
- Skapa två dot tomter med logaritmisk skala av framåt scatter vs. side scatter och propidium jodid (PI) vs side scatter. Också skapa ett histogram med PI på x-axeln. Logaritmisk skala krävs för att säkerställa alla händelser inom skala atomkärnor kan variera kraftigt i fluorescens.
-
Fyll en känd kontrollrör prov och justera spänningen så att alla händelser i skala. Vi använder in vitro-leaf vävnad från en prov-genotyp. Om prover av olika ploidies ska köras, bör ett kontrollprov för varje inkluderas.
- Anteckna kanalen 2C topp i referensprovet. 2C topparna av experimentella proverna bör falla på samma plats.
- Ladda en experimentell (tuber) prov och igen se till att alla händelser i skala. Om justeringar krävs, upprepa steg 6,2 att identifiera kanalen 2 c toppar.
- Manuellt gate protoplast atomkärnor med sida vs PI spridningsdiagrammet.
- Ställ in PI histogrammet att bara Visa regionen gated protoplast atomkärnor.
- Samla in önskat antal händelser från varje prov. Forskare använder ofta 10.000 gated händelser för flödescytometri; men vi använder 2.000 händelser för knölen protoplast prover för att rymma fler prover och prover med låga koncentrationer.
- Beräkna varje sampels EI från PI histogram med hjälp av följande formel:
EI =
där 4C är procentuella andelen kärnor som är 4C (som representerar en enda runda av endoreduplikation), är 8C den procentandel som 8C, och så vidare. Se figur 4 exempel på histogram och C-värden av topparna.
Representative Results
Produktion av protoplasts
Generering av protoplasts är nödvändigt för att uppnå repeterbara flöde flödescytometri resultat från potatisknölar, allmän morfologi som visas i figur 1. Forskare vill säkerställa hög kvalitet protoplasts har producerats före tillsats av FCP, särskilt i händelse av att felsökning krävs. Majoriteten av protoplasts bör vara sfäriskt med minimal utskjutande delar (figur 2) och kan variera kraftigt i storlek, som kanske är reflekterande av skillnader i EI.
Figur 2: representativa blad och tuber protoplasts förvärvade steg 4,4 av protokollet. Isolerade protoplasts bör sfäriska och symmetrisk med plasmamembranet intakt. Observera storleken skillnaden mellan blad (A-C) samt tuber (D, E) protoplasts och skillnaderna i storlek i en vävnad som kan tyda på olika nivåer av endoreduplikation. Blad protoplasts innehåller kloroplaster medan amyloplasts är synliga inom de tuber protoplasts. Skala barer = 1000 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Utvärdering av flöde flödescytometri resultat
Framgång eller misslyckande av ett experiment kan mätas från bredden på toppar och deras separation i flödet flödescytometri histogram. Eftersom mätning endoreduplikation kräver beräkning av relativa överflöd av atomkärnor i varje topp, är blotta närvaro eller frånvaro av topparna otillräcklig om det finns för mycket brus att dra meningsfulla gränser mellan dem. Figur 3 visar variationen i resultat som forskare kan uppstå både i flödet flödescytometri spridningsdiagram och histogram. Möjliga orsaker till misslyckad prover presenteras i diskussionen.
