交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。
Summary
これ以降のプロテオーム解析の架橋クロマチンのシーケンス固有のキャプチャに依存する特定のターゲット遺伝子の新規 DNA と相互作用する蛋白質を識別する方法です。潜在的な結合蛋白質、またセル変更についての事前知識も必要ありません。技術は、当初は酵母の開発、哺乳類細胞に対して適応を今されています。
Abstract
プロテオミクス (HyCCAPP) の技術のクロマチン蛋白の交配のキャプチャは、酵母の新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにするために開発されました。対象地域にバインドされている可能性が高いタンパク質についての事前知識を必要とせず興味のターゲット領域の解析をことができます。これは、理論では、関心の任意のゲノム領域を分析に使用する HyCCAPP ができ、異なる電池で動作するように十分な柔軟性を提供します。このメソッドは、クロマチン免疫沈降 (チップ) とチップのようなメソッドに適しているタスク、知られている転写因子の結合部位を研究するためのものではありません。HyCCAPP の強みは、その能力のある限られた DNA 領域を探索するのにバインドされて蛋白質についての知識。それは、抗体を用いたタンパク質ベース クロマチンの濃縮によって導入されたバイアス (チップのようなメソッドに存在) を避けるために便利な方法ことができます。潜在的に、HyCCAPP は本当に新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにする強力なツールをすることができます。これまでで、酵母、哺乳類細胞の系列を繰り返す高コピー技術は主に適用されています。我々 が思い描く強力なツールになる、HyCCAPP アプローチ哺乳類細胞における単一コピーの遺伝子座を効率的にキャプチャするように最適化する必要があります。HyCCAPP はひと細胞ラインにプロトコルをキャプチャし、シングル コピー クロマチン領域はこの修正されたプロトコルを効率的に分離することができますを表示最初の酵母の我々 の適応を紹介します。
Introduction
過去 10 年間に、シーケンス技術、大量のサンプルと驚異的な解像度にゲノムの広い範囲の研究の劇的な改善を見ています。百科事典の DNA 要素 (エンコード) コンソーシアムは、大規模な多施設共同努力、国立ヒトゲノム研究所国立衛生研究の主導がどのように個々 の転写因子に洞察力を提供しています。その他の規制の蛋白質にバインドし、ゲノムとの対話します。初期の努力は、100 以上知られている DNA 結合蛋白質1のクロマチン免疫沈降 (チップ) により評価した特定の DNA 蛋白質の相互作用を特徴付けられます。DNase フット プリント2ホルムアルデヒド規制要素 (放任)3のアシストの分離は、タンパク質ではなく、明白な制限を操作するゲノムの特定の領域を検索する使用されているなどの代替方法をこれらの実験的アプローチは、相互作用の蛋白質を識別しません。過去年にわたって広範な努力にもかかわらず技術浮上しているない、クロマチンと同定蛋白質 DNA 相互作用の包括的な評価とクロマチン関連タンパク質の定量が効率的にできます。
この必要性に対処するため、我々 は Hybridization Capture of Chromatin-Associated タンパク質のプロテオミクス (HyCCAPP) と呼ばれる手法を開発しました。5,6、アプローチ酵母4,開発当初シーケンス固有の交配のキャプチャを使用して (バインドされたタンパク質) と利子の架橋クロマチン領域を分離します。タンパク質-DNA 複合体の分離後、興味のシーケンスにバインドされている蛋白質のセットを特徴付ける質量分析法などの方法を使用できます。したがって、その抗体に依存しない意味での新規 DNA 蛋白質の相互作用を明らかにする非バイアス アプローチは見つけられるかもしれない蛋白質について完全に依存しないものとしては、HyCCAPP を検討できます。明らかに小説 DNA と相互作用するタンパク質の7、しかし、最もチップのようなメソッド8,9,10, プラスミッド挿入11,12に依存することができる他の方法があります。 13,14、または高いコピー番号15の地域。対照的に、HyCCAPP はマルチとシングル コピー領域に適用できる、地域の蛋白質についての事前情報は必要ありません。さらに、上記が貴重な機能、特に DNA とタンパク質の架橋反応、HyCCAPP の独特の機能はシングル コピー領域に適用できることの必要性を回避変更セル、前述のメソッドのいくつかとせず推定結合蛋白質、または入手可能な抗体に関する知識。
この時点で、HyCCAPP 酵母4,5,6、様々 なゲノム領域の解析に主に適用されている、アルファ衛星 DNA、リピート領域の蛋白質 DNA 相互作用の分析に使用された最近人間のゲノムの16。私たちの継続的な作業の一環として、我々 は酵母クロマチンひと細胞の分析を適用する、シングル コピー対象を選択的に捕獲を可能にする変更されたプロトコルを紹介するために開発の交配キャプチャ方法を適応しています。酵母における私たちの初期の研究に類似した効率と人間のゲノムにある地域。この新しい最適化されたプロトコルは今、適応および質量分析などの分析手法を用いたヒトゲノム全体蛋白質 DNA の相互作用を調査するテクノロジーの活用をことができます。
HyCCAPP メソッドの特定のターゲット領域の解析のためのものはまだゲノム解析に最適ではないことを強調することが重要です。技術は、相互作用の蛋白質の不足について地域を扱うとき、または特定ゲノム遺伝子座での相互作用の蛋白質のより包括的な詳細な解析が必要な場合に便利です。HyCCAPP は、明らかに DNA 結合蛋白質が genomic DNA の特定の蛋白質の結合サイトを正確に特徴づけるものです。現在の実装では、方法論は DNA 結合シーケンスまたは個々 の蛋白質のためのモチーフに関する情報を行いません。したがって、素敵なフェアなどの既存技術を補完する、初期の FAIRE 分析によって識別されるゲノム領域の新規結合蛋白質の同定ができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明した HyCCAPP メソッドには、とらえどころのないまま、ある DNA 相互作用を明らかにする強力なアプローチは、多くのユニークな機能があります。プロセスの性質は、HyCCAPP に異なった有機体とゲノムの領域で動作する柔軟性を与えます。メソッドは、しかし、いくつかの制限があると見なす。
HyCCAPP は、適用される初代培養細胞、細胞培養システム、またはも?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH の助成金 P50HG004952 とミズーリ州に R01GM109099 によって支持されました。
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
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