Figur 3: representativa resultat erhållits från flödescytometri av protoplast kärnor av intakt och försämrad märg prover. Intakt atomkärnor (A) visar ren separation mellan topparna att kvantifiera relativa överflöd av celler i varje med lämplig programvara medan toppar i försämrade prover (B) visar skiftat, bred och överlappande baser. I scatterplots intakt (C) och försämrade (D) prover ange svarta lådor nuclear event gating för histogram och klustring av händelser återspeglas i bredd på histogrammet topparna. Händelser utanför grindarna visar skräp, allvarligt skadade kärnor eller andra aggregat. PI-H motsvarar fluorescensintensitet som mäts i godtyckliga enheter. Metoder att förhindra prov nedbrytning diskuteras i texten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Endoreduplikation skillnader mellan vävnader
Tidigare rapporterade vi att märg knölvävnad har signifikant högre nivåer av endoreduplikation än cortex vävnad16. Att bekräfta och expandera på detta vi tittade på endoreduplikation nivåer i tre olika vävnader i cv. Superior: märg, perimedullary parenkymet och cortex, replikeras i tre exemplar med 2.000 gated händelser per prov. Våra resultat bekräftade vår tidigare observation att märg vävnad har betydligt större EI än kortikal vävnad med 1.79 och 1.12 endocycles per cell, respektive (p = 0,018; Students t-test). Något överraskande, parenkymet vävnad visade en profil som liknar cortex och var också signifikant från märg vävnad (menar = 1,14; p = 0,013; Students t-test). Dessa resultat sammanfattas i figur 4.
Figur 4: endoreduplikation i tre vävnader i cv. Superior. Histogrammen för blad (A), tuber cortex (B), parenkymet (C) och märg (D) vävnader visas tillsammans med det EI-värde som beräknats från de histogram. Skillnaderna i relativa överflöd av kärnor bestående av varje topp är uppenbart, särskilt mellan blad och tuber vävnader. C-värden för varje topp visas också. PI-H motsvarar fluorescensintensitet som mäts i godtyckliga enheter. Menar jämförelser av EI av tuber vävnader visas i E där asterisken indikerar signifikant skillnad (p < 0,05) och felstaplar visar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Påverkan av tuber storlek och ploiditeten
Vi har tidigare rapporterat att för en given genotyp, knölar av olika storlek men liknande löptid inte framvisade motsvarande skillnad i EI16. Vi syftar till att bekräfta detta resultat samt att utvärdera förhållandet mellan ploiditeten och endoreduplikation. För detta experiment, använde vi tre replikat av parenkymet vävnad från tre olika genotyper: cv. Superior (4 x), VT_SUP_19 (2 x) som är en dihaploid ur cv. Superior med tagg pollinering17, VT_SUP_19 4 x som är en fördubblad dihaploid 18 syngena till VT_SUP_19. Vi ingår en uppsättning replikat för stora (90 – 130 g) och små (< 35 g) knölar för cv. Superior medan knölar för de andra två genotyperna var 90-130 g. Knölarna var alla toppar växterna skördas från växthuset odlas växter vid full mognad, dvs och hade senesced. Vi observerade en signifikant skillnad mellan VT_SUP_19 och dess stamfader Superior (p = 0,04); Det var dock ingen signifikant skillnad mellan VT_SUP_19 och VT_SUP_19 4 x (p = 0,69). Detta indikerar att medan det finns en sannolik genetisk komponent till endoreduplikation, som omaskerade av genomisk minskning, det inte är dikteras av ploiditeten, åtminstone i den här bakgrunden. Slutligen, vi återigen observerades inga signifikanta skillnader mellan stora och små cv. överlägsen knölar som visas i figur 5.
Figur 5: endoreduplikation i två storlekar av rotknölar av cv. Superior diploida (VT_Sup_19) och dess gräsart (VT_Sup_19 4 x) derivat. Stapeldiagrammet visar medelvärdet för små (< 35 g) och stor (90 – 130 g) cv. överlägsen knölar samt stora (90 – 130 g) knölar av dihaploid VT_SUP_19 och den syngena fördubblad dihaploid VT_SUP_19 4 x. Signifikanta skillnader (p < 0,05) indikeras av rapporten brevet anslutande. Felstaplar visar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det protokoll som presenteras häri ger forskare möjlighet att bedöma endoreduplikation inom potatisknölar, vars modifierade mobilnät innehåll och ökad cell storlek till synes utesluter andra flöde flödescytometri preparat. Protokollet bygger på protoplast generation som ett sätt att minska buller och skräp samtidigt som nukleära integritet. Tidigare har forskare beskrivit liknande preparat för särskilt motsträviga flöde flödescytometri prover samt utnyttjade tuber protoplasts för att studera olika ämnen såsom patogenes19,20. Dock till vår kunskap, har ingen kombinerat användningen av sådana tuber protoplasts med flödescytometri för att studera endoreduplikation. Vi fann dessutom användningen av protoplasts att vara mer tillförlitliga än typiska råolja preparat samt tekniken utnyttjas i två endast andra studier för att bedöma tuber endoreduplikation6,7. Här diskuterar vi bristerna i det protokollet, potentiella fallgropar i sitt utförande och prov förberedelse, och resultatet av en typisk experiment som sysselsätter det.
Trots de verktyg och repeterbarhet av protokollet tuber flöde flödescytometri har den några svagheter som bör diskuteras. Till att börja med är protokollet dags intensiva, som kräver två natten inkubationer. Protokollet kräver dessutom vissa dyra reagenser, särskilt cellulase och macerozyme. Förberedelserna är dessutom mycket tidskänsliga, förnedrande inom några timmar, vilket kan begränsa genomströmning inom en enda dag, särskilt om många händelser önskas. Slutligen, protokollet, medan tillförlitliga, är känslig för fel inom provberedning som verkar leda till skador på kärnor och lägre kvalitetsresultat. Till exempel kan mikrobiell kontaminering inträffa under plasmolysis och protoplast generation stegen (1-3,4) på grund av felaktig aseptisk teknik. Prov kontaminering, medan inte alltid utgör hinder för framgång för ett prov, verkar dramatiskt minska kvalitet av erhållna histogram, igen sannolikt på grund av skada till kärnor.
Som tidigare nämnts är de stora nackdelarna med protokollet kostnader, tid och känslighet för fel. Forskare vill vidta åtgärder för att mildra dessa. Vad gäller kostnad, forskare som avser att tillämpa protokollet till många prover kan överväga att ändra de enzym koncentrationer eller varaktigheten av steget matsmältningen som olika vävnader och genotyper kan variera i lyhördhet. Detta inbegriper möjligheten att filtrering och återvinning ES som visats tidigare men inte sysselsatt här21. När det gäller tid, i vår observation, är det möjligt att undvara den första inkuberingen (plasmolysis steget) och fortfarande extrahera protoplasts; men deras integritet och överflöd kommer att lida, vilket inverkar negativt resultat. För att minska försämringen av prover kan forskare anser att vissa flöde flödescytometri metoder innebär användning av fixativ (t.ex. formaldehyd) att bevara provet integritet22. Detta kan vara ett användbart sätt att både förebygga försämring och möjliggöra prov förvaring snarare än protoplast exaction och flöde flödescytometri som förekommer på samma dag som presenteras. Ett annat sätt att förebygga bortfall av atomkärnor kan vara att inkludera en nuclease hämmare av ES eller FBC; medan 2-merkaptoetanol sker inga märkbara förändringar under utveckling, har andra-hämmare inte testats i häri.
I vår observation är det mest kritiska steget steg 4.4, avlägsnande av alla plasmolysis tvättlösningen före tillsats av flöde flödescytometri bufferten (FCB). Om även en liten volym (< 10 µL) återstår proven är mycket mer sannolikt att försämras vilket kan leda till en dålig eller ens misslyckade prov. Detta beror sannolikt på orenheter inom enzym lösningen (e.g. nukleaser, proteaser)23,24 som snabbt försämra atomkärnor under inkubation perioder och tiden mellan provet körs, även vid låga koncentrationer. Ett annat viktigt övervägande är varaktigheten av de PI och RNase inkubationsstegen. Som noterades i protokollet, förblir proverna inte stabil i mer än ett par timmar efter tillägg av FCB så forskare besluta att minska varaktigheten av dessa steg för att rymma fler prover eller långa flödescytometri körs som härrör från låga kärnor koncentrationer. Detta kräver också forskaren att överväga avvägningen mellan antalet händelser per prov och totala antalet prover att köras eller överväga att använda fixativ som tidigare nämnts.
Skillnader mellan vävnader och genotyper
För att ge resultat representant i protokollet utformat vi två enkla experiment för att bekräfta tidigare rapporterade variation genom vävnad och undersöka påverkan av ploiditeten och genotyp. Resultaten av vävnad experimentet visar att protokollet ger reproducerbara resultat, märg vävnad konstaterades återigen har den högsta EI. Något överraskande parenkymet vävnad, som inte hade tidigare utvärderats, hade ett EI värde liknar kortikal vävnad och betydligt lägre än märg. Detta var oförutsedda som parenkymet celler är vanligtvis större än antingen märg eller kortikal celler, åtminstone på förfallodagen. En möjlig förklaring är att knölarna (90 – 130 g) var alltför omogna för parenkymet cellerna, som utgör majoriteten av tuber volym på förfallodagen, till fullo har expanderat och nådde sin högsta C-värden25. Detta kan också förklara varför dihaploid (VT_SUP_19) och den dubblerade dihaploid (VT_SUP_19 4 x) visade signifikant större EI än cv. överlägsen rotknölar. medan knölar av ungefär samma storlek var urvalet från varje genotyp, är den maximala storleken på knölar från antingen VT_SUP_19 eller den syngena gräsart mycket mindre än fadern. Det kan således vara att de visas större EI helt enkelt eftersom de var större i förhållande till deras högsta uppnåeliga storlek. Alternativt kan skillnaden vara en följd av den genetiska komplement VT_SUP_19 fick från dess gräsart stamceller. En annan möjlighet är att den genomiska sänkning som inträffade på utvinning av dihaploid från gräsart kan ha unmasked skadliga alleler som resulterar i hela anläggningen stress, vilket också har visat sig bidra till förhöjda EI26. Detta visar dock noggrant övervägande forskarna måste anställa när du väljer knölar och vävnader som ska användas för jämförelse av EI värden, särskilt mellan genotyper.
Framtida tillämpningar
Protokollet beskrivs i denna artikel ger forskare med ett viktigt verktyg för förståelse endoreduplikation i potato. Det kan möjliggöra studier i de genetiska och miljömässiga komponenterna av endoreduplikation, tid-kursen utveckling över knölen vävnader och bedömning av naturlig variation. Endoreduplikationen kan i slutändan göra en lovande måltavla för potatis förbättring, ett företag som kommer att kräva en tillförlitliga metoder för utvärdering.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av National Science Foundation Award nummer 1237969, ”nysta upp den heterozygositet, alleliska sammansättning och kopia nummer variant av potatis” och USDA särskilda bidrag 2014-34141-22266 (University of Maine) till RV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
- Wilson, E. The karyoplasmic ratio. 727, 3rd edn, The Macmillan Company. (1925).
- Szymanski, D. B., Marks, M. D. GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).
- Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).
- Grafi, G., Larkins, B. A. Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases. Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).
- Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication. Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2. Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth. Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).
- Cheniclet, C., et al. Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth. Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).
- Pirrello, J., et al. How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches. Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).
- Chevalier, C., et al. Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory. J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).
- Galbraith, D. W., et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).
- Doležel, J., Greilhuber, J., Suda, J. Flow Cytometry with Plants: An Overview. Flow Cytometry with Plant Cells. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 41-65 (2007).
- Doležel, J., Bartoš, J. A. N. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).
- Doke, N., Tomiyama, K. Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues. Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).
- Davis, D. A., Currier, W. W. The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts. Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).
- Laimbeer, F. P. E., et al. Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops. Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).
- Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination. Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).
- Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants. Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).
- Doke, N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity. Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).
- Doke, N., Tomiyama, K. Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans. Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).
- Saxena, P. K., King, J. Reuse of enzymes for isolation of protoplasts. Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).
- Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. Cytometry and flow cytometry of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants. Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).
- Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. Tissue and cell culture. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , Springer. 39-50 (2013).
- Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement. Advances in Cell Culture. Maramorosch, K. 1, Elsevier. 241-279 (1981).
- Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions. Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).
- Scholes, D. R., Paige, K. N. Plasticity in ploidy: a generalized response to stress. Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).
